Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоформула, СОЭ

Исследуемый материал Смотрите в описании

Метод определения См. в описании

Кровь — это жидкая ткань, выполняющая различные функции, в том числе, транспорта кислорода и питательных веществ к органам и тканям и выведения из них шлаковых продуктов. Состоит из плазмы и форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

Общий анализ крови в лаборатории ИНВИТРО включает в себя определение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, величины гематокрита и эритроцитарных индексов (MCV, RDW, MCH, MCHC). Общий анализ — см. тест № 5KZ, Лейкоцитарная формула — см. тест № 119, СОЭ — см. тест № 139.

Лейкоцитарная формула — это процентное соотношение различных видов лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы).

Лейкоцитарная формула в Независимой лаборатории ИНВИТРО включает в себя определение (в %) нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, моноцитов. Общий анализ — см. тест № 5KZ, Лейкоцитарная формула — см. тест № 119, СОЭ — см. тест № 139.

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) — неспецифический показатель воспаления.

СОЭ — показатель скорости разделения крови в пробирке с добавленным антикоагулянтом на 2 слоя: верхний (прозрачная плазма) и нижний (осевшие эритроциты). Скорость оседания эритроцитов оценивается по высоте образовавшегося слоя плазмы (в мм) за 1 час. Удельная масса эритроцитов выше, чем удельная масса плазмы, поэтому в пробирке при наличии антикоагулянта (цитрата натрия) под действием силы тяжести эритроциты оседают на дно.

Процесс оседания (седиментации) эритроцитов можно разделить на 3 фазы, которые происходят с разной скоростью. Сначала эритроциты медленно оседают отдельными клетками. Затем они образуют агрегаты — «монетные столбики», и оседание происходит быстрее. В третьей фазе образуется очень много агрегатов эритроцитов, их оседание сначала замедляется, а потом постепенно прекращается.

Показатель СОЭ меняется в зависимости от множества физиологических и патологических факторов. Значения СОЭ у женщин несколько выше, чем у мужчин. Изменения белкового состава крови при беременности ведут к повышению СОЭ в этот период.

Снижение содержания эритроцитов (анемия) в крови приводит к ускорению СОЭ и, напротив, повышение содержания эритроцитов в крови замедляет скорость седиментации. В течение дня возможно колебание значений, максимальный уровень отмечается в дневное время. Основным фактором, влияющим на образование «монетных столбиков» при оседании эритроцитов является белковый состав плазмы крови. Острофазные белки, адсорбируясь на поверхности эритроцитов, снижают их заряд и отталкивание друг от друга, способствуют образованию «монетных столбиков» и ускоренному оседанию эритроцитов.

Повышение белков острой фазы, например, С-реактивного белка, гаптоглобина, альфа-1-антитрипсина, при остром воспалении приводит к повышению СОЭ. При острых воспалительных и инфекционных процессах изменение скорости оседания эритроцитов отмечается через 24 часа после повышения температуры и увеличения числа лейкоцитов. При хроническом воспалении повышение СОЭ обусловлено увеличением концентрации фибриногена и иммуноглобулинов.

Определение СОЭ в динамике, в комплексе с другими тестами, используют в контроле эффективности лечения воспалительных и инфекционных заболеваний. Общий анализ — см. тест № 5KZ, Лейкоцитарная формула — см. тест № 119, СОЭ — см. тест № 139.

Биоматериал – 2 пробирки:

Обращаем внимание, что при выполнении клинического анализа крови (№1515КЗХ) и подсчете лейкоцитарной формулы (№119), если в пробах выявлены значимые отклонения и результат требует проведения ручной микроскопии, ИНВИТРО дополнительно бесплатно проводит ручной подсчет лейкоцитарной формулы с подсчетом молодых форм нейтрофилов (в том числе точным подсчетом палочкоядерных нейтрофилов) и количественной оценкой всех патологических форм лейкоцитов (при их наличии).

Анализ крови | Клиника Здоровья

___

Заболевания организма непременно отражаются на состоянии крови. Изменяется ее состав и клинические показатели. Поэтому исследование крови является наиболее полномерным и объективным способом диагностики здоровья человека, а также наблюдения за результатами терапии при лечении практически всех заболеваний.

Виды и характеристика анализов крови

Основными анализами крови являются: Общий анализ крови Биохимический анализ Определение группы крови и резус-фактора Определение уровня глюкозы Количественный и качественный состав крови выявляют с помощью клинического (общего) анализа крови. Это один из самых распространенных методов в медицине. Общий анализ крови (гемограмма) проводится путем получения капиллярной крови из безымянного пальца руки.

___

Количественный и качественный состав крови выявляют с помощью клинического (общего) анализа крови.  
Это один из самых распространенных методов в медицине. 
Общий анализ крови (гемограмма) проводится путем получения капиллярной крови из безымянного пальца руки.

Комплексный анализ крови поможет установить:

• Число эритроцитов. Эти клетки переносят кислород и окись углерода и участвуют в транспорте питательных веществ. Любое изменение в количестве эритроцитов может предполагать обезвоживание организма, и ряд заболеваний (анемий, пневмоний, опухоли почек, желез внутренней секреции, заболеваний легких и сердца).
• Количество гемоглобина в эритроцитах (МСН). Его понижение встречается при дефиците железа, а увеличение – при недостатке витамина В12 и В9.
• Величина тромбоцитов, которые гарантируют свертывание крови.
• Число лейкоцитов, высокий уровень которых подразумевает бактериальную инфекцию.
• Наличие лимфоцитов, ответственных за иммунитет и устойчивость перед вирусами. Увеличение их числа свидетельствует об инфекционных болезнях (грипп, краснуха, вирусный гепатит и др.), а уменьшение – о тяжелых хронических болезнях, СПИДе, почечной недостаточности.
• Количество гранулоцитов, которое может быть повышено при воспалительных процессах организма.
• Количество моноцитов. Слишком большое количество моноцитов симптоматично для инфекционных заболеваний (туберкулез, сифилис), а снижение их уровня содержания в крови – после тяжелых операций и приема некоторых видов лекарств.
• Скорость оседания эритроцитов – показатель содержания белков. СОЭ повышается при наличии воспалений, а также анемий, злокачественных опухолей.

Биохимический анализ крови

___

Для определения химических составных крови используют венозную кровь. Биохимический анализ позволяет определить величину глюкозы,  белков, аминокислот, сахара, холестерина, солей и витаминов. Эти данные говорят о качестве работы внутренних органов (печени, поджелудочной железы, почек),а также помогают диагностировать болезни сердечно-сосудистой системы и онкозаболевания

Анализ для определения группы крови

В некоторых ситуациях (для переливания), а также беременности (чтобы избежать резус-конфликта), требуется знание группы крови пациента. Определение группы крови и осуществляется с помощью забора крови из вены.  Присутствие специфических групп углеводов определяют группу, а отсутствие специального типа белка – резус-фактор.

В нашей клинике анализ на RW вы получите на руки через полчаса, после сдачи крови. Мы предлагаем современную методику экспресс анализа крови на группу

Анализ крови на определение уровня сахара

Глюкоза свидетельствует о состоянии обмена веществ человека. Повышенный уровень сахара в крови свидетельствует о наличии сахарного диабета. Данный анализ помогает вовремя диагностировать болезнь, а также наблюдать ее течение. В нашей клинике результат исследования крови на сахар вы получите на руки через 15 минут, после сдачи крови. Мы предлагаем современную методику экспресс анализа крови на сахар

___

Рекомендации перед сдачей анализов крови

• Кровь сдается натощак (минимум через 12 часов после приема пищи), следует избегать жирной еды.
• Воздерживаться от алкоголя, физических нагрузок и избегать высоких температур (отказаться от посещения бань и приема горячей ванны).

ЦЕНЫ НА АНАЛИЗ КРОВИ

Наименование услуги	Цена в рублях
Экспресс анализ RW	500
Экспресс анализ ВИЧ	500
Экспресс анализ Гепатит В	500
Экспресс анализ Гепатит С	500
Экспресс анализ глюкоза	500
Экспресс анализ холестерин	500
Экспресс диагностика триглицериды	500

Если Вы не нашли услугу в прейскуранте, пожалуйста, позвоните нам по телефонам  +7 (495) 961-27-67  и  
+7 (495) 951-39-09, Вам сообщат необходимую информацию.

*Не является публичной офертой. Стоимость уточняйте у администратора.

Полностью автоматический анализатор определения СОЭ венозной и капиллярной крови — Roller 20PN | Медицинское оборудование

Анна Зайцева

Специалист по продукту Alifax

Задать вопрос менеджеру

8(495)748-43-50/51 доб.1402

Артикул: SI R20-PN

Производитель: Alifax

Анализаторы СОЭ Alifax – единственные на рынке, обеспечивающие получение результата в течение 20 секунд благодаря измерению скорости агрегации эритроцитов, что позволяет преодолеть ограничения и зависимость от переменных факторов методов определения СОЭ, основанных на явлении оседания, также упоминаются в документе CLSI*

ПРЕИМУЩЕСТВА

— Результат за первые 20 секунд агрегации эритроцитов

— Первый результат через 5 минут от начала анализа

— Не требует реагентов

— Результаты в мм/ч шкалы Вестергрена

— Высокая корреляция с референсным методом Вестергрена

— Отсутствие влияния низкого гематокрита на результат

— 100 мкл капиллярной крови с ЭДТА на исследование при ручной подаче и 175 мкл венозной крови с ЭДТА на исследование при автоматической подаче

— Общий объем крови в пробирке (с учетом мертвого объема): 200 мкл капиллярной и 800 мкл венозной

— Общий объем крови в пробирки (с учетом мертвого объема) 800 мкл

— Работа со стандартными вакуумными и педиатрическими пробирками для общего анализа крови

— Латексные контроли и калибраторы

— Единственный расходный материал – смарт-карты с тест-единицами

— Измерение при фиксированной температуре 37°C

— Автоматическое перемешивание образца в соответствии с требованиями CLSI*

— Сенсорный экран

— Дружественный пользователю интерфейс, русскоязычное ПО

— Совместимость с ЛИС

— Простая процедура замены иглы

— Встроенный термопринтер

— Автоматическая промывка

 

CLSI H02-A5 Процедура определения СОЭ, Одобренный стандарт 5-е издание Том 31 № 11

Технические характеристики

 

Принцип работы	Микрофотометрический капиллярный анализ по принципу «остановленной струи»; измерение кинетики агрегации эритроцитов на начальном участке сигмоидной кривой седиментации с последующей математической обработкой, позволяющей преобразовать полученный результат в общепринятые единицы СОЭ
Длина волны регистрации сигнала	620 нм
Параметры регистрации сигнала	1000 считываний, 20 секунд, 37°С
Тип используемой пробы	Венозная кровь с ЭДТА Капиллярная кровь (при заборе пробы внешней иглой)
Рабочий объем пробы	175 мкл (первые две пробы по 225 мкл), при заборе пробы внешней иглой — 100 мкл (первая проба 150 мкл)
Вместимость	20 проб
Производительность	75проб/час
Время до первого результата	5 мин
Ед/измерения	мм/ч (корреляция с методом Вестергрена)
Электрические параметры	85-264 В, 47-63 Гц (Саморегулировка выбора напряжения )
Потребление энергии	66 Вт (при включении 132 Вт)
Размеры	24 х 38 х 45 см
Вес	16 кг
Требования к окружающей среде	Температура 10-30°С, Влажность 15-85% (без конденсата)
Расходные материалы	Термобумага, смарт-карты с тест-единицами, латексные контроли
Возможность подключения к компьютеру	Через последовательный порт RS232
Возможность подключения к ЛИС	Да
Возможность использования пробирок со штрих-кодом	Да (дополнительно нужен внешний сканер штрих-кодов).

хлорид калия и хлорид натрия

Какая самая важная информация, которую я должен знать о хлориде калия и хлориде натрия?

Следуйте всем указаниям на этикетке и упаковке продукта. Расскажите каждому из своих лечащих врачей обо всех своих заболеваниях, аллергиях и обо всех лекарствах, которые вы принимаете.

Что такое хлорид калия и хлорид натрия?

Калий — это минерал, который содержится во многих продуктах питания и необходим для некоторых функций вашего тела, особенно для работы вашего сердца.

Хлорид натрия — это химическое название соли. Натрий — это электролит, регулирующий количество воды в организме. Натрий также участвует в нервных импульсах и мышечных сокращениях.

Хлорид калия и хлорид натрия — это комбинированная минеральная добавка, которая может помочь уменьшить усталость, мышечные спазмы или тепловую прострацию, которая может возникнуть, когда вы потеете больше обычного. Этот продукт часто используется для активного отдыха на открытом воздухе при высокой температуре или в помещении, где высокие температуры могут вызвать перегрев.

Неизвестно, эффективны ли хлорид калия и хлорид натрия при лечении какого-либо заболевания. Лекарственное использование этого продукта не было одобрено FDA. Хлорид калия и хлорид натрия не следует использовать вместо лекарств, прописанных вам врачом.

Хлорид калия и хлорид натрия также могут использоваться для целей, не указанных в данном руководстве по продукту.

Что мне следует обсудить со своим лечащим врачом перед приемом хлорида калия и хлорида натрия?

Не используйте этот продукт без консультации врача, если:

• у вас заболевание почек; или
• Вы соблюдаете диету с низким содержанием соли.

Спросите врача, фармацевта или другого поставщика медицинских услуг, безопасно ли для вас использовать этот продукт, если у вас есть:

• высокое кровяное давление;
• порок сердца; или
• Язва или другая проблема в желудке или пищеводе.

Неизвестно, вредит ли хлорид калия и хлорид натрия нерожденному ребенку. Не используйте этот продукт без консультации врача, если вы беременны. Ваши потребности в дозе могут отличаться во время беременности.

Неизвестно, проникают ли хлорид калия и хлорид натрия в грудное молоко или могут нанести вред кормящемуся ребенку. Не используйте этот продукт без консультации врача, если вы кормите ребенка грудью.

Не давайте ребенку какие-либо травяные / лечебные добавки без консультации с врачом.

Как мне принимать хлорид калия и хлорид натрия?

