23Фев

Срб высокочувствительный повышен: С-реактивный белок, количественно (высокочувствительный метод)

Содержание

Высокочувствительный С-реактивный белок (кардио), (СРБ высокочувствительный, high sensitivity CRP, hs-CRP)

Уровень СРБ значительно повышается при инфекциях, воспалительных процессах и любом повреждении тканей. Традиционное использование теста СРБ нацелено на выявление инфекций и выраженного воспаления в организме (см. тест №43 С-реактивный белок). В таком стандартном варианте исследования используют диагностический порог СРБ

Установлено, однако, что концентрация СРБ в небольшой степени повышается также при эндогенном сосудистом вялотекущем воспалении низкого уровня активности, сопровождающем процесс развития атеросклероза сосудов. Для выявления такого персистирующего воспаления низкой степени, связываемого с повышением кардиорисков, необходимы высокочувствительные методы определения СРБ, позволяющие достаточно точно различать концентрации СРБ даже в обычно считающемся нормальным диапазоне 0,5-5 (10) мг/л. 

Исследование СРБ в этих целях следует проводить в отсутствие каких-либо недавних заболеваний, инфекций, воспаления или повреждения тканей.
При интерпретации результата СРБ, полученного в таких условиях, используют следующие критерии: уровень СРБ менее 1,0 мг/л – интерпретируется как оптимальный, 1-3 мг/л – промежуточный, а более 3 мг/л – указывающий на повышенный риск развития сердечно-сосудистых осложнений в будущем. По данным проведенных исследований, у лиц с уровнем СРБ, приближающемся к верхнему пределу стандартного диапазона нормы, потенциальный риск развития в будущем сердечно-сосудистых заболеваний ориентировочно от 1,5 до 4 раз выше, чем у лиц с значениями СРБ

Для индивидуального определения потенциального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (и их грозных осложнений — инфаркта, инсульта) применяют различные варианты подсчета факторов риска, из которых в настоящее время рекомендована и широко используется шкала SCORE. Она основана на учете возраста, пола, величины систолического артериального давления, уровня общего холестерина, факта курения (с уточнением по уровню холестерина антиатерогенных липопротеидов высокой плотности – ЛПВП).

 

Определение потенциальных сердечно-сосудистых рисков с использованием подобных систем оценки рекомендуется применять взрослым лицам старше 40 лет, за исключением тех, кого автоматически относят к группе высокого и очень высокого сердечно-сосудистого риска (пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, хронической болезнью почек или очень высокими уровнями отдельных факторов риска). Такая оценка позволяет вовремя применить нужные профилактические меры. Однако и инфаркт, и инсульт иногда неожиданно развиваются и у людей с умеренным или низким по указанным базовым факторам расчетным риском. Поэтому лицам, отнесенным в группу умеренного сердечно-сосудистого риска, для более точных оценок целесообразно определять дополнительные биомаркеры – в том числе факторы воспаления (высокочувствительный СРБ и фибриноген). Из них более широко экспертами обсуждается роль С-реактивного белка. 

Прогностическая значимость высокочувствительного исследования СРБ в оценке сердечно-сосудистых рисков ограничена тем, что его уровень в крови подвержен влиянию большого числа факторов. При выявлении признаков повышенного кардиориска в тесте высокочувствительного СРБ, его исследование целесообразно через некоторое время повторить, чтобы убедиться в том, что полученный результат не случаен. 

С какой целью определяют уровень высокочувствительного С-реактивного белка в крови  

Данное исследование является вариантом оценки уровня С-реактивного белка, предназначенным для дополнительного уточнения сердечно-сосудистых рисков у пациентов, отнесенных в группу умеренного риска по базовым факторам.  

Когда нецелесообразно определять уровень высокочувствительного С-реактивного белка в крови 

Следует понимать, что СРБ высокочувствительным (№ 1643) и СРБ стандартным (№ 43) тестами определяется один и тот же белок. При значениях СРБ выше 10 мг/л следует исключить наличие инфекционного процесса. Лицам с хроническими воспалительными заболеваниями (например, ревматоидным артритом) нецелесообразно применять высокочувствительный СРБ, поскольку уровень С-реактивного белка при этом заболевании всегда высокий, и использование высокочувствительного формата теста не имеет значения.

 

Чувствительность теста (нижний предел определения): 0,1 мг/л.

Литература

Основная литература:

  1. Бойцов С. А. и др. Кардиоваскулярная профилактика 2017. Российские национальные рекомендации. Российское кардиологическое общество, Национальное общество профилактической кардиологии, Российское общество профилактики неинфекционных заболеваний //Российский кардиологический журнал. – 2018. – №. 23 (6). 
  2. Ежов М. В. и др. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации VI пересмотр //Атеросклероз и дислипидемии. – 2017. – №. 3. – С. 5-22.
  3. Catapano A. L. et al. 2016 ESC/EAS guidelines for the management of dyslipidaemias //European heart journal. – 2016. – Т. 37. – №. 39. – С. 2999-3058.
  4. CDC/AHA Workshop on Markers of Inflammation and Cardiovascular Disease Application to Clinical and Public Health Practice Report From the Laboratory Science Discussion Group. Circulation. 2004;110:e545– e549.
  5. Protein. Learning guide series. Abbott Diagnostics (материалы фирмы производителя реагентов)

Повышенные уровни С-реактивного белка у пациентов с COVID-19

Уважаемые коллеги!

Несмотря на то, что С-реактивный белок (СРБ) является ранним маркером воспаления, возникающего при инфекции, и его уровни обычно значительно не увеличивается при вирусной респираторной инфекции, у тяжело больных пациентов с COVID-19 наблюдалось значительное увеличение значений СРБ. Это согласуется с наблюдениями, сделанными во время ОРВИ эпидемии в 2003 году у пациентов с птичьим гриппом h2N1 и H7N9 [1]. Одной из возможных причин является перепроизводство воспалительных цитокинов, которые участвуют в защите возбудителя. Цитокины могут быть причиной более серьезных симптомов и повреждения альвеолы, и тем самым стимулировать выработку СРБ. [2-4] По этой причине исследование уровня СРБ полезно в раннем обследовании пациентов с коронавирусом.

Исследования пациентов с COVID-19 показали, что уровни СРБ напрямую коррелируют с тяжестью и прогрессированием заболевания. Недавно опубликованное исследование [5] показало, что низкие уровни СРБ часто встречаются как у пациентов, которым не требуется кислород (среднее значение 11 мг/ л, межквартильный диапазон 1-20 мг/л) так и у пациентов, у которых развилась гипоксемия (среднее значение 66 мг/л, интерквартильный диапазон 48-98 мг/л).

Другое исследование [6] было сосредоточено на изучении предикторов (to predict – предсказывать) летального исхода в случаях COVID-19. В этом исследовании было показано, что повышенные воспалительные маркеры в крови являются хорошими предикторами при COVID-19. Сравнение уровней СРБ с риском смертности показало, что у выживших пациентов средний уровень СРБ составлял ~ 40 мг/л, в то время как у умерших — в среднем 125 мг/л.

Информация для заказа:

Каталожный номер

Используемый анализатор

С-реактивный белок (CRP FS)

производства DiaSys Diagnostic System GmbH

1 7002 99 10 935

Открытые системы

1 7002 99 10 962

ВМ6010/С

D 1 7002 99 10 935

Серия DIRUI CS

F 1 7002 99 10 935

Серия FURUNO СА

1 7002 99 10 920

Respons 910

СРБ-ИММУНОТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ ДДС

производства АО «ДИАКОН-ДС»

20 602

Clima MC-15

С-реактивный белок универсальный / высокочувствительный (CRP U-hs)

производства DiaSys Diagnostic System GmbH

1 7045 99 10 930

Открытые системы

D 1 7045 99 10 930

Серия DIRUI CS

F 1 7045 99 10 930

Серия FURUNO СА

1 7045 99 10 920

Respons 910


Литература:

[1] N. Chen u. a., „Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study“, Lancet Lond. Engl., Bd. 395, Nr. 10223, S. 507–513, 15 2020, doi: 10.1016/S0140-6736(20)30211-7.

[2] D. Vasileva und A. Badawi, „C-reactive protein as a biomarker of severe h2N1 influenza“, Inflamm. Res. Off. J. Eur. Histamine Res. Soc. Al, Bd. 68, Nr. 1, S. 39–46, Jan. 2019, doi: 10.1007/s00011-018-1188-x.

[3] W. Wu u. a., „A new perspective on C-reactive protein in H7N9 infections“, Int. J. Infect. Dis. IJID Off. Publ. Int. Soc. Infect. Dis., Bd. 44, S. 31–36, März 2016, doi: 10.1016/j.ijid.2016.01.009.

[4] K.-J. Huang u. a., „An interferon-gamma-related cytokine storm in SARS patients“, J. Med. Virol., Bd. 75, Nr. 2, S. 185–194, Feb. 2005, doi: 10.1002/jmv.20255.

[5] B. E. Young u. a., „Epidemiologic Features and Clinical Course of Patients Infected With SARS-CoV-2 in Singapore“, JAMA, März 2020, doi: 10. 1001/jama.2020.3204.

[6] Q. Ruan, K. Yang, W. Wang, L. Jiang, und J. Song, „Clinical predictors of mortality due to COVID-19 based on an analysis of data of 150 patients from Wuhan, China“, Intensive Care Med., März 2020, doi: 10.1007/s00134-020-05991-x.

Сдать анализ крови на С-реактивный белок (СРБ) в лаборатории KDL

С–реактивный белок (СРБ) — информативный показатель текущего воспалительного процесса в организме. Этот белок синтезируется печенью и является одним из маркеров острой фазы воспаления. Уровень СРБ в крови может повыситься в течение нескольких часов после начала инфекционного заболевания, травмы или в первые часы после операции. СРБ быстро реагирует на изменение динамики болезни, при выздоровлении быстро возвращается к норме.

В каких случаях назначают исследование С- РБ?

Анализ крови на С-реактивный белок обычно назначают, если есть признаки воспаления любой природы (причиной воспаления может быть вирусная или бактериальная инфекция, аутоиммунное заболевание или воспалительное заболевание кишечника). Этот тест обычно используется вместе с клиническим анализом крови. СРБ более специфичный показатель воспаления, чем СОЭ и более подвижный. Обычно при устранении причины повреждения тканей или успешном лечении инфекции он приходит в норму в течение 1-2 суток. В то же время СОЭ (скорость оседания эритроцитов) может оставаться повышенной еще длительное время. Повышение СРБ в течение продолжительного времени может наблюдаться у пациентов с ревматическими и другими аутоиммунными заболеваниями.

Для оценки риска сердечно — сосудистых событий используется тест «С — реактивный белок, ультрачувствительный».

Что именно определяется в процессе анализа?

Определяется концентрация С- реактивного белка с использованием антител к человеческому С- реактивному белку (метод основан на реакции «антиген- антитело»).

Что означают результаты теста?

Повышение концентрации С — РБ в крови может быть признаком бактериальной инфекции. Токсины бактерий – мощный активатор синтеза С- реактивного белка. Также этот маркер повышается при любом повреждении тканей (бытовой травме, операционной травме, ожогах), а также обычно повышен при инфаркте миокарда и при аутоиммунных заболеваниях. Степень повышения СРБ связана с объемом пораженных тканей или активностью воспалительного процесса. Так как это общий маркер воспаления, то оценивать его уровень надо с учетом данных других методов исследования и истории болезни пациента.

Обычный срок выполнения теста

Результат анализа крови на СРБ можно получить в течение 1-2 дней

Нужна ли специальная подготовка к анализу?

Специальной подготовки не требуется. Подробнее в разделе «Подготовка».

С-реактивный белок человека ультрачувствительный (CRP) – Bialexa

Описание и функции С-реактивного белка (CRP)

С-реактивный белок (СРБ) был впервые обнаружен исследователями Тиллетт и Францис в 1930 году в качестве элемента сыворотки крови больных с острыми воспалительными процессами, вступающего в реакцию с C-полисахаридом пневмококка. СРБ человека принадлежит к очень консервативной семье белков под названием «пентраксины», которая характеризуется наличием кальций-зависимого связывания лигандов и радиальной симметрией пяти мономеров, образующих кольцо вокруг центральной поры. Молекула СРБ состоит из 224 остатков аминокислот с молекулярной массой мономера порядка 25 кДа и pI 6,4. Мономеры нековалентно связаны и образуют пентамерную структуру (Рис. 1).

В течение многих десятилетий СРБ был известен в качестве белка, синтезируемого в печени. Тем не менее, последние исследования свидетельствуют о существенном уровне экспрессии СРБ в других тканях, в том числе в стенках кровеносных сосудов и в гладкомышечных клетках коронарных артерий, где, согласно предположениям ученых, СРБ представлен в виде мономера (mCRP), в то время как нативный пентамерный белок (nCRP) содержится преимущественно в плазме.

Точная функция СРБ в организме человека до сих пор вызывает многочисленные дискуссии. Было установлено, что указанный белок принимает участие в воспалительных, а также во врожденных иммунологических процессах организма. Важными элементами биологической активности СРБ являются его способность с высоким уровнем аффинности связывать различные лиганды, в том числе поврежденные клеточные мембраны, апоптотические клетки, фибронектин и т.д., с остатками фосфохолина. Лиганд-связанный СРБ может распознаваться С1q-компонентом комплемента, что является классическим путем активации комплемента. В ходе взаимодействия с фактором Н комплемента, СРБ выступает в качестве регулятора альтернативного пути комплемента.

Рис. 1. Структура С–реактивного белка.