Используйте точно так, как указано на этикетке, или в соответствии с предписаниями врача.Не используйте в больших или меньших количествах или дольше, чем рекомендуется.

Обычная доза хлорида калия и хлорида натрия составляет 1 таблетку от 5 до 10 раз в день.

Запейте этот продукт полным стаканом воды.

Возможно, вам придется скорректировать дозу в зависимости от количества тепла, которому вы подвергаетесь.

Позвоните своему врачу, если состояние, которое вы лечите с помощью хлорида калия и хлорида натрия, не улучшается или ухудшается при использовании этого продукта.

Хранить при комнатной температуре вдали от влаги и тепла.

Что произойдет, если я пропущу дозу?

Пропустите пропущенную дозу, если пришло время для следующей запланированной дозы. Не используйте дополнительно хлорид калия и хлорид натрия для восполнения пропущенной дозы.

Что произойдет, если я передозирую?

Обратитесь за неотложной медицинской помощью или позвоните в справочную службу Poison по телефону 1-800-222-1222.

Чего следует избегать при приеме хлорида калия и хлорида натрия?

Следуйте инструкциям вашего поставщика медицинских услуг относительно любых ограничений на еду, напитки или деятельность.

Каковы возможные побочные эффекты хлорида калия и хлорида натрия?

Получите неотложную медицинскую помощь при наличии признаков аллергической реакции: крапивница; затрудненное дыхание; отек лица, губ, языка или горла.

Немедленно позвоните своему врачу, если у вас есть:

• симптомы обезвоживания — горячая и сухая кожа, чувство сильной жажды или жара, спутанность сознания, невозможность мочиться; или
• Высокий уровень калия в крови (гиперкалиемия) — тошнота, медленное или необычное сердцебиение, мышечная слабость, потеря подвижности.

Хотя не все побочные эффекты известны, хлорид калия и хлорид натрия, вероятно, безопасны для большинства людей при использовании по назначению.

Это не полный список побочных эффектов, которые могут возникнуть. Спросите у своего доктора о побочных эффектах. Вы можете сообщить о побочных эффектах в FDA по телефону 1-800-FDA-1088.

Какие другие препараты будут влиять на хлорид калия и хлорид натрия?

Не принимайте хлорид калия и хлорид натрия без консультации с врачом, если вы принимаете какие-либо из следующих лекарств:

• лекарства для сердца или артериального давления; или
• Лекарство от простуды или аллергии, содержащее антигистаминные препараты (Бенадрил и другие).

Этот список не полный. Другие препараты могут взаимодействовать с хлоридом калия и хлоридом натрия, включая лекарства, отпускаемые по рецепту и без рецепта, витамины и растительные продукты. В этом руководстве по лекарствам перечислены не все возможные взаимодействия.

Где я могу получить дополнительную информацию?

Ваш фармацевт может предоставить дополнительную информацию о хлориде калия и хлориде натрия.

Помните, храните это и все другие лекарства в недоступном для детей месте, никогда не передавайте свои лекарства другим и используйте это лекарство только по назначению.

Были предприняты все усилия для обеспечения точности, актуальности и полноты информации, предоставленной Cerner Multum, Inc. («Multum»), но никаких гарантий на этот счет не дается. Содержащаяся здесь информация о препарате может меняться с течением времени. Информация Multum была собрана для использования практикующими врачами и потребителями в Соединенных Штатах, и поэтому Multum не гарантирует, что использование за пределами США является целесообразным, если специально не указано иное.Информация о лекарственных препаратах Multum не содержит рекомендаций по лекарствам, диагностике пациентов и лечению. Информация о лекарственных препаратах Multum — это информационный ресурс, предназначенный для оказания помощи лицензированным практикующим врачам в уходе за своими пациентами и / или обслуживании потребителей, рассматривающих эту услугу как дополнение к опыту, навыкам, знаниям и суждениям практикующих врачей, а не их замену. Отсутствие предупреждения для данного лекарственного средства или комбинации лекарств никоим образом не должно толковаться как указание на то, что лекарство или комбинация лекарств безопасны, эффективны или подходят для любого данного пациента.Multum не несет никакой ответственности за какие-либо аспекты здравоохранения, управляемые с помощью информации, предоставляемой Multum. Информация, содержащаяся в данном документе, не предназначена для охвата всех возможных способов использования, указаний, мер предосторожности, предупреждений, лекарственных взаимодействий, аллергических реакций или побочных эффектов. Если у вас есть вопросы о лекарствах, которые вы принимаете, проконсультируйтесь с врачом, медсестрой или фармацевтом.

Copyright 1996-2021 Cerner Multum, Inc. Версия: 1.01. Дата редакции: 07.04.2016.

Мнение | Чтобы подавить коронавирус, тестируйте тех, у кого нет симптомов

Почти единственные люди, которые проходят тестирование на коронавирус, — это те, у кого есть симптомы Covid-19, подход, одобренный Центрами по контролю и профилактике заболеваний, который предоставляет рекомендации для штатов. .

Это, вероятно, выявило лишь небольшую часть инфицированных, поставив под угрозу тысячи американцев, потому что большинство носителей вируса не знают об этом.

Что необходимо, так это широкомасштабное тестирование людей с неизвестными симптомами.

Небольшой набор анализов крови на антитела показал, что до 2,7 миллиона жителей Нью-Йорка могли быть инфицированы, даже не подозревая об этом, заявил в четверг губернатор Эндрю Куомо. Это согласуется с другими выводами. Недавнее исследование показало, что до одной трети жителей Челси, горячей точки в Массачусетсе, могли быть инфицированы, и только половина из них могла вспомнить, что у них был один симптом за последние четыре недели.Другое небольшое исследование беременных женщин из Нью-Йорка показало, что 15 процентов дали положительный результат на вирус, а у 80 процентов из них не было никаких симптомов. Из 840 случаев на авианосце «Теодор Рузвельт» 60 процентов протекали бессимптомно.

Итак, Covid-19 кажется гораздо более распространенным, чем показали наши скудные исследования, и миллионы инфицированных людей могут невинно распространять болезнь.

Нам необходимо активно искать бессимптомных носителей, особенно среди людей, которые часто контактируют с общественностью, и среди уязвимых групп населения.Сюда входят те, кто заразен, но симптомы никогда не разовьются, а также те, у кого они появятся через несколько дней после теста.

Среди бессимптомных групп высокого риска, которым необходимо срочно заняться, являются медицинские работники, особенно те, кто находится в учреждениях длительного ухода; бездомным и работающим в приютах; сотрудники продуктовых магазинов и водители доставки, водители такси, аварийные работники, сотрудники на рабочих местах с высокой плотностью посетителей, таких как склады доставки и мясоперерабатывающие заводы; и любой, кто имел тесный контакт с известным пациентом с Covid-19.Эти группы высокого риска необходимо проверять не реже одного раза в пять дней, учитывая то, что мы знаем о времени, которое требуется для развития симптомов после заражения, и инфицированные должны немедленно самоизолироваться, а их контакты должны быть помещены в карантин. 14 дней.

Обследование необходимо расширить как минимум в пять раз и сделать его максимально доступным и удобным, без направления врача и бесплатно. Сейчас около 200000 человек в день проходят тестирование на вирус по всей стране.Нам нужно, чтобы это число увеличивалось примерно до миллиона тестов в день. Тестирования будет достаточно, если менее 5 процентов тестов окажутся положительными. В Нью-Йорке по состоянию на среду было обнаружено, что 38 процентов протестированных инфицированы. Количество новых тестов также слишком мало. Луизиана, еще одна горячая точка, в прошлый четверг сообщила только о 481 новом тесте на Covid-19.

Для этого штаты должны расширить программы тестирования мобильных устройств, чтобы работники, подобные тем, что работают в продуктовых магазинах и на рабочих местах с высокой плотностью посетителей, могли проходить повторное тестирование на месте.Им также следует создать центры тестирования по месту жительства, чтобы побудить всех без проблем пройти тестирование.

Расширение масштабов тестирования потребует всплеска стратегического планирования и управления цепочкой поставок. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов недавно одобрило новые тампоны на основе полиэстера, которые можно быстро производить внутри страны, и их не нужно вводить так глубоко в нос. Он также одобрил использование стерильного физиологического раствора для транспортировки образцов для тестирования, если среда, которая обычно используется, недоступна.Недавно утвержденные платформы тестирования могут предоставить результаты за 15 минут.

Эти последние достижения должны устранить узкие места в цепочке поставок и повысить доступность тестов. Но штатам по-прежнему необходимо будет создать обширную инфраструктуру тестирования с использованием общественных центров здоровья, аптек и частных поставщиков. Результаты этого чрезвычайно расширенного тестирования необходимо будет координировать в цифровом виде, чтобы инфицированные люди могли быть подключены к более широкой системе консультирования, отслеживания контактов и служб поддержки. Массачусетс начал амбициозное сотрудничество между Министерством здравоохранения, Управлением коннектора медицинского страхования Содружества и бостонскими партнерами по здравоохранению для отслеживания всех инфицированных случаев.

Расширенное тестирование позволит штатам более агрессивно подавлять болезнь.

Люди с активной инфекцией могут получить поддержку по самоизоляции и отслеживанию контактов для выявления других групп риска, которые могут быть помещены в карантин. Чтобы помочь тем, кто не может безопасно самоизолироваться, нам нужна цепь помощи, адаптированная к американским условиям, которая включает безопасные места для самоизоляции, поддерживаемые десятками тысяч общественных работников, которые могут проводить тестирование и отслеживать контакты и облегчать эту задачу. людей на карантин.В некоторых штатах для этой цели уже были переоборудованы пустые общежития и отели университетов, но до сих пор эти усилия носили лоскутный характер.

Если мы не сможем предотвратить распространение Covid-19, экономика не сможет восстановиться. Быстрое обнаружение и изоляция всех инфицированных пациентов с уделением особого внимания большому количеству инфицированных бессимптомных людей и помещение их близких в карантин до того, как у них появится возможность заразить других, — это единственный способ контролировать пандемию до тех пор, пока не будет введена эффективная вакцина против Covid-19. находится.

Печень: проводник системного баланса железа | Кровь

В настоящее время четко установлено, что центральным сигнальным путем, участвующим в регуляции экспрессии гепсидина железом, является путь BMP-SMAD. ³⁴ Промотор гепсидина содержит ключевые BMP-чувствительные элементы, которые регулируют его транскрипцию. ³⁵ Костные морфогенетические белки (BMP) представляют собой большое подсемейство, принадлежащее к суперсемейству лигандов трансформирующего фактора роста-β (TGF-β). BMP опосредуют многие фундаментальные процессы, такие как эмбриональный морфогенез, развитие костей и восстановление тканей. ³⁶ Специфичность пути BMP-SMAD в печени и его роль в гомеостазе железа, по-видимому, зависит от комбинации двух факторов, которые в основном экспрессируются в печени: регулируемого железом лиганда BMP6 и GPI-мембранного якоря. корецептор гемодювелина (HJV) (рис. 2).

Все члены суперсемейства TGF-β, включая BMPs, обладают общими структурными особенностями и общей моделью передачи сигналов.Активная форма BMP представляет собой димерный белок с дисульфидной связью, который отщепляется от более крупного белка-предшественника и секретируется. Существенная роль BMP6 в регуляции гепсидина подчеркивается неадекватно низким уровнем гепсидина и массивной перегрузкой железом у мышей, лишенных BMP6. ^22,23 Однако стоит отметить, что существенная роль BMP6 в регуляции экспрессии гепсидина у людей еще не описана. Другие эндогенные BMP не способны компенсировать потерю BMP6 в регуляции гепсидина (по крайней мере, у мышей), несмотря на способность экзогенных BMP2, 4, 5, 7 и 9 стимулировать экспрессию гепсидина. ³⁷ После секреции BMP действуют путем связывания с 2 различными типами рецепторов: типом I и типом II. Существует 4 рецептора типа I (ALK1, ALK2, ALK3, ALK6) и 3 рецептора типа II (ACTRIIA, ACTRIIB, BMPRII) для подсемейства BMP. Для регуляции гепсидина в ответ на железо задействованные рецепторы BMP, скорее всего, представляют собой ALK3, ALK2 и ACTRIIA ³⁸ , потому что специфическая для печени делеция либо Alk3 , либо (в меньшей степени) Alk2 вызывает перегрузку железом у мышей, ³⁹ и потому, что ACTRIIA является преобладающим рецептором типа II, экспрессируемым в печени человека. ³⁸ При связывании BMP рецепторы типа II фосфорилируют рецепторы типа I, что приводит к фосфорилированию и активации специфических белков SMAD. Регулируемые рецептором SMAD, активируемые в ответ на связывание BMP с сигнальными рецепторами, представляют собой SMAD1, 5 и 8. Эти фосфорилированные SMAD, в свою очередь, связываются с SMAD4, и комплекс SMAD перемещается в ядро. В ядре комплекс SMAD связывается со специфическими промоторными элементами генов-мишеней, включая гепсидин, для регулирования их транскрипции. ³⁶ Важность пути BMP-SMAD в регуляции экспрессии гепсидина также была продемонстрирована на печеночно-специфичных мышах Smad4 ^{— / —} , которые также имеют значительную перегрузку железом, аналогичную фенотипу мышей с нокаутом гепсидина. . ²⁵

Чтобы способствовать передаче сигнала в физиологических условиях, когда уровни лиганда BMP низкие, и для генерации специфического сигнала в ответ на подмножество лигандов BMP с использованием подмножества рецепторов BMP, требуется корецептор BMP.Белки RGM представляют собой первое известное семейство высокоаффинных корецепторов, специфичных для BMP. Семейство RGM состоит из 3 членов у млекопитающих; RGMc, также известный как HJV, экспрессируется в печени и участвует в регуляции экспрессии гепсидина в ответ на железо. Этот ген был идентифицирован как ген гемохроматоза в 2004 году с помощью стратегии позиционного клонирования локуса, ассоциированного с ювенильным гемохроматозом у людей. ²⁴ Однако связь между регуляцией гепсидина железом и путем HJV / BMP-SMAD была установлена ​​двумя годами позже Babitt et al, ³⁴ , когда было продемонстрировано, что лечение клеток гепатомы BMP в сочетании с HJV сверхэкспрессия приводит к усилению экспрессии гепсидина.Интересно, что с помощью поверхностного плазмонного резонанса было продемонстрировано, что среди всех RGMs HJV имеет самое высокое сродство к BMP6. ⁴⁰ Global Hjv , нокаутные мыши и люди с мутациями HJV не имеют другого фенотипа функций BMP, не связанных с железом, ^41,42 , что позволяет предположить, что HJV играет роль, которая однозначно не является избыточной для регуляции метаболизма железа . Хотя HJV экспрессируется в других тканях, таких как сердце и мышцы, ²⁴ анализ мышей с тканеспецифическим нокаутом HJV предполагает, что экспрессия HJV преимущественно важна в гепатоцитах. ^43,44

HJV может высвобождаться из клеток как растворимый HJV (sHJV) и обнаруживаться в сыворотке нескольких видов, включая человека. ^45,46 Кроме того, было продемонстрировано, что растворимый рекомбинантный HJV обладает способностью ингибировать сигнальный путь BMP-SMAD и экспрессию гепсидина, ³⁷ , но источник и функция эндогенного sHJV все еще плохо изучены. In vitro было показано, что полноразмерный sHJV может высвобождаться в среду для культивирования клеток под действием эндогенной фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC). ⁴⁷ Фурин, про-протеин конвертаза, также может расщеплять HJV с образованием меньшего фрагмента sHJV. ^48,49 Матриптаза-2, кодируемая трансмембранной сериновой протеазой TMPRSS6, , также продемонстрировала способность расщеплять sHJV в системах сверхэкспрессии in vitro, ^50,51 , и это было предложено в качестве механизма, с помощью которого мутации в TMPRSS6 приводит к избытку гепсидина и железодефицитной анемии, резистентной к железу.

Неогенин, белок из семейства делетированных при раке толстой кишки (DCC), как было показано, способен взаимодействовать с HJV ⁵² и матриптазой-2 ⁵³ и может играть роль в метаболизме железа, поскольку гипоморфная неогенин-мышь содержит железо. скопление в печени. ⁵⁴ Неогенин был предложен в некоторых исследованиях, ⁵⁵ , но не в других, ³⁸ , чтобы влиять на секрецию HJV и передачу сигналов BMP-SMAD. Точная роль и функция неогенина в метаболизме железа еще предстоит полностью выяснить. Дополнительное подтверждение того, что путь HJV / BMP играет роль в регуляции гепсидина, исходит из работы, показывающей, что SMAD7, ингибирующий белок SMAD, который опосредует петлю отрицательной обратной связи как для передачи сигналов TGF-β, так и для BMP, служит ингибитором экспрессии гепсидина. ⁵⁶

На пути к точной медицине боли: диагностические биомаркеры и перепрофилированные препараты

Когорты

Мы использовали три независимых когорты: обнаружение (серьезные психические расстройства), валидация (серьезные психические расстройства с клинически тяжелыми болевыми расстройствами) и тестирование (независимые основные психические расстройства). когорта для прогнозирования состояния боли, а также для прогнозирования будущих посещений отделения неотложной помощи при боли) (рис. 1а).

Рис. 1

Шаги 1–3: обнаружение, приоритезация и проверка. a Когорты, использованные в исследовании, отображающие поток открытий, расстановку приоритетов и проверку биомаркеров на каждом этапе. b Когортный продольный внутрисубъектный анализ Discovery. Phchp ### — идентификатор исследования для каждого предмета. V # обозначает номер посещения. c Обнаружение возможных подтипов боли на основе посещений сильной боли в когорте исследователей. Субъекты были сгруппированы с использованием показателей настроения и тревожности (упрощенная шкала аффективного состояния (SASS)), а также психоза (PANNS Positive). d Дифференциальная экспрессия гена в когорте Discovery — количество генов, идентифицированных методами дифференциальной экспрессии (DE) и отсутствием присутствия (AP) с внутренней оценкой 2 и выше. Красный — усиление выраженности при сильной боли, синий — снижение выраженности при сильной боли. На этапе открытия наборы зондов определяются на основе их оценки для отслеживания боли с максимальным количеством внутренних баллов 6 (33% (2 балла), 50% (4 балла) и 80% (6 баллов)). e Приоритезация с помощью CFG для предварительного доказательства причастности к боли.На этапе определения приоритетов наборы зондов преобразуются в связанные с ними гены с помощью аннотации Affymetrix и GeneCard. Гены расставляются по приоритету и оцениваются с использованием CFG для доказательства боли с максимумом 12 внешних баллов. Гены, набравшие не менее шести баллов из максимально возможных 18 общих внутренних и внешних баллов, переносятся на этап проверки. f Валидация в независимой когорте психиатрических пациентов с коморбидными болевыми расстройствами и серьезной субъективной и функциональной оценкой боли.На этапе проверки биомаркеры оцениваются на предмет ступенчатого изменения от обнаруженных групп субъектов с слабой болью к сильной боли и клинически тяжелому болевому расстройству с использованием ANOVA. N = количество посещений для тестирования. Пять биомаркеров были номинально значимыми, MFAP3 и PIK3CD были наиболее значимыми, а 68 биомаркеров были поэтапно изменены

Как и в наших предыдущих исследованиях [6,7,8], психиатрические субъекты являются частью более крупной продольной когорты взрослых, которой мы являемся. непрерывно собираю.Субъекты были набраны из популяции пациентов в Медицинском центре Индианаполиса, штат Вирджиния. Все субъекты поняли и подписали формы информированного согласия с подробным описанием целей, процедуры, предостережений и мер безопасности в соответствии с протоколом, утвержденным IRB Университета Индианы. Испытуемые прошли диагностическую оценку посредством обширного структурированного клинического интервью — диагностического интервью для генетических исследований и до шести посещений для тестирования с интервалом в 3–6 месяцев или всякий раз, когда происходила новая психиатрическая госпитализация. Во время каждого тестового визита они получали серию оценочных шкал, включая визуальную аналоговую шкалу (1–10) для оценки боли и шкалу качества жизни SF 36, в которой есть два пункта, связанных с болью (пункты 21 и 22), и кровь была взята.Мы собрали цельную кровь (10 мл) в две пробирки с РНК-стабилизирующим PAXgene, помеченные анонимным идентификационным номером, и хранили при -80 ºC в закрытой морозильной камере до времени будущей обработки. РНК цельной крови экстрагировали для исследований экспрессии генов на микроматрицах из пробирок PAXgene, как подробно описано ниже.

Для этого исследования наша когорта внутри-субъекта, из которой были получены данные биомаркеров, состояла из 28 субъектов (19 мужчин, 9 женщин) с несколькими тестовыми посещениями, у каждого из которых было по крайней мере одно диаметральное изменение боли от слабой боли. (ВАШ 2 и ниже) до сильной боли (ВАШ 6 и выше) от одного тестового визита к другому (рис.1b и рис. S1). Было три субъекта с пятью посещениями каждый, один субъект с четырьмя посещениями, двенадцать субъектов с тремя посещениями каждый и двенадцать субъектов с двумя посещениями каждый, в результате чего в общей сложности было взято 79 образцов крови для последующих исследований микроматрицы экспрессии генов (рис.1 и таблица S1. ).

Наша проверочная когорта, в которой результаты основных биомаркеров были подтверждены на предмет еще большего изменения экспрессии, состояла из 13 мужчин и 10 женщин с диагнозом болевого расстройства и клинически сильной болью (Таблица S1).Это было определено как наличие боли по ВАШ 6 и выше и сумма пунктов шкалы SF36 21 (интенсивность боли) и 22 (нарушение боли при повседневной деятельности), равной 10 и выше (Таблица S1).

Наша независимая тестовая когорта для прогнозирования состояния (сильная боль) состояла из 134 мужчин и 28 женщин с психическими расстройствами, демографически сопоставимых с когортой обнаружения, с одним или несколькими посещениями для тестирования в нашей лаборатории, с либо слабой болью, либо средней болью, или сильная боль, в результате чего было получено 414 образцов крови, в которых были получены данные об экспрессии генов полногеномной крови (рис.1 и таблица S1).

Наша тестовая когорта для прогнозирования признака (будущие визиты в отделение неотложной помощи с болью в качестве основной причины в первый год наблюдения и все будущие визиты в отделение неотложной помощи по поводу боли) (рис. 1) состояла из 171 мужчины и 19 женщин, для которых у нас было продольное наблюдение с электронными медицинскими записями. Последующее количество посещений пациентов по поводу боли в отделении неотложной помощи в течение года после тестирования было подсчитано на основе электронных медицинских записей клиническим исследователем, который использовал ключевое слово «боль» в качестве причины посещения отделения неотложной помощи или «боль» с упоминанием острая боль в тексте заметки.

Лекарства

У всех субъектов в когорте открытия были диагностированы различные психические расстройства и различные сопутствующие заболевания (таблица 1). Их лекарства были перечислены в их электронных медицинских записях и задокументированы нами во время каждого посещения для тестирования. Лекарства могут иметь сильное влияние на экспрессию генов. Тем не менее, наше открытие дифференциально экспрессируемых генов было основано на анализе внутри субъектов, который не только учитывает генетические фоновые эффекты, но и минимизирует эффекты лекарств, поскольку пациенты редко меняют лекарства между визитами.Более того, не было последовательной схемы приема какого-либо конкретного типа лекарств, поскольку наши испытуемые принимали широкий спектр различных лекарств, психиатрических и непсихиатрических. Некоторые субъекты могут не соблюдать режим лечения и, таким образом, могут иметь изменения в лекарствах или наркотиках, вызывающих злоупотребление, не отраженные в их медицинских записях. При этом наша цель — найти биомаркеры, отслеживающие боль, независимо от того, является ли она эндогенной биологической причиной или вызвана злоупотреблением психоактивными веществами или несоблюдением лекарств.Фактически, можно было бы ожидать, что некоторые из этих биомаркеров будут мишенями для лекарств, как мы показываем в этой статье. В целом, открытие биомаркеров с нашим универсальным дизайном происходит, несмотря на то, что испытуемые имеют разный пол, диагноз, принимают различные лекарства и другие переменные образа жизни.

Таблица 1 Совокупные демографические данные

Эксперименты по экспрессии генов крови

Экстракция РНК

Цельную кровь (2,5–5 мл) собирали в каждую пробирку PaxGene обычным венепунктом.Пробирки PaxGene содержат запатентованные реагенты для стабилизации РНК. РНК экстрагировали и обрабатывали, как описано ранее [6,7,8].

Microarrays

Работа с микрочипами проводилась с использованием ранее описанной методологии [6,7,8,9]. и как описано ниже.

Биомаркеры

Шаг 1. Обнаружение

Мы использовали оценку субъекта по шкале боли ВАШ, оцененную во время сбора крови (рис. 1). Мы проанализировали различия в экспрессии генов между посещениями с низким уровнем боли (определяется как оценка 0–2) и посещениями с высокой степенью боли (определяется как оценка 6 и выше), используя мощный внутри-субъектный дизайн, а затем суммирование между субъектами (Рис.1).

Мы проанализировали данные двумя способами: методом отсутствия и присутствия (AP) и методом дифференциальной экспрессии (DE), как в предыдущей нашей работе по суицидным биомаркерам [6,7,8]. Подход AP может фиксировать включение и выключение генов, а подход DE может фиксировать постепенные изменения экспрессии. Анализы были выполнены, как описано ранее [7,8,9]. В наших лабораториях мы разработали сценарии R для автоматизации и проведения всех этих анализов больших наборов данных в большом количестве, проверенные на соответствие ручной оценке человеком [9].

Символ гена

для наборов зондов был идентифицирован с использованием NetAffyx (Affymetrix) для Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 GeneChips, а затем GeneCards для подтверждения символа первичного гена. Кроме того, для тех наборов зондов, которым NetAffyx не присвоил символ гена, мы использовали GeneAnnot (https://genecards.weizmann.ac.il/geneannot/index.shtml), чтобы получить символы генов для этих не охарактеризованных наборов зондов, за которыми следовала GeneCard. . Затем гены оценивались с использованием наших вручную созданных баз данных CFG, как описано ниже (рис.1д).

Шаг 2: Расстановка приоритетов с использованием конвергентной функциональной геномики (CFG)

Базы данных

Мы создали в нашей лаборатории (Лаборатория нейрофеномики, www.neurophenomics.info) вручную собранные базы данных исследований экспрессии генов человека / экспрессии белков (посмертный мозг, периферические ткани / жидкости: спинномозговая жидкость, кровь и клеточные культуры), генетических исследований человека. (ассоциация, вариации числа копий и сцепление), а также экспрессия генов на животных моделях и генетические исследования, опубликованные на сегодняшний день по психическим расстройствам.В наши базы данных включены только результаты, которые авторы исследования сочли значимыми в первичной публикации с использованием их особого экспериментального дизайна и пороговых значений. Наши базы данных включают только первичные литературные данные и не включают обзорные статьи или другие вторичные анализы интеграции данных, чтобы избежать избыточности и цикличности. Эти большие и постоянно обновляемые базы данных использовались в нашей платформе перекрестной проверки и определения приоритетов CFG (рис. 1e). Для этого исследования данные из 355 статей о боли присутствовали в базах данных на момент анализа CFG (декабрь 2017 г.) (генетические исследования человека-212, исследования нервной ткани человека-3, периферические ткани / жидкости человека-57, не- генетические исследования человека-26, исследования мозга / нервной ткани, не относящиеся к человеку, 48, периферические ткани / жидкости, не относящиеся к человеку, 9).Анализы проводили, как описано ранее [7, 8].

Этап 3: Проверочные анализы

Проверочные анализы наших генов-кандидатов биомаркеров были проведены отдельно для AP и для DE. Мы исследовали, какие из главных генов-кандидатов (общий балл CFG 6 или выше) были поэтапно изменены в экспрессии с группы с низкой и высокой болью на группу с клинически тяжелой болью. Оценка CFG, равная 6 или выше, отражает эмпирическое ограничение в 33,3% от максимально возможной оценки CFG, равной 12, что позволяет включать потенциально новые гены с максимальной внутренней оценкой 6, но без оценки внешних доказательств.Были использованы субъекты с низкой болью, а также субъекты с сильной болью из когорты исследования, у которых не было сильной клинической боли (сумма SF36 пункта 21 и 22 <10), наряду с группой независимой валидации, у всех которых была сильная клиническая боль и диагноз коморбидного болевого расстройства ( n = 23).