Использование С-реактивного белка на практике

В клинической практике С-реактивный белок рассматривается в качестве основного, хотя и достаточно неспецифичного, маркера воспаления. Он относится к так называемым «белкам острой фазы» (БОФ), которые появляются в крови в ответ на какое-либо повреждение тканей организма, вызванное инфекцией, воспалением, опухолевым ростом, травмой и другими факторами. СРБ классифицируют как белок «сильной» подгруппы: его содержание в крови может повышаться в тысячи раз, в отличие от слабых БОФ. Кроме того, время появления С-реактивного белка составляет от 6 до 12 часов, тогда как белки слабой подгруппы можно определить в крови только через 48-72 часа. Это делает его чрезвычайно эффективным маркером, если говорить о времени выявления патологий.

Как правило, у относительно здоровых людей, содержание СРБ составляет менее 5 мг/л. При наличии патологий концентрация СРБ может находиться в пределах огромного, 10000-кратного диапазона (примерно 0,05-500 мг/л). Различают несколько уровней его содержания в крови:

  • отрицательный — до 3,0 мг/л,
  • C-реактивный белок слабоположительный — 3,0 — 6,0 мг/л,
  • положительный — 6,0 — 12,0 мг/л,
  • СРБ резко положительный — от 12,0 мг/л и выше.

Самые высокие уровни содержания СРБ (выше 30 мг/л) наблюдаются при наличии бактериальных инфекций, таких как септический артрит, менингит и пневмония. При вирусных инфекциях уровень белка гораздо ниже, что позволяет использовать количественный анализ для дифференциации этих двух инфекций. Умеренно высокая концентрация СРБ, примерно 10-40 мг/л, была обнаружена у пациентов, перенесших инфаркт миокарда и страдающих от иных повреждений тканей.

C-реактивный белок (CRP) используется для диагностики воспалений наряду с таким показателем, как СОЭ (скорость оседания эритроцитов). Однако исследование CRP позволяет установить воспаление раньше, так как его уровень повышается прежде, чем изменяется СОЭ.

Рост содержания СРБ (с-реактивного белка) в крови наблюдается не только при воспалениях бактериального и вирусного происхождения, но и при любых повреждениях тканей, в том числе некрозах, опухолях, паразитарных инфекциях, что существенно расширяет его использование в диагностике. Кроме того, благодаря широкому диапазону значений, и корреляции с показателем СОЭ можно провести сравнительно точную дифференциацию типа заболевания.

В 2003 году Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) и Американская ассоциация кардиологов (AHA) выступили с заявлением, в котором признали СРБ наиболее эффективным маркером воспаления, рекомендованным к использованию в современной клинической практике для оценки сердечно-сосудистых рисков. Многочисленные эпидемиологические исследования показали, что СРБ является сильным независимым предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений, в том числе инфаркта миокарда, ишемического инсульта, заболевания периферических сосудов и внезапной сердечной смерти в отсутствии известных сердечно-сосудистых заболеваний (согласно обзору «Clearfield»).

Рекомендации Центра по контролю и профилактике заболеваний США и Американской ассоциации кардиологов предписывают использование СРБ для первичной профилактики и установления предельных пороговых точек в соответствии с категориями относительно риска: низкий риск (<1,0 мг/л), средний риск (1,0-3,0 мг/л), и высокий риск (> 3,0 мг/л). В связи с этим используемые в настоящее время высокочувствительные методы измерения концентрации СРБ (hsCRP) позволяют определить его содержание, измеряемое нанограммами на миллилитр (нг/мл). Аббревиатура hsCRP (high sensitivity CRP, C-реактивный белок ультрачувствительный) получила всеобщее признание и повсеместное распространение для обозначения белка, обнаруженного в результате таких исследований. Исследователи пришли к выводу о наличии существенной взаимосвязи между содержанием hsCRP в плазме крови и риском смерти у пациентов с острым коронарным синдромом. Кроме того, Кёниг и соавторы утверждают, что повышенная концентрация циркулирующего hsCRP свидетельствует о высоком риске смерти от ряда распространенных хронических заболеваний.

Моноклональные антитела к CRP компании Биалекса

Новейший количественный иммуноферментный анализ с использованием уникальных произведенных компанией Биалекса моноклональных антител характеризуется высоким уровнем чувствительности и имеет линейный диапазон детектирования в пределах от 0,025 мг/л до 2,5 мг/л при проведении магнитного биосенсорного анализа; от 0,01 мг/л до 50 мг/л при проведении количественного иммунохемилюминесцентного анализа (в обоих типах исследований предел обнаружения составляет 0,004 мг/л). При проведении сэндвич ELISA с использованием нанокристаллов был достигнут предел обнаружения 0,0011 мг/л. Обнаруженные нами наиболее эффективные пары моноклональных антител (4С6 — 5Е9 и 5B8 — 3C5, а также некоторые другие) обладают 10000-кратным диапазоном линейности при проведении экспериментальных ИФА. Комбинации указанных антител могут использоваться для проведения hsCRP-исследований на базе различных диагностических платформ. В традиционных СРБ-исследованиях зачастую используются методы турбидиметрии и конкурентного анализа, для которых предпочтительным считается применение моноклональных антител с относительно низкой аффинностью. Для удобства наших клиентов мы разработали моноклональные антитела с различным уровнем аффинности, что позволяет использовать такие антитела для проведения различных типов иммунологических исследований.

В молекуле нативного СРБ каждый протомер скоординирован двумя ионами Ca2+. Компания Биалекса предлагает моноклональные антитела к СРБ как чувствительные, так и нечувствительные к отсутствию Ca2+ в растворе. Некоторые антитела распознают антигены только в присутствии ионов Ca2+ (моноклональные антитела 3B6, 4B7). Большинство предлагаемых компанией Биалекса моноклональных антител нечувствительны к присутствию ионов Ca2+ при проведении иммунологических исследований сэндвич-методом и способны эффективно распознавать антигены даже при наличии ЭДТА в исследуемом образце (моноклональные антитела 11E12, 4C6, 5B8, 5E9, 5H6, 1C1, 3C10, 3С6, 10C3, 3C5, 16С9). Все моноклональные антитела к СРБ компании Биалекса прошли испытания в рамках различных иммунологических применений.

Также компания Биалекса предлагает нативный C-реактивный белок для инвитро-диагностики, иммунологических и биохимических исследований, с чистотой более 95% (по результатам ДСН-электрофореза). СРБ используется в качестве стандарта для иммуноанализа, а также как антиген для получения сыворотки, содержащей соответствующие антитела и применяемой в дальнейших исследованиях.

Цена на C-реактивный белок оговаривается индивидуально, для уточнения позвоните по номеру, указанному на сайте.

Моноклональные антитела к С-реактивному белку

С-реактивный белок (CRP)



Высокочувствительный С-реактивный белок (кардио), (СРБ высокочувствительный, high sensitivity CRP, hs-CRP)

Синонимы: С-реактивный белок ультрачувствительный; СРБ кардио; СРБ.  

High-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), quantitative; Cardio CRP; High-sensitivity CRP; Ultra-sensitive CRP. 