Для анализа AP мы импортировали файлы данных Affymetrix microarray.chp от субъектов в когорте валидации клинически тяжелой боли в MAS5 Affymetrix Expression Console вместе с файлами данных из групп низкой и высокой боли в когорте живых обнаружений. .Мы перенесли данные AP в таблицу Excel и преобразовали A в 0, M в 0,5 и P в 1. Затем мы затем Z -оценили все вместе по полу и диагнозу. Если бы набор тестов не показал отклонений и, таким образом, дал бы неопределенное (0/0) значение в Z -балльной оценке пола и диагноза, мы бы исключили значения из этого набора тестов для этого пола и диагноза из анализа. .

Для анализа DE из Affymetrix были собраны когорты (Подтверждение клинически тяжелой боли, наряду с группами низкой и высокой боли в когорте Discovery).Cel данные, которые были RMA нормализованы по полу и диагнозу. Мы перенесли данные выражения, преобразованные в журнал, на лист Excel, и преобразовали данные без журнала, взяв 2 в степени преобразованного значения выражения. Затем мы оценили Z по полу и диагнозу.

Затем мы импортировали в Partek листы Excel с Z с оценкой по полу и диагностике, данные экспрессии AP и DE, а также провели статистический анализ с использованием однофакторного дисперсионного анализа для пошагово измененных наборов зондов, а также предприняли попытку строгого метода Бонферрони. поправки для всех протестированных наборов датчиков (рис. 1F).Мы также написали сценарий R, который автоматически анализирует данные прямо из таблицы Excel, и использовали его для подтверждения наших расчетов.

Выбор биомаркеров для дальнейшего использования

Мы продолжили тестирование основных биомаркеров на каждом этапе. Более длинный список биомаркеров-кандидатов включает в себя основные биомаркеры с этапа открытия (≥ 90% баллов, n = 28), основные биомаркеры с этапа определения приоритета (балл CFG ≥ 8, n = 32) и номинально значимые биомаркеры после этапа проверки ( n = 5), всего n = 65 наборов зондов ( n = 60 генов). Краткий список основных биомаркеров после этапа проверки составляет пять биомаркеров. На Шаге 4, тестирование, мы затем прогнозируем с помощью биомаркеров из длинного списка в независимых когортах состояние высокой боли и будущие визиты в отделение неотложной помощи для устранения боли в первый год и во все последующие годы.

Диагностика

Тестовая когорта для прогнозирования сильной боли (состояния) и ее подмножество, которое представляет собой тестовую когорту для прогнозирования будущих посещений ED (признак), были собраны из данных, которые были нормализованы RMA по полу и диагнозу.Когорта была полностью независимой, не было совпадения тематики с когортой открытия. Феномные (клинические) маркеры и маркеры экспрессии генов, используемые для прогнозов, были Z с оценкой по полу и диагнозу, чтобы иметь возможность объединить разные маркеры в панели и избежать потенциальных артефактов из-за разных диапазонов экспрессии у разных полов и диагнозов. Маркеры были объединены простым суммированием маркеров повышенного риска минус маркеры пониженного риска. Прогнозы выполнялись с помощью R-studio.

Прогнозирование состояния с высокой степенью боли

Анализ рабочих характеристик приемника (ROC) между уровнями геномных и феномных маркеров и уровнем боли был выполнен путем отнесения субъектов с оценкой боли 6 и выше к категории сильной боли. Мы использовали пакет pROC из R (Xavier Robin et al. BMC Bioinformatics 2011). Мы использовали баллы биомаркера Z и фена, запустив их в этой программе генерации ROC против диагностических групп в независимой тестовой когорте (высокая боль vs.остальные предметы). Кроме того, был проведен односторонний t-критерий между группой с высокой степенью боли и остальными, а показатель Пирсона R (односторонний) был рассчитан между оценками боли и уровнями маркеров (дополнительная информация — полные наборы данных и анализы).

Прогнозирование посещений отделения неотложной помощи в будущем для лечения боли в первый год после тестирования

Мы провели анализ для прогнозирования посещений отделения неотложной помощи при боли в первый год после каждого посещения для тестирования у субъектов, у которых было не менее 1 года наблюдения в VA система, для которой у нас есть доступ к полным электронным медицинским записям. Анализ ROC между уровнями геномных и феномных маркеров во время конкретного тестового визита и будущих визитов в отделение неотложной помощи по поводу боли проводился, как описано выше, на основе определения того, посещали ли субъекты отделение неотложной помощи с основной причиной боли или нет в течение 1 года после посещения с тестированием. Кроме того, был проведен односторонний t -тест с неравной дисперсией между группами посещений субъектов с посещениями отделения неотложной помощи и без них по поводу боли. Корреляция Pearson R (один хвост) была проведена между частотой госпитализаций (количество посещений отделения неотложной помощи по поводу боли, разделенное на продолжительность наблюдения) и уровнями маркеров.Регрессия Кокса была выполнена с использованием времени в днях от даты посещения для тестирования до даты первого посещения отделения неотложной помощи в случае пациентов, которые были в отделении неотложной помощи, или 365 дней для тех, кто этого не сделал. Отношение рисков было рассчитано таким образом, что значение> 1 всегда указывает на повышенный риск посещений отделения неотложной помощи, независимо от того, увеличивается или уменьшается экспрессия биомаркера.

Мы также провели анализ отношения шансов для посещений отделения неотложной помощи по поводу боли для всех будущих посещений отделения неотложной помощи из-за боли, включая те, которые происходят после 1 года наблюдения, в годы после тестирования (в среднем 5.56 лет на одного человека, от 0,44 до 11,27 года; см. Таблицу 1 и Таблицу S1), поскольку этот расчет, в отличие от ROC и теста t , учитывает фактическую продолжительность наблюдения, которая варьировалась от субъекта к субъекту. Тесты ROC и t могут фактически, если их использовать, недооценивать способность маркеров предсказывать, поскольку более тяжелые психиатрические пациенты с большей вероятностью переедут географически и / или будут потеряны для последующего наблюдения. Регрессия Кокса также была выполнена с использованием времени в днях от даты посещения до даты первого посещения отделения боли в отделении боли в случае пациентов, которые были в отделении неотложной помощи по поводу боли, или от даты посещения до даты последней записи в электронных медицинских записях для тех, кто не. Отношение рисков было рассчитано таким образом, что значение> 1 всегда указывает на повышенный риск посещений ЭД по поводу боли, независимо от того, увеличивается или уменьшается экспрессия биомаркера.

Биологическое понимание

Анализы путей

IPA (анализ пути изобретательности, версия 243, Qiagen), анализ микрочипов David Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis (Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний) версия 6.7 (август 2016 г.) и Kyoto Encyclopedia of Genesis. Геномы (KEGG) (через DAVID) использовались для анализа биологических ролей, включая основные канонические пути и заболевания (Таблица S4), генов-кандидатов, полученных в результате нашей работы, а также для идентификации генов в нашем наборе данных, которые являются целью существующие препараты.Мы провели анализ путей для комбинированных наборов зондов AP и DE 60 уникальных генов (65 наборов зондов). Для сетевого анализа 60 уникальных генов мы выполнили STRING Interaction Network (https://string-db.org), поместив гены в окно поиска и выполнив анализ множественных белков Homo sapiens.

CFG за пределами боли: доказательства причастности к другим психическим и родственным расстройствам

Мы также использовали подход CFG для изучения доказательств других психических и родственных расстройств для длинного списка из 65 биомаркеров-кандидатов (Таблица S3).

Therapeutics

Pharmacogenomics

Мы проанализировали, какие из наших индивидуальных главных биомаркеров, как известно, модулируются существующими лекарствами, с помощью наших баз данных CFG и с помощью анализов изобретательности лекарств (Таблица S4).

Открытие / перепрофилирование новых лекарств

Мы также проанализировали, какие лекарственные препараты и природные соединения имеют противоположное соответствие профилю экспрессии генов на панелях наших основных биомаркеров ( n = 65), используя карту подключений (https: // порталы . broadinstitute.org, Broad Institute, MIT) (Таблица 3). Тридцать три из 65 наборов датчиков присутствовали в массиве HGU-133A, используемом для карты подключения.

Конвергентные функциональные доказательства (CFE)

Мы свели в таблицу конвергентных функциональных доказательств (CFE) все доказательства, полученные на основе открытия (до 6 баллов), приоритизации (до 12 баллов), проверки (до 6 баллов), тестирования (состояние, характерные черты посещений ED в первый год, характеристики всех будущих посещений ED — до 8 баллов каждое, если достоверно предсказуемо для всех субъектов, 6 баллов, если предсказано по полу, 4 балла, если предсказано по полу / диагнозу).Общая оценка может достигать 48 баллов: 36 по нашим данным и 12 по литературным данным. Мы взвешиваем наши данные в три раза больше, чем литературные данные. Цель состоит в том, чтобы выделить, основываясь на совокупности наших данных и имеющихся на сегодняшний день данных, биомаркеры, которые имеют все доказательства: отслеживать боль, отражать патологию боли и прогнозировать ее. Такие биомаркеры заслуживают приоритетной оценки в будущих клинических испытаниях.

Лаборатория Камиллы Форсберг — Домашняя страница

Откуда берется кровь?

Лаборатория Форсберга занимается изучением судьбы стволовых клеток в системе крови.Гемопоэтические стволовые клетки ответственны за создание пожизненного запаса зрелых клеток крови. Каждая стволовая клетка способна создавать все зрелые типы клеток крови с самыми разными функциями: одни клетки крови специализируются на переносе кислорода, другие борются с инфекциями, а третьи предотвращают кровотечение в процессе свертывания крови. Как стволовая клетка решает, какой тип клеток дать? Принимаются ли эти решения самой стволовой клеткой, ее потомками-мультипотентными предшественниками или обоими? Каким образом эти решения не регулируются, чтобы вызвать рак и другие расстройства?

Мы решаем эти вопросы с разных сторон — с помощью экспериментальных подходов in vivo и in vitro, уделяя особое внимание конкретным молекулам, а также анализируя глобальные изменения. В конечном итоге мы хотим понять молекулярные детерминанты решения судьбы гемопоэтических стволовых клеток, чтобы мы могли предотвращать и лечить как генетические, так и приобретенные нарушения кроветворной системы, включая анемию, аутоиммунные заболевания, лейкемии и лимфомы.

Имеются постдокторские должности в исследованиях стволовых клеток

Мы принимаем заявки на участие в нашей новой программе постдокторантуры IRACDA! Пожалуйста, напишите доктору Форсбергу, если вы заинтересованы в проведении исследования IRACDA в лаборатории Форсберга. Следующий крайний срок подачи заявок на участие в программе IRACDA — август 2021 года.

СЕЙЧАС ОТКРЫТО: Должность специалиста-исследователя для кандидата с сильными сторонами в клеточной и молекулярной биологии, включая клонирование плазмид и создание библиотек. Подайте заявку здесь: https://recruit.ucsc.edu/JPF00930

Новости

Поздравляем Smrithi & Scott с их новой статьей в Stem Cell Research : «Протокол количественного восстановления гемопоэтических стволовых клеток: учет вариабельности реципиента, тканевого распределения и периода полураспада клеток».(Смрити готовит больше, чем одним способом;))!

Поздравляем Tobin с получением награды за исследования в области науки и технологий!

В печати: Наша новая история об эпигенетическом праймировании гемопоэтических стволовых клеток была принята Epigenetics & Chromatin . Пока находится в печати, основная рукопись доступна на BioRxiv. Поздравления соавторам Эрику, Яне и Ребекке, и нашим ближайшим соавторам в the Kim lab, Роману и Даниэлю !

Поздравляем Dr.Брайс Мансо для вашего выбора в качестве постдокторанта IRACDA !

В печати: Наша новая история о регуляции IL7R развития миелоидных клеток взрослых была принята Experimental Hematology . Пока находится в печати, основная рукопись доступна на BioRxiv. Поздравления соавторам Тейлор, Атеш, Донна и Адиэль !

Поздравляем Alessandra Rodriguez y Baena с ее новой преддокторской стипендией TRDRP ! И за сдачу квалификационного экзамена с отличием!

Новая публикация в Stem Cells в сотрудничестве с лабораториями Селлери и Шредера:

«Повсеместная сверхэкспрессия CXCL12 обеспечивает радиационную защиту и увеличивает мобилизацию гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников» Смрити Раджендиран, Стефани Смит-Бердан, Лео Кунц, Маурицио Рисолино, Лисия Селлери, Тимм Шредер, Э. Камилла Форсберг

Как Виагра влияет на ваши стволовые клетки ? Новая публикация в Stem Cell Reports и пресс-релиз от 10 октября 2019 г.Поздравляем авторов Stephanie, Alyssa и Smrithi !

Стипендии, стипендии, стипендии! Поздравляем аспирантов Эрика Мартина , Донны Поскабло , Тейлор Кул и Атеш Уортингтон с получением стипендий от NIH, HHMI, AHA и TRDRP!

A новый грант R01 от Национального института старения поддержит наши усилия по пониманию того, как старение влияет на кроветворную и сердечно-сосудистую системы.

Наша новая статья о развитии тканевых макрофагов размещена в журнале Development ! Также прочтите статью Highlights здесь. Поздравляем авторов Taylor Cool и Atesh Worthington !

События

КРОВЬ НА БАКЕ! аспирант Атеш Уортингтон и Донна Поскабло представят свои исследования стволовых клеток крови на CATALYST в центре Санта-Крус, 12 августа , 2019, в 19:00.Открыт для всех — присоединяйтесь к нам!

«Они так быстро растут: развитие и старение крови» — смотрите видео здесь!

Ссылки

Публикации

* = сотрудник лаборатории Форсберга

• * Smith-Berdan S, * Bercasio A, * Rajendiran S, * Forsberg EC. (2019) Виагра обеспечивает эффективную мобилизацию гемопоэтических стволовых клеток за один день. Отчеты о стволовых клетках . 13 (5): 787-792. PMID: 31607567

• Фархи С., Харихаран С., Иланко Дж., Ван Вуденберг Л., Чимадамор Ф., * Угарте Ф., * Форсберг Е.С., Хуанг К.-Т, Эндрюс Д., Терских А.(2019) Улучшение открытия лекарств с помощью многопараметрического анализа эпигенетического ландшафта на основе изображений. Элиф . 22 октября; 8. pii: e49683 . PMID: 31637999

• Leung G, * Cool T, Valencia C, * Worthington A, Beaudin A и * Forsberg EC. (2019) Связанный с лимфоидом рецептор интерлейкина 7 (IL-7R) регулирует развитие тканевых резидентных макрофагов. Разработка. 146 (14). pii: dev176180. PMID: 31332039

• * Boyer S, * Rajendiran S, * Beaudin A, * Smith-Berdan S, Muthuswamy P, * Perez-Cunningham J, * Martin EW, * Cheung C, * Tsang H, * Landon M и * Forsberg EC.(2019) Клональная и количественная оценка in vivo дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников выявляет сильный эритоидный потенциал мультипотентных клеток. Отчеты о стволовых клетках. 12 (4): 801-815. PMID: 30
  7
  

  Ресурс GITHUB: https://github.com/cforsberg/Boyer-Stem-Cell-Reports-2019

• * Cool T и * Forsberg EC . (2019) Chasing Mavericks: поиски определения волн развития кроветворения. Текущие темы биологии развития .Приглашенный обзор. 132: 1-29. PMID: 30797507
  

• Cole C, Byrne A, * Beaudin AE, * Forsberg EC и Vollmers C. (2018) Tn5Prime, 5′-метод захвата на основе Tn5 для последовательностей РНК одиночных клеток. Nucleic Acids Res . 1 июня 2018 г .; 46 (10): e62. PMID: 29548006 PMCID: PMC6007450

• Byrne A, * Beaudin AE, Olsen HE, Jain M, Cole C, Palmer T, DuBois RM, * Forsberg EC, Akeson M и Vollmers C (2017) RNAseq с длинным считыванием нанопор выявляет широко распространенные транскрипционные вариации среди одиночных B клетки. Природа Коммуникации . 19 июля; 8: 16027. PMID: 28722025 PMCID: PMC5524981

• * Beaudin, AE и * Forsberg, EC. (2016) В B1a или нет в B1a: вносят ли гемопоэтические стволовые клетки вклад в резидентные в ткани иммунные клетки? Кровь. 128 (24): 2765-2769. Обзор . PMID: 27799163 PMCID: PMC5159701

• * Beaudin AE, * Boyer SW, * Perez-Cunningham J, * Hernandez GE, Derderian SC, * Jujjavarapu C, * Aaserude E, MacKenzie T. и * Forsberg, EC .(2016). Транзиторные гемопоэтические стволовые клетки в процессе развития дают начало подобным врожденным В- и Т-клеткам. Cell Stem Cell. 19 (6): 768-783. PMID: 27666010 PMCID: PMC5524382

  Предварительный просмотр: Cell Stem Cell . 2016; 19 (6): 673-674. Стиджн Ванхи и Джоан Юань «Фетал до

  »

  Кроветворение взрослых с «Flk» переключателя »

  Специальный обзор в: Исследование стволовых клеток. 2017; 4 (25).Бриджит Ваас и Иван Майяр

  «Гемопоэтические стволовые клетки плода создают волну»

  Выбран на «Факультет 1000» двумя независимыми членами F1000

• * Perez-Cunningham J, * Boyer SW, * Landon M и * Forsberg EC. (2016) Трансгенные мыши, экспрессирующие GFP, специфические для гемопоэтических стволовых клеток, полученные путем генетического вырезания пангематопоэтического репортерного гена. Экспериментальная гематология.Авг; 44 (8): 755-764.e1. DOI: 10.1016 / j.exphem.2016.05.002. Epub, 2016, 13 мая. PMID: 27185381

• Larsen MC, N’Jai AU, Alexander DL, Rondelli CM, * Forsberg EC , Czuprynski CJ, Jefcoate CR. (2016) Cyp1b1-опосредованное подавление лимфоидных предшественников в костном мозге полициклическими ароматическими углеводородами координированно воздействует на селезенку и тимус: селективная роль Ah-рецептора . Фармакологические исследования и перспективы 4 (4).

• * Угарте Ф, * Соуза С., Синквин Б., * Мартин Э.М., * Критч Дж, * Санчес Дж., * Инман М., * Цанг Х., Варр М., Пассеге Е., Ларабелл С. и * Форсберг ЕС. (2015) Прогрессивная конденсация хроматина и метилирование h4K9 регулируют дифференцировку эмбриональных и гемопоэтических стволовых клеток. Отчеты о стволовых клетках. 10 ноября; 5 (5): 728-40.

  Опубликовано в «Новости кроветворения», версия 6.41, 20 октября 2015 г.

• Zovein и * Forsberg, E.C. (2015) Развитие кроветворения на большой высоте: испытание стволовых клеток крови. Разработка. 15 мая; 142 (10): 1728-32. Приглашенные комментарии / Обзор встречи

• Hoeffel G, Chen J, Lavin Y, Low D, Almeida FF, See P, * Beaudin AE, Lum J, Low I, * Forsberg EC, Poidinger M, Zolezzi F, Larbi A, Ng LG, Chan JK, Greter M, Becher B, Samokhvalov IM, Merad M, Ginhoux F. (2015) Фетальные моноциты, полученные из эритромиелоидных предшественников C-myb (+), дают начало взрослым тканевым макрофагам. Иммунитет. 21 апреля; 42 (4): 665-78.

  Комментарий в: Immunity 2015 21 апреля: Schneider, C.и Копф М. «Искушение судьбы MaYBe Решение»

• * Smith-Berdan S, * Nguyen A, * Hong MA, * Forsberg EC . (2015) Сосудистая целостность, опосредованная ROBO4, регулирует направленность движения гемопоэтических стволовых клеток. Отчеты о стволовых клетках. 10 февраля; 4 (2): 255-68.

  Изображение на обложке

• Flach J, Bakker ST, Mohrin M, Conroy PC, Pietras EM, Reynaud D, Alvarez S, Diolaiti ME, * Ugarte F, * Forsberg EC , Le Beau MM, Stohr BA, Méndez J, Morrison CG, Passegué E .(2014) Стресс репликации является мощным фактором функционального снижения стареющих гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 14 августа; 512 (7513): 198-202.

  Комментарий в: Nature 2014 30 июля: Бартек Дж. И Ходни З. «Старые стволовые клетки крови испытывают стресс »

• Epelman S, Lavine KJ, * Beaudin AE, Sojka DK, Carrero JA, Calderon B, Brija T, Gautier EL, Ivanov S, Satpathy AT, Schilling JD, Schwendener R, Sergin I, Razani B, * Forsberg EC , Йокояма WM, Unanue ER, Colonna M, Randolph GJ, Mann DL.(2014) Резидентные кардиальные макрофаги эмбриона и взрослого человека поддерживаются с помощью различных механизмов в устойчивом состоянии и во время воспаления. Иммунитет. 2014 16 января; 40 (1): 91-104.

• * Beaudin, A.E., * Boyer, S.W., и * Forsberg, E.C. (2014) Flk2 / Flt3 способствует развитию как миелоида, так и лимфоида путем увеличения несамообновляющихся мультипотентных гематопоэтических клеток-предшественников. Экспериментальная гематология. Мар; 42 (3): 218-229.e4.

  Выделено в «В этом выпуске» журнала Experimental Hematology, март 2014 г.

• * Угарте, Ф.и * Forsberg, E.C. (2013) Ниши гематопоэтических стволовых клеток: новые открытия вызывают новые вопросы. EMBO J. 2 октября; 32 (19): 2535-2547. Приглашенный просмотр.

• Hashimoto D, Chow A, Noizat C, Teo P, Beasley MB, Leboeuf M, Becker CD, See P, Price J, Lucas D, Greter M, Mortha A, * Boyer SW, * Forsberg EC , Tanaka M, van Rooijen N, García-Sastre A, Stanley ER, Ginhoux F, Frenette PS, Merad M. (2013) Резидентные в тканях макрофаги самоподдерживаются локально на протяжении всей взрослой жизни с минимальным вкладом циркулирующих моноцитов.Иммунитет. 18 апреля; 38 (4): 792-804.

• * Boyer, S.W., * Beaudin, A.E., и * Forsberg, E.C. (2012) Картирование путей дифференцировки из гемопоэтических стволовых клеток с использованием отслеживания клонов Flk2 / Flt3. Клеточный цикл. 1 сен; 11 (17).

• * Smith-Berdan, S., Schepers, K., * Ly, A., * Passegue, E., и * Forsberg, E. C. (2012) Динамическая экспрессия Робо-лиганда Slit2 в популяциях клеток костного мозга. Клеточный цикл. 15 февраля; 11 (4).

• * Бойер, С.W., * Schroeder, A.V., * Smith-Berdan, S., и * Forsberg, E.C. (2011) Все гемопоэтические клетки генерируются из гемопоэтических стволовых клеток через Flk2 / Flt3-положительные клетки-предшественники. Cell Stem Cell 8 июля; 9 (1): 64-73.

Выбрано на «Факультет 1000»

• Коева М., * Форсберг, E.C. , и Стюарт, Дж. М. (2011). Вычислительная интеграция гомолога и экспрессии модуля гена пути выявляет общие признаки стволовости.PLoS ONE 6 (4): e18968.

• * Smith-Berdan, S., * Nguyen, A., * Hassanein D, * Zimmer M, * Ugarte F, Ciriza J, Li D, García-Ojeda ME, Hinck L, и * Forsberg, EC (2011 ) Robo4 взаимодействует с Cxcr4 для определения локализации гемопоэтических стволовых клеток в нишах костного мозга. Стволовая клетка клетки 7; 8 (1): 72-83.

Изображение на обложке
Комментарий в: Cell Stem Cell 2011, 7 января; 8 (1): 6-7. Мур К. «Окольный путь в нишу»
Комментарий в: Nature 2011 20 января; 469 (7330).Основные результаты исследований, «Стволовые клетки: руководство по роботам-белкам для клеточных трансплантатов»
Выбрано для «Факультета 1000»

• Chang, E. ¹ , Forsberg, EC ¹ , Wu, J., Wang, B., Prohaska, S.S1., Allsopp, R., Weissman, IL, and Cooke, JP (2010 ) Холинергическая активация гемопоэтических стволовых клеток. Vasc Med. Октябрь; 15 (5): 375-85.

• Марлоу, Р., Бинньюис, М., Моника, С., Стрикленд, П., Форсберг, Э.C. , Li, D.Y., и Hinck, L. (2010) Vascular Robo4 ограничивает проангиогенную эпителиальную передачу сигналов в груди. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107 (23): 10520-5. Epub 2010 24 мая

• Сантагуида М. , Шеперс К., Кинг Б., Сабнис А.Дж., Форсберг, E.C. , Аттема, Д.Л., Браун, Б.С. и Пассеге, E. (2009). JunB защищает от миелоидных злокачественных новообразований, ограничивая пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток, не влияя на самообновление. Cancer Cell, 5: 341-52.

• * Forsberg, E.C. и * Smith-Berdan, S. (2009) Анализ кода ниши: молекулярные механизмы, управляющие адгезией и дифференцировкой гемопоэтических стволовых клеток. Haematologica 94 (11): 1477-81.

Изображение на обложке

• Forsberg, E.C. , Passegue, E1., Prohaska, S.S1., Wagers, A.J1., Koeva, M., Stuart, J.M., and Weissman, I.L. (2009) Молекулярные сигнатуры покоящихся и мобилизованных гемопоэтических стволовых клеток и лейкемических стволовых клеток.PLoS One 20 января; 5 (1): e8785.
• Ooi, AGL, Karsunky, H., Majeti, R., Butz, S., Vestweber, D., Ishida, T., Quertermous, T., Weissman, IL, и Forsberg, EC (2008). Молекула ESAM1 является селективным маркером гемопоэтических стволовых клеток. Стволовые клетки. 2008 г. 11 декабря, EPUB выходит в печать.
• Attema JL, Papathanasiou P, Forsberg EC , Xu J, Smale ST, Weissman IL. Эпигенетическая характеристика дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток с использованием анализа miniChIP и бисульфитного секвенирования. Proc Natl Acad Sci U S A . 24 июля 2007 г .; 104 (30): 12371-6. Epub 18 июля 2007 г.
• Forsberg EC , Bhattacharya D, Weissman IL. Гематопоэтические стволовые клетки: профили экспрессии и не только. Стволовая клетка Ред. . 2006; 2 (1): 23-30. Рассмотрение.
• Forsberg EC , Serwold T, Kogan S, Weissman IL, Passegué E. Новые доказательства, подтверждающие мегакариоцитарно-эритроцитарный потенциал мультипотентных гематопоэтических предшественников flk2 / flt3 +. Ячейка . 2006 28 июля; 126 (2): 415-26.
• Forsberg EC , Prohaska SS, Katzman S, Heffner GC, Stuart JM, Weissman IL. Дифференциальная экспрессия новых потенциальных регуляторов в гемопоэтических стволовых клетках. PLoS Genet . 2005 сентябрь; 1 (3): e28.