Краткая информация об исследовании Высокочувствительный С-реактивный белок  

Уровень СРБ значительно повышается при инфекциях, воспалительных процессах и любом повреждении тканей. Традиционное использование теста СРБ нацелено на выявление инфекций и выраженного воспаления в организме (см. тест №43 С-реактивный белок). В таком стандартном варианте исследования используют диагностический порог СРБ <5 мг/л или <10 мг/л, превышение которого указывает на наличие значимого воспаления или инфекции, или повреждения тканей разного происхождения.  

Установлено, однако, что концентрация СРБ в небольшой степени повышается также при эндогенном сосудистом вялотекущем воспалении низкого уровня активности, сопровождающем процесс развития атеросклероза сосудов. Для выявления такого персистирующего воспаления низкой степени, связываемого с повышением кардиорисков, необходимы высокочувствительные методы определения СРБ, позволяющие достаточно точно различать концентрации СРБ даже в обычно считающемся нормальным диапазоне 0,5-5 (10) мг/л.  

Исследование СРБ в этих целях следует проводить в отсутствие каких-либо недавних заболеваний, инфекций, воспаления или повреждения тканей. При интерпретации результата СРБ, полученного в таких условиях, используют следующие критерии: уровень СРБ менее 1,0 мг/л – интерпретируется как оптимальный, 1-3 мг/л – промежуточный, а более 3 мг/л – указывающий на повышенный риск развития сердечно-сосудистых осложнений в будущем. По данным проведенных исследований, у лиц с уровнем СРБ, приближающемся к верхнему пределу стандартного диапазона нормы, потенциальный риск развития в будущем сердечно-сосудистых заболеваний ориентировочно от 1,5 до 4 раз выше, чем у лиц с значениями СРБ < 1,0 мг/л. 

Для индивидуального определения потенциального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (и их грозных осложнений — инфаркта, инсульта) применяют различные варианты подсчета факторов риска, из которых в настоящее время рекомендована и широко используется шкала SCORE. Она основана на учете возраста, пола, величины систолического артериального давления, уровня общего холестерина, факта курения (с уточнением по уровню холестерина антиатерогенных липопротеидов высокой плотности – ЛПВП). 

Определение потенциальных сердечно-сосудистых рисков с использованием подобных систем оценки рекомендуется применять взрослым лицам старше 40 лет, за исключением тех, кого автоматически относят к группе высокого и очень высокого сердечно-сосудистого риска (пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, хронической болезнью почек или очень высокими уровнями отдельных факторов риска). Такая оценка позволяет вовремя применить нужные профилактические меры. Однако и инфаркт, и инсульт иногда неожиданно развиваются и у людей с умеренным или низким по указанным базовым факторам расчетным риском. Поэтому лицам, отнесенным в группу умеренного сердечно-сосудистого риска, для более точных оценок целесообразно определять дополнительные биомаркеры – в том числе факторы воспаления (высокочувствительный СРБ и фибриноген). Из них более широко экспертами обсуждается роль С-реактивного белка. 

Прогностическая значимость высокочувствительного исследования СРБ в оценке сердечно-сосудистых рисков ограничена тем, что его уровень в крови подвержен влиянию большого числа факторов. При выявлении признаков повышенного кардиориска в тесте высокочувствительного СРБ, его исследование целесообразно через некоторое время повторить, чтобы убедиться в том, что полученный результат не случаен. 

С какой целью определяют уровень высокочувствительного С-реактивного белка в крови  

Данное исследование является вариантом оценки уровня С-реактивного белка, предназначенным для дополнительного уточнения сердечно-сосудистых рисков у пациентов, отнесенных в группу умеренного риска по базовым факторам.  

Когда нецелесообразно определять уровень высокочувствительного С-реактивного белка в крови 

Следует понимать, что СРБ высокочувствительным (№ 1643) и СРБ стандартным (№ 43) тестами определяется один и тот же белок. При значениях СРБ выше 10 мг/л следует исключить наличие инфекционного процесса. Лицам с хроническими воспалительными заболеваниями (например, ревматоидным артритом) нецелесообразно применять высокочувствительный СРБ, поскольку уровень С-реактивного белка при этом заболевании всегда высокий, и использование высокочувствительного формата теста не имеет значения.  

Чувствительность теста (нижний предел определения): 0,1 мг/л.


Правила подготовки к исследованию на определение уровня высокочувствительного С-реактивного белка в крови

Взятие крови предпочтительно проводить утром натощак, после 8-14 часов ночного периода голодания (воду пить можно), допустимо днем через 4 часа после легкого приема пищи. 

Взятие крови для высокочувствительного исследования СРБ в целях дополнительной оценки сердечно-сосудистых рисков следует проводить в отсутствие каких-либо недавних заболеваний, инфекций, воспаления или повреждения тканей. Для остальных ситуаций см.тест № 43 С-реактивный белок.


В каких случаях проводят анализ крови на высокочувствительный С-реактивный белок

В дополнение к тестам липидного профиля для уточнения потенциальных сердечно-сосудистых рисков у лиц с умеренным риском при оценке по шкале SCORE.


Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Трактовка результатов исследования крови на высокочувствительный С-реактивный белок

Единицы измерения: мг/л.

Референсные значения: 0,1 мг/л-16160 мг/л. 

Интерпретация результатов (для целевой группы взрослых – см. Описание, Показания к назначению) 

При соблюдении указаний по подготовке к исследованию СРБ высокочувствительным методом в целях дополнительной оценки кардиорисков (см. разделы «Описание» и «Подготовка к исследованию») интерпретация результата СРБ (высокочувствительный) следующая: менее 1,0 мг/л – низкий риск, 1-3 мг/л – средний риск, концентрация более 3 мг/л – указывает на повышенный риск развития сердечно-сосудистых осложнений в будущем. 

В случае выявления признаков повышенного риска исследование СРБ высокочувствительным методом целесообразно повторить через некоторое время для исключения случайных причин. При уровне СРБ выше 10 мг/л следует исключить инфекционный процесс. См. также информацию по интерпретации к тесту № 43 С-реактивный белок (стандартный).  

Влияние лекарственных препаратов: нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (аспирин, ибупрофен и пр. ), статины снижают уровень СРБ (поскольку снижают активность воспаления).


С-реактивный белок (СРБ, CRP) — цена анализа в Минске в ИНВИТРО

Исследуемый материал Сыворотка крови

Метод определения Иммунотурбидиметрический (нижний предел обнаружения — 0,25 мг/л).

Белок острой фазы, самый чувствительный и самый быстрый индикатор повреждения тканей при воспалении, некрозе, травме.

С-реактивный белок получил свое название из-за способности вступать в реакцию преципитации с С-полисахаридом пневмококков (один из механизмов ранней защиты организма от инфекции). СРБ стимулирует иммунные реакции, в т. ч. фагоцитоз, участвует во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов, активирует классическую систему комплемента. Синтезируется преимущественно в гепатоцитах, его синтез инициируется антигенами, иммунными комплексами, бактериями, грибами, при травме (через 4 — 6 часов после повреждения). В сыворотке здорового человека отсутствует.

Концентрация С-реактивного белка в крови имеет высокую корреляцию с активностью заболевания, стадией процесса. Уровень СРБ быстро и многократно увеличивается при воспалениях различной природы и локализации, паразитарных инфекциях, травмах и опухолях, сопровождающихся воспалением и некрозом тканей.

Тест на СРБ чаще всего сравнивают с СОЭ (скорость оседания эритроцитов). Оба показателя резко возрастают в начале заболевания, но СРБ появляется и исчезает раньше, чем изменяется СОЭ.

При успешном лечении уровень СРБ снижается в течение последующих дней, нормализуясь на 6 — 10 сутки, в то время как СОЭ снижается только спустя 2 — 4 недели.

Таким образом, быстрая нормализация уровня СРБ позволяет использовать этот тест для наблюдения за течением болезни и контроля эффективности лечения. При любых заболеваниях, либо после операции присоединение бактериальной инфекции, будь то местный процесс или сепсис, сопровождается повышением уровней белков острой фазы.

На содержание СРБ не оказывают влияния гормоны, в том числе при беременности, с переходом в хроническую стадию заболевания уровень С-реактивного белка снижается до полного его исчезновения и вновь возрастает при обострении процесса. Уровень СРБ при вирусной и спирохетной инфекции возрастает незначительно, поэтому при отсутствии травмы высокие значения его в сыворотке указывают на наличие бактериальной инфекции. У новорожденных СРБ может использоваться для диагностики сепсиса. После оперативного вмешательства уровень этого показателя возрастает, но при отсутствии бактериальной инфекции послеоперационном периоде он быстро нормализуется. А присоединение бактериальной инфекции (местный процесс или сепсис) сопровождается ростом СРБ или отсутствием его снижения.

За последнее десятилетие были разработаны высокочувствительные методы определения СРБ (< 0,5 мг/л). С такой чувствительностью может улавливаться изменение СРБ не только в условиях острого, но также и хронического, низкой степени выраженности эндогенного воспаления. Показано, что повышение СРБ даже в интервале концентраций < 10 мг/л и пограничных с верхней границей нормы значений у кажущихся здоровыми людей говорит о повышенном риске развития атеросклероза, а также первого инфаркта, тромбоэмболий.

Информативность показателя СРБ, определённого чувствительными методами, в этом плане, по некоторым данным, выше, чем определение холестерина липопротеинов низкой плотности. Риск сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с увеличенным СРБ возрастает при параллельно увеличенных других факторах риска (холестерине, фибриногене, гомоцистеине и др.).

Иммуноферментные методы в диагностике хронического синусита и хронического тонзиллита

Обследованы 156 пациентов с хроническим синуситом и хроническим тонзиллитом декомпенсированной формы, находившихся на стационарном лечении. Больные были разделены на четыре группы. Первую группу составил 41 больной хроническим полисинуситом, вторую – 34 пациента с хроническим тонзиллитом, третью – 38 больных хроническим гнойным синуситом, четвертую – 43 пациента с паратонзиллярным абсцессом. Все пациенты были обследованы, согласно стандартам оказания медицинской помощи по соответствующим нозологиям. Дополнительно проведены исследование на высокочувствительный С-реактивный белок (СРБ) и исследование Д-димера иммуноферментным методом. Показана динамика взаимосвязанных высокочувствительных показателей (СРБ и Д-димера), являющихся отражением взаимосвязанных процессов воспаления и гемостаза у больных хроническим синуситом и хроническим тонзиллитом.

Таблица 1. Распространенность повышенных значений СРБ (≥ 10 мг/л) больных ХС и ХТ

Таблица 2. Показатели СРБ (мг/л) при воспалительном диапазоне ≥ 10 мг/л

Рис. 1. Концентрация СРБ

Таблица 3. Повышенные значения Д-димера (> 250 нг/мл)

Таблица 4. Показатели Д-димера (нг/мл) (диапазон значений у здоровых доноров ≥ 0–250 мг/л)

Рис. 2. Концентрация Д-димера

Актуальность

Среди всех нозологических форм в структуре заболеваемости поликлинического и стационарного звена основную долю составляют заболевания околоносовых пазух [1–3] и небных миндалин [4]. Обращаемость по поводу хронического полипозного синусита составляет 3,7–5,8 на 10 тыс. человек [1]. На хронический тонзиллит (ХТ) приходится 23,7% всех заболеваний глотки [4]. Среди ургентных патологий глотки паратонзиллярные абсцессы (ПА) занимают первое место [5].

В настоящее время в отношении патогенеза хронического синусита (ХС) и ХТ остается много спорных и неясных вопросов. Поскольку существуют лимфогенные связи небных миндалин с другими органами, не исключено распространение токсических, метаболических, иммунореактивных, аллергических факторов с небных миндалин [4, 6]. Классификация ХТ Б.С. Преображенского и В.Т. Пальчуна объясняет токсико-аллергический характер заболевания, обусловленный в основном наиболее изученным этиологическим фактором данного заболевания – бета-гемолитическим стрептококком группы А [4, 6]. С этим возбудителем связано большинство описанных и доказанных метатонзиллярных осложнений: ревматизм, миокардит и заболевания клапанного аппарата сердца, нефропатия, обусловленная иммуноглобулином (Ig) А [4, 6, 7].

В патогенезе ХС, особенно полипозной формы, также много неясных моментов. Существует несколько теорий образования полипов в полости носа: инфекционная, в том числе грибковая, аллергическая. До сих пор не понятно, полипозный синусит – самостоятельное заболевание или проявление атопических системных заболеваний [4]. У каждой теории есть сторонники. В ряде исследований изучали роль гуморального и клеточного иммунитета при этом заболевании.

ХС и ХТ не являются очаговой патологией [8]. В литературе по оториноларингологии, касающейся лабораторной диагностики, в основном освещены вопросы определения уровней Ig, цитокинов в секрете слизистой оболочки и крови, показателей общеклинического анализа крови, антистрептолизина-О, ревматоидного фактора, С-реактивного белка (СРБ) (пентамера) [2, 4, 6].

Анализ крови на цитокины выполняет далеко не каждая лаборатория городской или районной больницы. Показатели общего анализа крови информативны лишь при явном гнойном процессе. При вялотекущем хроническом воспалении в околоносовых пазухах или небных миндалинах такой анализ неинформативен [9]. Например, уровень антистрептолизина-О повышается в ответ на перенесенную инфекцию, реакция проявляется только на 7–9-й день заболевания [10]. Что касается острофазовых показателей воспаления, обычно подтверждающих бактериальную инфекцию, часто ориентируются на уровни фибриногена, СРБ (пентамера) [10, 11]. Но методика определения данных показателей не совсем точна по сравнению с иммуноферментными методами исследования, например, высокочувствительного СРБ (мономера). Уровень высокочувствительного СРБ в крови увеличивается через 6–8 часов от начала заболевания и достаточно быстро снижается, что свидетельствует об эффективности назначенного лечения и может способствовать ранней диагностике, дифференциальной диагностике при указанных нозологических формах [12].