Высокопроизводительные сверхчувствительные молекулярные методы для количественного определения малярийных паразитемий с низкой плотностью распространения

РЕЗЮМЕ

Эпидемиология малярии в регионах с низким уровнем передачи была недооценена. Методы молекулярной диагностики выявили более высокую распространенность малярии, чем обычная микроскопия или быстрые диагностические тесты, но они обычно оценивают образцы капиллярной крови, уколотые пальцем (~ 5 мкл), и поэтому не могут определить плотность паразитов <200 / мл.Их использование недооценивает истинную скорость распространения паразитов. Чтобы охарактеризовать эпидемиологию малярии в условиях низкой передачи и спланировать стратегии элиминации, необходима более чувствительная количественная ПЦР (qPCR) для выявления и количественной оценки малярийных паразитемий с низкой плотностью распространения. Высокочувствительный метод количественной ПЦР «большого объема» (КПЦР) на основе Plasmodium sp. 18S РНК была адаптирована для объемов образцов крови ≥250 мкл и масштабирована для обеспечения высокой пропускной способности. Методы были проверены путем оценки аналитической чувствительности и специфичности, диагностической чувствительности и специфичности, эффективности, точности, аналитической и диагностической точности, предела обнаружения, анализа первопричин ложных срабатываний и устойчивости.Метод количественной ПЦР большого объема на основе Plasmodium sp. 18S РНК дала высокую эффективность ПЦР от 90 до 105%. Концентрации ДНК паразитов в больших объемах крови дали постоянный аналитический предел обнаружения (LOD) 22 паразитов / мл (95% ДИ, от 21,79 до 74,9), что примерно в 2500 раз более чувствительно, чем при обычной микроскопии, и в 50 раз более чувствительно, чем в настоящее время. использовали методы ПЦР по пятнам крови на фильтровальной бумаге. Диагностическая специфичность составила 99,75%. Используя автоматизированные процедуры, можно было обрабатывать 700 проб крови в неделю.Был разработан и утвержден очень чувствительный и специфический высокопроизводительный метод количественной ПЦР с большим объемом для обнаружения паразитемий низкой плотности (> 20 паразитов / мл).

ВВЕДЕНИЕ

Ликвидация малярии, самого серьезного паразитарного заболевания человека, теперь прочно вернулась в глобальную повестку дня. В последнее время наблюдается значительное снижение заболеваемости и смертности от малярии, но этим достижениям и цели ликвидации угрожает появление в Юго-Восточной Азии резистентного к артемизинину Plasmodium falciparum.P. falciparum сосуществует в Азии с Plasmodium vivax, у которого также развивается устойчивость к современным методам лечения и который по своей природе труднее устранить из-за стадии бездействия печени. Распространение устойчивости к артемизинину у P. falciparum, которая в настоящее время ставит под угрозу терапевтическую эффективность комбинированного лечения артемизинином (АКТ), может сорвать текущие глобальные инициативы по контролю и ликвидации малярии (1). Растет общее мнение о том, что ликвидация малярии falciparum в регионах с устойчивостью к артемизинину является единственным эффективным подходом к борьбе с этой угрозой (2, 3).Чтобы ликвидировать малярию, необходимо определить ее эпидемиологию. Обычные описания эпидемиологии малярии в условиях низкого уровня передачи предполагают, что распространенность малярии низка (<10%) и неоднородна. Считалось, что большинство или все инфекции являются симптоматическими, поскольку считается, что население остается неиммунным в условиях низкого уровня передачи, поэтому меры по борьбе с малярией сосредоточены на выявлении и лечении лиц с симптомами.

Молекулярные анализы для обнаружения инфекций Plasmodium все чаще используются, потому что, хотя они и не относятся к пунктам оказания медицинской помощи, они обладают более высокой чувствительностью, чем микроскопия или быстрые диагностические тесты (RDT), а также обеспечивают окончательную идентификацию видов и дополнительную информацию о генотипе.ПЦР для обнаружения малярии была разработана на основе нескольких различных генов-мишеней, таких как 18S РНК (4–11), тРНК (12), и митохондриальных генов, таких как цитохром b (13, 14), AMA1 (15) и Stevor. (16). Из них ген 18S РНК чаще всего используется в качестве мишени для обнаружения малярии с помощью ПЦР, поскольку он специфичен, консервативен у всех видов Plasmodium и имеет от ~ 5 до 7 копий на геном, что увеличивает чувствительность (17). Уровень обнаружения (чувствительность) этих методов ПЦР, будь то вложенная ПЦР или ПЦР в реальном времени, обычно находится в диапазоне от 100 до 1000 паразитов на миллилитр (18).Чувствительные методы ПЦР показывают высокую распространенность паразитемии низкой плотности в эндемичных районах (5, 6), но почти во всех эпидемиологических исследованиях, опубликованных на сегодняшний день, анализ ПЦР применялся на образцах крови небольшого объема (5, 6, 18–23), обычно пробы капиллярной крови, взятые из пальца (≤5 мкл). Они также использовались в стратегиях «целенаправленного скрининга и лечения» (24). Даже если бы можно было надежно амплифицировать ДНК от одного паразита, чувствительность этого метода все еще ограничена объемом образца до ≥1 паразита / 5 мкл, так что плотность паразита <200 / мл не может быть обнаружена.В действительности, при использовании образцов капиллярной крови предел обнаружения составляет около 1000 или более паразитов на мл. Сообщалось о детекции ПЦР с большим объемом крови, но она не получила широкого распространения (19).

Для выявления и количественной оценки малярийных паразитемий низкой плотности в больших наборах образцов мы разработали высокочувствительную количественную ПЦР (qPCR) на основе ранее опубликованной методологии (11), адаптированной для объема образца крови ≥200 мкл. Метод был подтвержден оценкой аналитической чувствительности и специфичности, диагностической чувствительности и специфичности, эффективности, точности, аналитической и диагностической точности, предела обнаружения и надежности.Затем он был адаптирован для использования с высокой пропускной способностью, чтобы облегчить эпидемиологический скрининг в районах, где могут быть реализованы мероприятия по ликвидации малярии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов крови и выделение ДНК. Целые образцы крови (1 мл) собирали в пробирки с ЭДТА и центрифугировали при 2500 об / мин в течение 10 минут для удаления всей плазмы вместе с 70-100 мкл лейкоцитов на 1 л. мл цельной крови. Затем упакованные эритроциты (эритроциты) замораживали при -30 ° C. Матрица ДНК для обнаружения и количественного определения Plasmodium с помощью ПЦР была очищена от размороженных упакованных образцов красных кровяных телец.После тщательного измерения объема пробы ДНК экстрагировали с помощью мини-набора для крови QIAamp для объемов проб ≤200 мкл (что эквивалентно 500 мкл цельной крови при гематокрите 40%) или набора для миди крови QIAamp для объемов проб от 200 до 2000 мкл упакованных эритроцитов (Qiagen, Германия). Очищенную ДНК полностью сушили в центробежном вакуумном концентраторе, а затем суспендировали в небольшом объеме воды, пригодной для ПЦР, с получением концентрата. Начальный объем цельной крови составлял 1 мл, а объем очищенной ДНК после концентрирования составлял 10 мкл, так что 1 мкл суспензии матрицы соответствует 100 мкл цельной крови.Аликвоту ДНК 2 мкл использовали в качестве матрицы ДНК в каждой кПЦР. Таким образом, рабочие характеристики этого метода оценивались для образцов крови объемом> 200 мкл.

Количественная ПЦР на малярийных паразитов в реальном времени. Присутствие паразитов и оценка количества паразитов в каждом образце оценивали с помощью метода абсолютной количественной ПЦР в реальном времени (Corbett Rotor-Gene Q, Corbett Research, Австралия). Праймеры для нацеливания на 18S рРНК и зонды гидролиза, используемые в анализе, были основаны на ранее опубликованном протоколе (11), который был модифицирован для повышения чувствительности за счет концентрации матрицы ДНК паразита из больших объемов крови (т.е.е., 200 мкл упакованных эритроцитов вместо обычных 2 мкл).

Стандартные контроли были приготовлены с использованием синхронизированных культивируемых паразитов P. falciparum 3D7 на кольцевой стадии. Суспензии, содержащие ровно 10 000 эритроцитов, инфицированных на кольцевой стадии, на пробирку в упакованных эритроцитах, получали с использованием сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) в соответствии с протоколом, описанным Malleret et al. (2011) (25) с использованием проточного цитометра Influx (Becton, Dickinson). Эти точно определенные контроли затем разводили до тщательно отмеренных объемов эритроцитов, обедненных лейкоцитами, полученных от добровольца, не болевшего малярией.ДНК образцов экстрагировали с использованием автоматической машины для экстракции ДНК (QIAsymphony и DSP DNA midi kit; Qiagen, Германия), а затем сушили с использованием центробежного вакуумного концентратора и затем ресуспендировали в воде для ПЦР, как описано выше, с получением концентрата ДНК. Стандартная кривая для калибровки была построена путем 5-кратных серийных разведений от 250 000 до 16 паразитов на миллилитр (7 точек) бидистиллированной водой. Использовали мультиплексную ПЦР QuantiTect NoROX (Qiagen, Германия), и смесь для ПЦР готовили, используя 1 × буфер QuantiTect, 0.4 мкМ каждого праймера и 0,2 мкМ гидролизного зонда. Профили температуры: начальная денатурация 95 ° C в течение 15 мин, затем 50 циклов денатурации (94 ° C) в течение 15 с с последующим отжигом (60 ° C) в течение 60 с. В реакции мультиплексировали внутренний контроль на основе гена бета-актина человека (номер доступа в GenBank, NM_001101.3). Последовательности праймеров и зондов были получены от ShineGene Bio-Technologies, Inc. (праймеры, 5′-ACCGAGCGCGGCTACAG [прямой] и 5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC [обратный]; зонд 6-карбокситетраметилродамина [TAMRA], 5′-VIC-TTCACCAGCACGG -3 ′).

Оценка количества паразитов в каждом образце была получена путем экстраполяции значения порогового цикла ( C _{T )} значения, полученного для неизвестного образца, на стандартную кривую с использованием программного обеспечения Rotor-Gene Q series v. 2.0 .2. На основе калибровочных экспериментов значение отсечения C _T было установлено перспективно равным 40. Для образцов, в которых количественная ПЦР была положительной, была предпринята попытка определить присутствующие виды Plasmodium с использованием вложенных протоколов ПЦР, специфичных для P.falciparum (название микросателлитного маркера Pk2), P. vivax (название микросателлитного маркера 3.502) и Plasmodium malariae (18S рРНК), как описано ранее (18–20). Положительные образцы, для которых было недостаточно ДНК для этого или не была получена амплификация, были зарегистрированы как малярия неопределенных видов.

Валидация протокола кПЦР. Методика была утверждена в соответствии с опубликованными руководящими принципами по диагностическим тестам, включающим амплификацию и обнаружение нуклеиновых кислот (26), а также по минимальным требованиям к информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (27).Были исследованы следующие параметры валидации: аналитическая чувствительность и специфичность, диагностическая чувствительность и специфичность, эффективность, точность, аналитическая и диагностическая точность, предел обнаружения и надежность. Анализ первопричин был проведен для образцов с ложноположительными результатами. Эталонные материалы, используемые на протяжении всей проверки, представляли собой образцы с точно известной плотностью паразитов, полученные с помощью FACS в диапазоне от 20 до 10 000 колец в 100 мкл упакованных эритроцитов (RBC), как описано выше.

Чувствительность нашего «большого объема» протокола qPCR также сравнивалась с чувствительностью ранее опубликованных протоколов на основе 18S РНК; это были оригинальные протоколы Kamau et al. (2011) (11) и Hermsen et al. (2001) (7), и два протокола, специфичных для P. falciparum, описанные Peradin et al. (2004) (8) и Rougemont et al. (2004) (9) (Таблица 1). Тестирование проводили в трех повторностях для каждой из семи концентраций паразитов эталонного образца FACS, использованных для построения стандартной калибровочной контрольной кривой (т.е.е., 250 000, 50 000, 10 000, 2000, 400, 80 и 16 паразитов / мл). Использовали мультиплексную ПЦР QuantiTect NoROX (Qiagen, Германия), смесь для ПЦР и условия цикла соответствовали инструкциям производителя.

ТАБЛИЦА 1

Сравнение чувствительности кПЦР большого объема с ранее опубликованными протоколами КПЦР

Специфичность теста. В лаборатории неукоснительно соблюдались меры предосторожности. Проверка на загрязнение выполнялась обычным случайным введением известных отрицательных образцов (15% от общего числа) в каждом прогоне.Если отрицательный контроль дал положительный результат при обычном тестировании, весь цикл повторяли и повторно тестировали до тех пор, пока все отрицательные контроли не дали отрицательный результат (неизменно в следующем цикле). Анализ первопричин обычно идентифицировал концентрированный положительный контроль как источник загрязнения. Исследование потенциальной контаминации включало генотипирование на основе генов msp1 , msp2 и glurp для P. falciparum и по микросателлитным маркерам pv3.27, pv3.502 и pvms5 для P. vivax в соответствии с ранее опубликованными протоколами для P. falciparum (28) и P. vivax (29).

Была рассмотрена возможность того, что бесклеточная ДНК малярии вызвала ложноположительные результаты. ДНК малярии в мерозоитах высвобождается из паразитированных эритроцитов в момент разрыва шизонта, и свободная ДНК мерозоитов сохраняется в кровообращении. Текущие исследования показывают, что концентрации ДНК в плазме (геномы / мкл) составляют примерно 0,1% от соответствующей плотности паразитов в цельной крови (на мкл) при острой малярии и быстро исчезают.Материал внутрилейкоцитарного паразита также удаляется в течение нескольких дней (30). Взятые вместе, эти результаты показывают, что при сверхнизких паразитемиях экстраэритроцитарная ДНК вряд ли может быть помехой.

Чтобы исключить перекрестное загрязнение образцов во время экстракции ДНК или обработки ПЦР, отрицательные контроли, состоящие только из воды, были добавлены в пропорции 8 на каждые 48 образцов.

Масштабирование. Для масштабирования для высокопроизводительного тестирования были разработаны автоматизированные процедуры.Образцы были помечены штрих-кодами, созданными с помощью программного обеспечения Freezerworks для управления образцами (Dataworks Development, Inc., Линвуд, Сиэтл, Вашингтон). Автоматическую экстракцию ДНК проводили с использованием интегрированной системы автоматической экстракции нуклеиновых кислот QIA Symphony (Qiagen, Германия), а затем использовали систему обработки жидкости QIAgility для приготовления мастер-миксов для ПЦР и для добавления матрицы ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Абсолютная количественная оценка плотности малярийных паразитов с помощью ПЦР в реальном времени.(i) Калибраторы количественного определения и эффективность ПЦР. Семь эталонных стандартов для калибровки (250 000, 50 000, 10 000, 2000, 400, 80 и 16 паразитов / мл) дали линейные стандартные графики ( R ² > 0,98) с наклоном значения от -3,203 до 3,322 и эффективность усиления от 90 до 105% (рис. 1). Неспецифической амплификации не наблюдали при оценке продуктов КПЦР с помощью гель-электрофореза.