Активация свертывания крови тесно связана с воспалением и необходима для ограничения очага инфекции или инфекционных агентов путем окружения их фибриновыми микросгустками [13–15].

Нарушение гемостаза при гнойно-септическом процессе сопровождается усилением фибринообразования, снижением активности естественных антикоагулянтов, а также подавлением системы фибринолитического потенциала [13–15]. При этом имеет место и определенная динамика медиаторов и маркеров воспалительных реакций – цитокинов. Провоспалительные цитокины среди прочих функций стимулируют активацию гемостаза за счет экспрессии тканевого фактора, угнетения антикоагулянтных и фибринолитических систем крови [13–15].

Особенности течения гемостатических реакций при хронических патологиях околоносовых пазух и небных миндалин недостаточно освещены в литературе, отсутствуют ориентиры, позволяющие прогнозировать тяжесть течения данной патологии. Отсутствуют работы, посвященные ранней и чувствительной диагностике, прогнозированию течения ХС, в том числе хронического гнойного синусита (ГС), ХТ, ПА одновременно по показателям СРБ и Д-димера.

Проблема лечения больных ХС, ХТ и ПА остается крайне актуальной в оториноларингологии [3–8]. Это обусловлено общей тенденцией роста заболеваемости ХТ и ХС, неэффективностью лечения, высокой частотой рецидивирования, а также незначительным количеством исследований роли сопряжения гемостатических реакций и воспаления в генезе заболевания [3–8, 15–18].

Целью исследования стала оценка показателей и связи между Д-димером и С-реактивным белком при хроническом полисинусите (ХП), ГС, ХТ и ПА.

Материал и методы

Проведено клинико-лабораторное обследование 156 пациентов (67 (42,9%) мужчин, 89 (57,1%) женщин) с хроническим синуситом и хроническим тонзиллитом декомпенсированной формы и паратонзиллярным абсцессом, находившихся на стационарном лечении в Тамбовской городской клинической больнице № 3. Больные были разделены на четыре группы. Первую составил 41 больной ХП (средний возраст – 44,9 ± 3,2 года), вторую – 34 пациента с ХТ (средний возраст – 40,3 ± 3,2 года), третью – 38 больных ГС (средний возраст – 25,6 ± 1,4 года), четвертую – 43 пациента с ПА (средний возраст – 33,6 ± 1,9 года). В контрольную группу вошли 20 здоровых добровольцев (средний возраст – 26,5 ± 2,01 года).

Критериями исключения из исследования послужили:

  • наличие бронхиальной астмы, сахарного диабета, заболеваний крови и системных заболеваний;
  • применение любых препаратов, влияющих на гемостаз;
  • наличие вирусных гепатитов (В, С) и ВИЧ-инфекции;
  • установленная в анамнезе почечная и печеночная недостаточность;
  • беременность.

Всем участникам исследования выполнен забор крови из локтевой вены в две вакуумные системы (для получения сыворотки и плазмы) в первые сутки поступления в стационар. Определение уровней СРБ и Д-димера проводилось иммуноферментным методом с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) на иммуноферментном микропланшетном анализаторе INFINITE F50 (Tecan, Австрия).

Статистическую обработку данных при оценке результатов лабораторного исследования проводили с помощью пакета программ Statistica 6. 0. Частоту встречаемости рассчитывали прямым подсчетом и выражали в процентах. Уровни определяемых показателей описывали с помощью медианы и интерквартильного размаха (Me [25%; 75%]). Достоверность различий показателей между группами оценивали по непараметрическому U-критерию Манна – Уитни. За норму принимали предлагаемые нормативы для соответствующих наборов и методов. Статистически значимыми считали различия при 0,05 уровне вероятности безошибочного суждения (p

Результаты и обсуждение

СРБ и фибриноген относятся к белкам острой фазы, роль которых заключается в ограничении очага повреждения, удалении повреждающих факторов, восстановлении нарушенной структуры. СРБ  – «главный белок» острой фазы, уровень которого при повреждении возрастает в первые 6–8 часов, причем весьма значительно (в 20–100 раз и больше) [12, 14–16].

Для определения роли воспаления в генезе гнойно-септических осложнений при ХС и ХТ изучались концентрации СРБ в сыворотке крови пациентов с данными патологиями.

СРБ – центральный компонент двух типов воспалительных процессов. Первый тип – воспалительный процесс, связанный с системными инфекционными процессами, некрозом тканей, опухолевыми заболеваниями. При этом уровень СРБ находится в так называемом воспалительном диапазоне ≥ 10 мг/л. Уровень СРБ, достигший указанного значения, свидетельствует о тяжести системного воспаления. Второй тип воспалительной реакции, которую отражает вялотекущий воспалительный процесс, происходящий в эндотелии и обусловленный атерогенезом, как правило, не связан с инфекциями. Высокочувствительный диапазон СРБ – от 0,05 до 10,0 мг/л. В настоящем исследовании данный показатель использовали в качестве раннего маркера – предиктора острого воспалительного процесса [12].

Частота встречаемости высоких значений СРБ в воспалительном диапазоне представлена в табл. 1. Как видим, частота встречаемости острофазовых концентраций СРБ в группах ХП, ХТ и ГС практически не отличалась. Вместе с тем у пациентов с ПА (четвертая группа) высокие уровни СРБ регистрировались в 4,1–5,2 раза чаще, чем в группах 1–3. В целом среди всех обследованных пациентов частота встречаемости острофазовых значений СРБ составила 33,3% (каждый третий пациент). Подобная динамика уровней СРБ в сыворотке крови свидетельствует об острофазовом ответе у ряда пациентов, особенно при ПА, на фоне гнойного процесса и некроза тканей.

Анализ концентраций СРБ показал значительные различия между группами (табл. 2).

При хронических процессах у пациентов с ХП (первая группа) имели место более высокие концентрации СРБ по сравнению с пациентами контрольной группы (рис. 1).

У пациентов с ХТ (вторая группа) не выявлено достоверных отличий ни с пациентами контрольной группы, ни с пациентами первой группы. Высокие концентрации СРБ при ПА в четвертой группе достоверно отличались от таковых у обследуемых контрольной группы, пациентов с ХП, ХТ, ГС (табл. 2, рис. 1). Это еще раз доказывает информативность данного показателя как наиболее чувствительного клинико-лабораторного индикатора воспаления, бактериального инфекционного процесса и некроза. СРБ, как и большинство белков острой фазы, характеризуется неспецифичностью по отношению к первопричине воспаления и высокой корреляцией их концентрации в крови с тяжестью заболевания и его стадией. Сказанное означает, что СРБ более точный и надежный маркер воспаления, чем, например, скорость оседания эритроцитов, подсчет относительного количества лейкоцитов и сдвиг лейкоцитарной формулы. Ранее нами было показано, что лейкоцитарные показатели общего анализа крови (количество лейкоцитов, относительное количество лейкоцитов, входящее в лейкоцитарную формулу) имели патологически высокие значения при выраженных гнойно-септических осложнениях в виде ПА [9]. Таким образом, ценность определения концентрации в динамике гнойно-септических осложнений для мониторирования течения заболевания и контроля эффективности лечения переоценить сложно.