Рис. 1

Линейность серийных разведений стандартных контролей в зависимости от коэффициента детерминации; R ² было 0.99651.

(ii) Аналитическая чувствительность. Аналитическая чувствительность кПЦР большого объема была получена из серии семиточечных стандартных разведений, описанных выше (т. Е. От 250 000 до 16 проанализированных паразитов на кольцевой стадии P. falciparum 3D7 / мл). с Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперименты проводили в три разных дня в шести повторностях. Результаты определяли пробит-анализом с использованием SPSS 11 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс). Графическая иллюстрация пробит-анализа представлена ​​на рис.2. Предел аналитического обнаружения (LOD), полученный из графиков, составляет 22 (стандартное отклонение [SD], 5) паразитов / мл (рис. 2). Это означает, что когда анализ применяется к штамму паразита 3D7, существует 95% вероятность обнаружения паразитемии на уровне 22 / мл. Учитывая, что последовательность целевого фрагмента, амплифицированного из генов 18S РНК P. falciparum, точно такая же, как последовательность генов 18S РНК, присутствующих в P. vivax, P. ovale, P. malariae и Plasmodium knowlesi, маловероятно, что аналитическая чувствительность для этих видов будет существенно отличаться от таковой для P.falciparum. Тем не менее, это необходимо подтвердить в будущем.

FIG 2

Аналитическая чувствительность метода количественной ПЦР на малярию.

(iii) Сравнение чувствительности кПЦР большого объема с ранее опубликованными протоколами количественной ПЦР. Чувствительность протокола количественной ПЦР с большим объемом сравнивали с ранее опубликованными протоколами, нацеленными на гены 18S РНК. Два из них не видоспецифичны (7, 11), а два — P. falciparum (8, 9). Тестирование проводилось в трех экземплярах для каждой серии разведений по семи точкам (контрольные образцы, приготовленные с помощью FACS), используемых для получения стандартной калибровочной кривой.В целом, протокол кПЦР с большим объемом имел среднюю чувствительность, которая была в 28–257 раз выше, чем у других методов (таблица 1).

(iv) Диагностическая чувствительность и специфичность. Специфичность КПЦР оценивалась на образцах, полученных от тайских добровольцев, которые никогда не болели малярией и которые, как считалось, не подвергались воздействию малярии в течение своей жизни. Эти образцы также были подтверждены как отрицательные в отношении Plasmodium с помощью эталонного метода вложенной ПЦР, нацеленного на 18S РНК (31).Анализ qPCR был отрицательным для всех образцов, кроме одного, предположительно ложноположительный сигнал (таблица 2). Таким образом, диагностическая специфичность составила 99,75% (95% ДИ от 99,3 до 100%). Двадцать один образец от пациентов с острой малярией, подтвержденный как действительно положительный на инфекцию P. falciparum с использованием стандартной методики определения видов с помощью вложенной ПЦР, был протестирован на основе метода 18S РНК (31), и все они были положительными.

ТАБЛИЦА 2

Оценки диагностической чувствительности и специфичности метода количественной ПЦР на малярию при разработке метода ^a

(v) Аналитическая специфичность.Специфичность протокола кПЦР была протестирована с помощью трех подходов: (i) анализ BLAST последовательностей праймеров и зондов в сравнении с базами данных NCBI, (ii) тестирование различных полевых образцов, содержащих четыре вида Plasmodium, которые инфицируют людей, и (iii) скрининг для полиморфизма последовательностей в амплифицированных фрагментах гена 18S РНК Plasmodium.

(a) Анализ BLAST . Специфичность КПЦР была максимизирована путем выбора праймеров и зондов, высокоспецифичных к генам плазмодия, которые затем использовали в строгих условиях реакции.Выбранные праймеры и зонды гидролиза уже были подтверждены Kamau et al. (2011) (11), и было показано, что они обладают очень высокой специфичностью в отношении Plasmodium sp. 18S РНК. Мы провели обновленный (9 января 2014 г.) поиск с использованием Nucleotide BLAST, чтобы подтвердить, что эти праймеры вряд ли будут гибридизовать и амплифицировать какие-либо неродственные гены, которые были недавно секвенированы. Была обнаружена 100% идентичность последовательностям рода Plasmodium без каких-либо указаний на то, что КПЦР может генерировать положительные сигналы с другими организмами, включая других паразитов из семейства Plasmodiidae, таких как Hepatocystis.

(b) Тестирование количественной ПЦР на полевых образцах всех четырех малярийных инфекций человека . Образцы крови, которые были микроскопически положительными для одного из четырех видов Plasmodium человека (100 образцов с P. falciparum, 100 образцов с P. vivax, 20 образцов с P. malariae и 10 образцов с P. ovale), которые были подтверждены эталонный метод, основанный на вложенной ПЦР, нацеленной на 18Ss РНК (31), были протестированы на специфичность. Все были положительными, как показано в таблице 3. Образцы из случаев P. knowlesi не были доступны, но анализ последовательности предсказывает, что они также были бы положительными.

ТАБЛИЦА 3

Тестирование специфичности метода количественной ПЦР на соответствующих видах Plasmodium ^a

(c) Скрининг на полиморфизмы последовательностей . Прямое секвенирование фрагмента, амплифицированного из более чем 70 полевых образцов, положительных по плазмодиям, не выявило каких-либо мутаций. Наконец, отсутствие каких-либо полос, кроме ожидаемой в продуктах кПЦР, амплифицированных из 350 полевых образцов, указывает на то, что неспецифической амплификации не происходит.

(vi) Прецизионность. Прецизионный анализ описывает степень соответствия между повторными анализами одного и того же образца. Данные о прецизионности позволяют определить общую дисперсию анализа. Общая дисперсия состоит из вариабельности внутри анализа (вариабельность нескольких результатов образцов с одинаковой концентрацией в одном эксперименте) и вариабельности между анализами (вариабельность нескольких результатов анализа, полученных на разных приборах одного типа в разное время разными операторы в лаборатории).Данные о прецизионности были рассчитаны на основе значений кривых амплификации C _T и значений паразитемии / мл. Полученные данные использовали для определения стандартного отклонения и дисперсии.

Оценка точности проводилась путем тестирования пяти серийно разведенных калибровочных образцов (соответствующих 10000, 2000, 400, 80 и 16 паразитов / мл, см. Выше) в шести отдельных случаях. Средний коэффициент вариации порога цикла для пяти выборок был равен 0.78% (таблица 4), что соответствует коэффициенту вариации для паразитов / мл 13,9% (таблица 5).

ТАБЛИЦА 4

Данные прецизионности метода qPCR на основе значений qPCR C _T

ТАБЛИЦА 5

Данные прецизионности метода qPCR на основе значений паразитемии / мл

(vii) Надежность. Подтвержденные образцы крови, отрицательные по плазмодиям, были дополнены контрольными образцами P. falciparum 3D7 в количестве 100 паразитов / мл. После экстракции с использованием автоматической машины для выделения ДНК QIAsymphony и набора DSP DNA midi (Qiagen, Германия) эти образцы были проанализированы с помощью qPCR.В качестве контроля аналогичным образом обрабатывали необработанный набор образцов крови, отрицательных по плазмодию ( n = 30). Все контрольные образцы были отрицательными, в то время как все пробы с добавками были положительными, что указывает на отсутствие ингибирования амплификации. Таким образом, надежность qPCR составляет ≥99%.

(viii) Высокая пропускная способность. Для высокопроизводительных автоматизированных процедур емкость для экстракции ДНК с использованием машины QIAsymphony (Qiagen, Германия) составляла 120 образцов за 8 часов на каждую машину.На концентрирование очищенной ДНК-матрицы требовалось 3 часа. Ресуспензию шаблона проводили в течение ночи (12 ч). КПЦР и вложенная ПЦР, выполняемые с использованием машин для обработки жидкостей QIAgility, занимали 10 часов на каждую машину. Эти комбинированные процедуры позволили нам обрабатывать 700 образцов крови в неделю, включая соответствующие проверки. Стандартные ручные процедуры с тем же количеством персонала обрабатывали максимум 200 образцов в неделю.

(ix) Пробы капиллярной крови на фильтровальной бумаге. Во многих полевых исследованиях выполняются отбор проб капиллярной крови и хранение высушенной крови на фильтровальной бумаге.Это приемлемо для небольших образцов крови, но при больших объемах сушка происходит медленнее, и вероятность заражения ДНК человека или микробов возрастает. Лейкоциты хозяина остаются в образце. Проблемы с сушкой могут быть частично решены за счет использования более толстой фильтровальной бумаги, хотя эффективность экстракции зависит от типа фильтровальной бумаги. Этот высокочувствительный метод модифицируется и проверяется для фильтровальной бумаги, но чувствительность в настоящее время в четыре-пять раз ниже, поэтому текущие спецификации относятся только к центрифугированным образцам цельной крови.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании описывается высокочувствительный и специфический метод количественной ПЦР, использующий относительно большой объем крови и позволяющий точно оценить плотность малярийных паразитов до 22 паразитов / мл крови. Метод основан на существующих протоколах (11) с использованием простых, но существенных модификаций: использование большего объема крови приводит к большему количеству ДНК плазмодия, которую можно обработать. Тем не менее, концентрация ДНК лейкоцитов хозяина также будет увеличиваться одновременно, так что тщательное удаление лейкоцитарной пленки с центрифугированного образца является предварительным условием для предотвращения помех во время обработки ПЦР.Для больших объемов крови требуется венепункция, поскольку отбор капиллярной крови> 200 мкл из пробы из пальца затруднен. Кроме того, образец укола пальца часто приводит к разбавлению интерстициальной жидкости, когда палец сжимается, и белые клетки хозяина (и, следовательно, ДНК хозяина) не могут быть удалены. Если пробирки для забора крови не используются, тогда требуется толстая фильтровальная бумага с переменной эффективностью экстракции ДНК, а неполное высыхание увеличивает риск контаминации и чрезмерного роста микробов.

Метод больших объемов показал надежность, надежность и точность. Очень высокая чувствительность метода требует тщательной осторожности во избежание загрязнения. С этой целью настоятельно рекомендуется рутинное включение стандартных положительных и отрицательных контролей низкой плотности в серии образцов, предпочтительно слепых. Калибровке и обеспечению качества будут способствовать глобальные схемы обеспечения качества, аналогичные по операциям тем, которые действуют для противомалярийных препаратов (Всемирная сеть по устойчивости к малярии [WWARN] [32]).Важное практическое применение сверхчувствительного высокопроизводительного метода — эпидемиологические обследования малярии для определения бессимптомного бремени Plasmodium среди населения с низким уровнем передачи. Представленная здесь методология в настоящее время применяется к образцам, собранным в ходе текущих исследований, для определения эпидемиологии малярии в различных регионах Юго-Восточной Азии и для планирования стратегий ликвидации. Предварительные результаты указывают на высокую частоту бессимптомного носительства паразитов низкой плотности в некоторых регионах.Обычная микроскопия или быстрые диагностические тесты обычно надежно выявляют плотность паразитов до 50 000 — 100 000 паразитов / мл, тогда как методы ПЦР с бумагой с капиллярным фильтром, обычно отбирающие 5 мкл цельной крови, позволяют обнаруживать плотность до 100 паразитов на мл. Необходимо определить точную взаимосвязь между этими различными методами обнаружения с разными пределами обнаружения, которые отражают форму распределения плотности паразитов в разных популяциях при различных эпидемиологических обстоятельствах.Если существует предсказуемая взаимосвязь между менее чувствительными методами и этим методом большого объема (33), методы с использованием фильтровальной бумаги для капиллярной крови могут быть полезной суррогатной мерой для истинной распространенности плазмодиев в популяции. Затем необходимо будет оценить и утвердить подходящую фильтровальную бумагу и методы хранения. Однако вполне вероятно, что в условиях элиминации, в которых передача малярии снижается до низких уровней, потребуются более чувствительные методы.

Некоторые дополнительные факторы могут потребовать рассмотрения при интерпретации результатов, учитывая высокую чувствительность протокола qPCR, описанного здесь.Во-первых, возможно, что ДНК малярии, выделенная из мертвых паразитов, даст положительный результат, строго говоря, ложноположительный. Это зависит от высвобожденного количества и времени, в течение которого такая ДНК сохраняется в кровотоке. Данные клинических исследований показывают, что свободная ДНК могла бы стать серьезным препятствием, только если недавние паразитемии были высоки (в пределах диапазона, определяемого микроскопией) и если образец, из которого была очищена ДНК, содержал> 10% плазмы. Маловероятно, что это создаст проблему для протокола количественной ПЦР, если плазма удалена, особенно в условиях низкого пропускания, где паразитемия, положительная при микроскопии (т.е.е.,> 50 000 паразитов / мл), вероятно, связаны с клиническими признаками. Во-вторых, высвобождение большого количества мерозоитов из печеночных шизонтов (обычно от 10 000 до 30 000 мерозоитов от каждого печеночного шизонта) может привести к циркуляции ~ 300 000 мерозоитов после синхронного разрыва 10 печеночных форм (средний инокулят спорозоитов считается примерно 10), т.е. ~ 60 паразитов / мл (более высокая плотность у детей с меньшим объемом крови), что, вероятно, даст положительный результат для протокола qPCR (чувствительность ~ 20 паразитов / мл).В районах с низкой интенсивностью передачи (<10 инфекционных укусов в год) вероятность взятия пробы точно в момент разрыва печеночного шизонта невысока. В условиях более высокой передачи, где большинство инфекций проходит самоограничение, это может стать серьезным препятствием. Наконец, для видов паразитов, у которых зрелые формы не подвергаются значительной секвестрации (не P. Falciparum), созревающий эритроцитарный шизонт может содержать до 24 геномов паразита, что будет переоценивать паразитемию, оцененную методом qPCR.