Ко второй группе белков острой фазы воспаления относится, в частности, фибриноген. Концентрация этих белков увеличивается в 2–5 раз. Одновременная активация фибринолиза сопровождается увеличением Д-димеров как продуктов деградации фибрина. Не случайно Д-димер отражает не только нарастание предтромботической готовности, но и степень острофазового ответа [13–15]. В более ранних наших работах показатели рутинной коагулограммы (протромбиновое и тромбиновое время, фибриноген, активированное частичное тромбопластиновое время) у больных с ХС и ХТ находились в пределах референсных значений и не различались между группами [9]. Наиболее информативным показателем служило повышение уровней растворимых фибринмономерных комплексов, что наглядно отражало развитие предтромботической готовности при гнойно-септических осложнениях [13–15].

В настоящем исследовании выявлена низкая частота встречаемости высоких концентраций Д-димера в группах пациентов с ХП, ХТ и ГС (табл. 3). Однако в группе с гнойно-септическими осложнениями и некрозом тканей – ПА высокие концентрации Д-димера регистрировались в 8 раз чаще. Это указывает на активацию процессов фибриногенеза, а следовательно, и фибринолиза, сопутствующих острой фазе воспалительного процесса.

Анализ результатов определения Д-димера в плазме крови показал значительные различия между группами пациентов с ХП, ГС, ХТ и ПА (табл. 4).

Установлено, что, несмотря на низкую частоту встречаемости высоких концентраций Д-димера при ХТ (2,94%) и ГС (2,63%) по сравнению с ХП (4,88%), медианы данного показателя увеличились и составили 3,0 нг/мл у пациентов с ХП (первая группа) и 4,85 нг/мл у пациентов с ХТ (вторая группа) (рис. 2). У пациентов в группах с гнойно-септическими осложнениями (третья и четвертая группы) уровни Д-димера возрастали в десятки раз и достоверно превышали медианы данного показателя в контрольной группе и других группах соответственно (табл. 4, рис. 2), что адекватно отражало острофазовый ответ и предтромботическую готовность в группах ГС и ПА.

При межгрупповом анализе мы выявили обратную корреляцию слабой степени концентраций СРБ (r = -0,285) и умеренной степени концентраций Д-димера (r = -0,36). Между изучаемыми показателями имела место достоверная прямая корреляционная связь умеренной степени (r = 0,548).

Выводы

На основании полученных данных были сделаны следующие выводы.

Во-первых, повышение в крови уровней СРБ адекватно отражает наличие воспалительной реакции у пациентов с ХП, ХТ, ГС и играет важную роль в ранней диагностике ПА, сопровождающегося некрозом и выраженной острофазовой реакцией, и предупреждении тяжелых гнойно-септических осложнений.

Во-вторых, при оценке динамики уровней Д-димера выявлена тенденция к низкой частоте встречаемости повышенных уровней показателя в группах ХП, ХТ. Но, несмотря на это, уровень Д-димера имеет важное диагностическое значение при развитии острофазового ответа и активации гемостаза при ГС и ПА и отражает активность процесса ограничения очага гнойно-септического расплавления тканей.

В-третьих, аналогичная динамика взаимосвязанных между собой показателей СРБ и Д-димера свидетельствует о взаимосвязанных процессах воспаления и гемостаза у больных ХС и ХТ.

Заключение

Выявленные в работе закономерности изменения показателей СРБ и Д-димера при ХП, ХТ, ГС, ПА, отражающих реакции и взаимодействие двух важнейших систем (воспаления и гемостаза), можно отнести к общепатологическим реакциям организма человека. Своевременное исследование уровня СРБ и Д-димера в крови пациентов с ХС и ХТ позволит проводить раннюю и чувствительную диагностику, прогнозировать течение заболевания и в конечном итоге – повышать эффективность лечения пациентов с данными нозологиями.

параллелей в интерактивном влиянии высокочувствительной личности и социальных факторов на поведенческие проблемы у собак и людей

  • 1.

    Арон, Э.Н., Арон, А. и Ягеллович, Дж. Чувствительность обработки сенсорной информации: обзор в свете эволюции биологической чувствительности. Обзор личности и социальной психологии 16 , 262–282 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 2.

    Арон, А. и др. . Черта темперамента, связанная с чувствительностью обработки сенсорной информации, смягчает культурные различия в нервной реакции. Социально-когнитивная и аффективная нейробиология 5 , 219–226 (2010).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 3.

    Jagiellowicz, J., Aron, A. & Aron, E. N. Взаимосвязь между чертой темперамента чувствительности обработки сенсорной информации и эмоциональной реактивностью. Социальное поведение и личность 44 , 185–199 (2016).

    Артикул Google ученый

  • 5.

    Брем, М. и др. . Разработка анкеты «Высокочувствительная собака» для оценки личностного параметра «Чувствительность обработки сенсорной информации» у собак. PLoS ONE 12 , e0177616 (2017).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Пейн, Э., Беннетт, П. С. и МакГриви, П. Д. Современные взгляды на привязанность и связь в диаде собака-человек. Психологические исследования и управление поведением 8 , 71–79 (2015).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 7.

    Siniscalchi, M., Stipo, C. & Quaranta, A. «Like Owner, Like Dog»: взаимосвязь между профилем привязанности владельца и связью между владельцем и собакой. PLoS ONE 8 , e78455 (2013).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8.

    Нагасава, М. и др. . Позитивная петля взгляда окситоцина и коэволюция связей человека и собаки. Science (Нью-Йорк, Нью-Йорк) 348 , 333–336 (2015).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ CAS Google ученый

  • 10.

    Галдериси, С., Хайнц, А., Каструп, М., Бизхолд, Дж. И Сарториус, Н. К новому определению психического здоровья. World Psychiatry 14 , 231–233 (2015).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11.

    Хофманн, С. Г. и Битран, С. Чувствительность обработки сенсорной информации при социальном тревожном расстройстве: отношение к предотвращению вреда и диагностическим подтипам. Журнал тревожных расстройств 21 , 944–954 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 12.

    Лисс, М., Майлу, Дж. И Эрчалл, М. Дж. Взаимосвязь между чувствительностью обработки сенсорной информации, алекситимией, аутизмом, депрессией и тревогой. Личность и индивидуальные различия 45 , 255–259 (2008).

    Артикул Google ученый

  • 13.

    Мейер, Б. и Карвер, К. С. Негативные детства, чувствительность и пессимизм: исследование особенностей избегающего расстройства личности у студентов колледжей. Журнал расстройств личности 14 , 233–248 (2000).

    Артикул CAS Google ученый

  • 14.

    Конок В. и др. . Влияние стиля привязанности и личности владельцев на расстройство, связанное с разлукой у их собак (Canis knownis). PLoS ONE 10 , e0118375 (2015).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 15.