В заключение мы описываем высокочувствительный и специфический метод количественной ПЦР с большим объемом, который позволяет оценить бессимптомный резервуар паразитемических лиц с хроническими инфекциями Plasmodium очень низкого уровня, тем самым обеспечивая точную оценку эпидемиологии малярии. Применимость этого нового метода теперь потребует дальнейшей оценки в различных эндемичных по малярии условиях, особенно в тех, которые стремятся к ее ликвидации.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Мехула Дорда и Анну Марию Аннерберг за их помощь.

Это исследование было поддержано Университетом Махидол и фондом Wellcome Trust в рамках стратегической награды WT101148MA «Устранение малярии для противодействия устойчивости к артемизинину». Финансирование было также получено от Фонда Билла и Мелинды Гейтс, SIgN, и от Горизонтальной программы по инфекционным заболеваниям Агентства по науке, технологиям и исследованиям (A * STAR) (Сингапур), Программы исследований тропической медицины Оксфордского университета Wellcome Trust. .

Мы заявляем, что у нас нет конфликта интересов.

• Авторские права © 2014 Imwong et al.

Инфекция вирусом чикунгунья у доноров и пациентов крови во время вспышки, Мандалай, Мьянма, 2019 г. — Том 26, номер 11 — ноябрь 2020 г. — Журнал Emerging Infectious Diseases Journal

Aung Kyaw Kyaw ¹ , Mya Myat Ngwe Tun ¹ , Takeshi Nabeshima, Aung Min Soe, Thida, Thet Htoo Aung, Thein Thein Htwe, Su Su Myaing, Tu Tu Mar, Thida Aung, Khin Moh Moh Win, Khin Mar Мьинт, Эй Пхью Луин, Хлаинг Мьят Ту, Корасон Си Буэрано, Кьяу Зин Тан и Коуичи Морита

Принадлежность автора: Департамент медицинских исследований, Пьин Оо Лвин, Мьянма (А.К. Кьяу, А.М. Soe, Thida, T.H. Аунг, T.T. Htwe. S.S. Myaing, T.T. Mar, T. Aung, K.M.M. Win, H.M. Чт, К.З. Тан); Университет Нагасаки, Нагасаки, Япония (M.M. Ngwe Tun, T. Nabeshima, A.M. Soe, K. Morita); Больница общего профиля Мандалая, Мандалай, Мьянма (K.M.M. Win); Детская больница Мандалая на 550 коек, Мандалай, Мьянма (E.P. Lwin, K.M. Myint); Медицинский центр Святого Луки, Кесон-Сити, Филиппины (C.C. Buerano)

Чикунгунья (CHIK) — это развивающееся тропическое заболевание, вызываемое вирусом CHIK (CHIKV; семейство Togaviridae , род Alphavirus ), из которых существует 3 генотипа: азиатский, восточно-центрально-южноафриканский (ECSA) и западноафриканский. ( 1 ).Этот вирус был обнаружен в Азии в 1954 году, и было замечено, что он постоянно циркулирует в странах Южной и Юго-Восточной Азии ( 2 — 5 ). В Мьянме первый случай инфекции CHIKV был подтвержден серологически в 1973 году ( 6 ), а генотип CHIKV ECSA наблюдался у пациентов в течение 2010 года ( 7 ).

Признаки и симптомы (например, лихорадка, сыпь и сильная боль в суставах), вызванные CHIKV, аналогичны симптомам, вызываемым вирусом денге. Хотя смертельные случаи от CHIK редки, это заболевание может вызывать неврологические проявления ( 8 ).Бессимптомная частота инфицирования CHIKV составляет 10–25%. Существует риск передачи CHIKV при переливании крови ( 9 ), но инфекций, передаваемых при переливании крови, не зарегистрировано. Во многих странах, включая Мьянму, скрининг на CHIKV обычно не проводится для доноров крови.

Мы стремились определить долю доноров крови, у которых были CHIKV IgM и CHIKV РНК. Поскольку наше исследование проводилось во время вспышки инфекции CHIKV в Мьянме в 2019 году, также была определена доля детей с острым фебрильным заболеванием, инфицированных вирусом, во время планового эпиднадзора за лихорадкой денге.Мы также стремились идентифицировать генотип CHIKV для CHIKV РНК-положительных образцов.

Вспышка инфекции CHIKV произошла в Мандалае, Мьянма, в 2019 году. Было проведено перекрестное описательное исследование среди доноров крови в больнице общего профиля Мандалая и пациентов в детской больнице Мандалая. В исследование были включены 500 доноров крови и 151 пациент с острым лихорадочным заболеванием, но с отрицательным результатом на неструктурный белок 1 (NS1) вируса денге. Набирали примерно 20-25 доноров крови в неделю, и их образцы крови собирали один раз в неделю с использованием метода насыщения во время пикового сезона арбовирусной инфекции (июнь – сентябрь).Также в исследование были включены дети (<13 лет) с острым фебрильным заболеванием.

Образцы крови (2 мл) у доноров и пациентов в острой фазе заболевания были собраны после госпитализации. Отдельные образцы сыворотки крови тестировали с помощью набора QuickProfile Chikungunya IgG / IgM Combo Rapid Diagnostic Test Kit (LumiQuick, https://lumiquick.co). IgM-положительные образцы были подтверждены с помощью собственного ELISA для захвата IgM CHIKV ( 7 ).

Вирусная РНК была извлечена из объединенных образцов сыворотки (15-20 образцов / пул) доноров крови и из отдельных образцов пациентов с помощью набора для экстракции вирусной РНК (QIAGEN, https: // www.qiagen.com). Обычную одностадийную ОТ-ПЦР выполняли с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР Invitrogen (Thermofisher Scientific, https://www.thermofisher.com). Для ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) -положительных объединенных образцов вирусную РНК снова экстрагировали из отдельных образцов и проверяли с помощью стандартной ОТ-ПЦР. Случай лабораторно подтвержденной инфекции CHIKV был определен как случай с положительными результатами с помощью ОТ-ПЦР или ELISA на CHIKV IgM.

Секвенирование участков гена оболочечного белка 1 (E1) (402 п.н.) и NS1 1 (262 п.н.) CHIKV проводили с использованием метода Сэнгера с помощью генетического анализатора 3500 (Thermofisher Scientific).Мы использовали метод максимального правдоподобия с использованием PHYML версии 3.0.1 (http://www.atgc-montpellier.fr). Филогенетические деревья были построены на основе частичных нуклеотидных последовательностей 2 участков генов для штаммов CHIKV. Модель замещения была выбрана с помощью jmodeltest-2.1.7 (https://github.com), а обобщенное обратимое время плюс l была выбрана в качестве модели со значениями начальной загрузки после 1000 повторений. Деревья были нарисованы с помощью программного обеспечения Fig tree версии 1.4.2 ( 10 ). Последовательности штаммов в этом исследовании были отправлены в GenBank (инвентарные номера.MN552427–41).

Ввод данных выполнялся с помощью Microsoft Excel (https://www.microsoft.com), а анализ проводился с использованием программного обеспечения R версии 3.4.4 (https://www.r-project.org). Наш протокол был одобрен (Ethics / DMR / 2019/082) институциональным наблюдательным советом Департамента медицинских исследований Министерства здравоохранения и спорта Мьянмы.

Из 500 доноров крови 14 (2,8%, 95% C 1,7% -4,6%) были положительными по CHIKV IgM, 135 (27,0%, 95% CI 23,2-31,1%) по CHIKV IgG, 2 (0.4%, 95% ДИ 0,05–1,4%) для РНК CHIKV. Подтверждено, что у 16 ​​из 500 доноров крови (3,2%, 95% ДИ 2,0–5,1%) имеется инфекция CHIKV. Все IgM-положительные доноры крови были отрицательными на РНК CHIKV, а доноры крови, положительные на РНК CHIKV, были отрицательными при серологическом анализе. Из 151 пациента с острым фебрильным заболеванием 26 (17,2%) были положительными на РНК CHIKV, 4 (2,6%) на CHIKV IgM, 1 (0,7%) на РНК CHIKV и CHIKV IgM и 9 (5,9%) на CHIKV IgG. Используя эти данные, мы подтвердили, что 31 (20,5%, 95% ДИ 14.1% –26,9%) имели инфекцию CHIKV.

Рисунок 1

Рисунок 1. Распределение лабораторно подтвержденных случаев инфицирования CHIKV среди доноров крови, Мьянма, июнь – сентябрь 2019 г. Лабораторно подтвержденные случаи были определены как RT-PCR или положительные IgM CHIKV. CHIKV, вирус чикунгунья; ОТ-ПЦР, обратная транскрипция …

Доля подтвержденных случаев CHIKV среди доноров крови росла с июня по сентябрь: показатели распространенности составляли 1,1% в июне, 0,9% 2 июля.5% в августе и 6,3% в сентябре (p = 0,02) (рисунок 1). Среди инфицированных пациентов у 19 была острая вирусная инфекция, у 4 — неврологические проявления, и у всех доноров крови не было симптомов (таблица 1).

Рисунок 2

Рисунок 2. Филогенетические деревья, построенные на основе частичных нуклеотидных последовательностей CHIKV, чтобы показать взаимосвязь штаммов CHIKV из разных источников, включая штаммы, обнаруженные в Мьянме в течение 2019 года (звездочки) ….

Аминокислотные последовательности частичного белка E 1 заражающих штаммов CHIKV 2019 в этом исследовании не было обнаружено мутации E1: A226V (таблица 2).Однако мутация E1: K211E, которая не наблюдалась в штаммах, выделенных в Мьянме в течение 2010 г. с мутацией E1: A226V, присутствовала. Филогенетические деревья для частичных генов E1 и NS1 ( 11 ) показали, что наши штаммы вируса принадлежали к кладе генотипа ECSA в Индийском океане и были аналогичны тем, которые циркулировали в Индии и Таиланде и ранее циркулировали в Мьянме (рис. 2).

Мы показали, что 3,2% доноров крови и 20,5% детей были инфицированы CHIKV во время вспышки CHIK в Мьянме в 2019 году.В течение 2019 года в Пуэрто-Рико, США, у 2,1% доноров крови была обнаружена РНК CHIKV ( 12 ). CHIKV может быть обнаружен до 7 дней после появления симптомов. IgM может появиться на 4-й день после появления симптомов, пик на 7-й день и может сохраняться в течение 2–3 месяцев. Таким образом, если доноры крови положительны на CHIKV IgM, но не виремичны, риск передачи инфекции, передаваемой при переливании крови, невелик ( 13 ). Однако Всемирная организация здравоохранения рекомендует отложить сдачу крови лицами с подтвержденной инфекцией CHIKV на срок> 6 месяцев ( 14 ).Чтобы избежать риска инфекции, передаваемой при переливании крови, необходимо провести молекулярное тестирование на инфекцию CHIKV у доноров крови ( 11 ). Обнаружение CHIKV IgM и IgG указывает на недавние (IgM) и прошлые (IgG) инфекции CHIKV. Доноры крови, положительные на инфекцию CHIKV в этом исследовании, не имели симптомов инфекции CHIKV. Таким образом, устных вопросов об истории инфицирования доноров крови недостаточно для скрининга доноров в странах, эндемичных по болезни.

Предыдущие исследования показали, что генотипы из Азии и генотип ECSA циркулируют в Юго-Восточной Азии ( 11 ).В Таиланде, Индийском океане и Южной Африке клады генотипа ECSA были обнаружены во время вспышки в 2019 г. ( 2 ). Индоокеанская линия генотипа ECSA была представлена ​​в странах ЮВА с 2007 года ( 11 ). В нашем исследовании штаммы вируса, обнаруженные во время вспышки 2019 года в Мьянме, принадлежали к индоокеанской линии генотипа ECSA и имели близкое сходство со штаммами, циркулировавшими в 2019 году в Таиланде, которые могли быть источником CHIKV в Мьянме. Штаммы CHIKV, обнаруженные в 2010 г. в Мьянме, также принадлежали к той же кладе генотипа ECSA.Однако мутация E1: A226V в этих штаммах ( 7 ) не присутствовала в штаммах CHIKV 2019 года. Как мутантные, так и немутантные штаммы E1: A226V были изолированы в Таиланде в течение 2019 года ( 2 ). Кроме того, штаммы CHIKV в этом исследовании имели мутацию E1: K211E с фоном E1: 226A. В предыдущем исследовании сообщалось, что штаммы CHIKV с мутацией E1: K211E на фоне E1: 226A увеличивают инфекционность и передачу вируса по сравнению с немутантным парентеральным вирусом E1: 226A CHIKV ( 15 ).Наше исследование подчеркивает необходимость усиления мер инфекционного контроля и скрининга доноров крови во время вспышек CHIK.

Доктор Кьяу — научный сотрудник отдела вирусологических исследований Департамента медицинских исследований, Пьин Оо Лвин, Мьянма. Его основной научный интерес — арбовирусные инфекционные заболевания, в том числе денге, японский энцефалит, чикунгунья и лихорадка Зика.

Вершина

Мы благодарим всех сотрудников отдела вирусологических исследований Департамента медицинских исследований Пьин Оо Лвин, Мьянма, и отдела вирусологии Института тропической медицины Университета Нагасаки, Нагасаки, Япония, за поддержку во время исследования.

Это исследование было поддержано Министерством здравоохранения и спорта Республики Союз Мьянма (грант 048 Министерства исследований здравоохранения), грантом Японской инициативы по глобальной исследовательской сети по инфекционным заболеваниям Японского агентства науки и технологий (грант № JP19fm0108001) и Программа исследований возникающих и повторно возникающих инфекционных заболеваний Агентства по исследованиям и разработкам (19fk0108035h2203).

Выводы, выводы и мнения, высказанные авторами, пишущими для этого журнала, не обязательно отражают официальную позицию U.S. Министерство здравоохранения и социальных служб, Служба общественного здравоохранения, Центры по контролю и профилактике заболеваний или аффилированные с авторами учреждения. Торговые наименования используются только для идентификации и не подразумевают одобрения какой-либо из вышеперечисленных групп.