    Prinzie, P. et al . Прямые и косвенные отношения между родительской личностью и экстернализирующим поведением: роль негативного воспитания. Psychologica Belgica 45 , 123–145 (2005).

    Артикул Google ученый

  • 16.

    van Aken, C. et al. . Родительская личность, воспитание детей и внешнее поведение малышей. Европейский журнал личности 21 , 993–1015 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 18.

    Гершофф, Э. Т. Следует ли считать физическое наказание детей родителями источником токсического стресса, влияющего на развитие мозга? Семейные отношения 65 , 151–162 (2016).

    Артикул Google ученый

  • 19.

    Гершофф, Э. Т. и Гроган-Кейлор, А. Порка и детские последствия: старые споры и новые метаанализы. Журнал семейной психологии https://doi.org/10.1037/fam0000191 (2016).

  • 21.

    Deldalle, S. & Gaunet, F. Влияние двух методов обучения на поведение собаки, связанное со стрессом (Canis familis), и на отношения между собакой и владельцем. Журнал ветеринарного поведения 9 , 58–65 (2014).

    Артикул Google ученый

  • 22.

    Херрон, М. Э., Шофер, Ф. С. и Рейснер, И. Р. Исследование использования и результатов конфронтационных и неконфронтационных методов обучения у принадлежащих клиенту собак, демонстрирующих нежелательное поведение. Прикладная наука о поведении животных 117 , 47–54 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 23.

    Хиби, Э. Ф., Руни, Н. Дж. И Брэдшоу, Дж. Методы дрессировки собак: их использование, эффективность и взаимодействие с поведением и благополучием. Защита животных 63–69. (2004).

  • 24.

    Руни, Н. Дж. И Коуэн, С. Методы обучения и взаимодействия хозяина и собаки: связь с поведением собаки и способностью к обучению. Прикладная наука о поведении животных 132 , 169–177 (2011).

    Артикул Google ученый

  • 25.

    Зив, Г. Эффекты использования аверсивных методов обучения у собак — обзор. Журнал ветеринарного поведения: клиническое применение и исследования https: // doi.org / 10.1016 / j.jveb.2017.02.004 (2017).

  • 26.

    Фернандес, Дж. Г., Олссон, И. А. С. и де Кастро, А. С. В. Действительно ли методы обучения, основанные на аверсиве, ставят под угрозу благополучие собак? Обзор литературы. Прикладная наука о поведении животных 196 , 1–12 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 27.

    Холл, Н. Дж., Протопопова, А. и Винн, К. Д. Л. Роль последствий, обусловленных окружающей средой и собственником, в стереотипии и компульсивном поведении собак. Журнал ветеринарного поведения 10 , 24–35 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 29.

    Слагт, М., Дубас, Дж. С., Ван Акен, М. А. Г., Эллис, Б. Дж. И Декович, М. Чувствительность сенсорной обработки как маркер дифференциальной восприимчивости к воспитанию. Психология развития 54 , 543–558 (2018).

    Артикул Google ученый

  • 30.

    Лисс, М., Тиммель, Л., Бэксли, К. и Киллингсворт, П. Чувствительность обработки сенсорной информации и ее связь с родительскими связями, тревогой и депрессией. Личность и индивидуальные различия 39 , 1429–1439 (2004).

    Артикул Google ученый

  • 31.

    Хуммади, С. и др. . Взаимосвязь между личностью диад человек – собака и выполнением рабочих задач. Прикладная наука о поведении животных 177 , 42–51 (2016).

    Артикул Google ученый

  • 32.

    Арон, Э. Н. и Арон, А. Чувствительность к сенсорной обработке и ее связь с интроверсией и эмоциональностью. Журнал личности и социальной психологии 73 , 345–368 (1997).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Кугл, Дж. Р., Тимпано, К. Р., Саравги, С., Смит, К. М. и Фитч, К. Е. Мультимодальное исследование роли терпимости к дистрессу и эмоциональной реактивности в обсессивно-компульсивных симптомах. Беспокойство, стресс и преодоление 26 , 478–492 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 35.

    Миллс Д., Карагианнис К. и Зульч Х. Стресс — его влияние на здоровье и поведение. Ветеринарные клиники: мелкие животные , https://doi. org/10.1016/j.cvsm.2014.01.005 (2014).

  • 36.

    Миллс Д. и Люшер А. Ветеринарные и фармакологические подходы к ненормальному повторяющемуся поведению. В Стереотипное поведение животных (ред. Мейсон, Г. и Рашен, Дж.) 285–323 (CABI Publishing, 2008).

  • 37.

    Кэмерон, М. Э., Кейси, Р. А., Брэдшоу, Дж.В. С., Варан, Н. К. и Ганн-Мур, Д. А. Исследование факторов окружающей среды и поведения, которые могут быть связаны с идиопатическим циститом кошек. Journal of Small Animal Practice 45 , 144–147 (2004).

    Артикул CAS Google ученый

  • 38.

    Колхас, Дж. М. и др. . Стили совладания с животными: современное состояние поведения и стресс-физиология. Neuroscience & Biobehavioral Reviews 23 , 925–935 (1999).

    Артикул CAS Google ученый

  • 39.

    Колхас, Дж. М. и др. . Возвращение к стрессу: критическая оценка концепции стресса. Neuroscience & Biobehavioral Reviews 35 , 1291–1301 (2011).

    Артикул CAS Google ученый

  • 40.

    МакИвен, Б. С. В поисках устойчивости: стресс, эпигенетика и пластичность мозга. Анналы Нью-Йоркской академии наук 1373 , 56–64 (2016).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

  • 41.

    Benham, G. Высокочувствительный человек: отчеты о стрессе и физических симптомах. Личность и индивидуальные различия 40 , 1433–1440 (2006).

    Артикул Google ученый

  • 42.

    Герстенберг, Ф.X. R. Чувствительность обработки сенсорной информации позволяет прогнозировать выполнение задачи визуального поиска с последующим усилением воспринимаемого стресса. Личность и индивидуальные различия 53 , 496–500 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 43.

    Pluess, M. et al . Экологическая чувствительность у детей: развитие высокочувствительной детской шкалы и определение групп чувствительности. Психология развития , https: // doi.org / 10.1037 / dev0000406 (2017).

  • 45.

    Belsky, J. & Pluess, M.Помимо стресса диатеза: Различная восприимчивость к воздействиям окружающей среды. Психологический бюллетень 135 , 885–908 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 46.

    Кочанская, Г., Аксан, Н. и Джой, М. Е. Детский страх как модератор воспитания в ранней социализации: два лонгитюдных исследования. Психология развития 43 , 222–237 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 47.

    Слагт, М., Семон Дубас, Дж. И ван Акен, М.А.Г. Дифференциальная восприимчивость к воспитанию детей в среднем детстве: указывают ли импульсивность, жесткий контроль и отрицательная эмоциональность на восприимчивость или уязвимость? Развитие младенцев и детей , https://doi.org/10.1002/icd.1929 (2015).

  • 48.

    Плюсс М. и Бельски Дж. Различная восприимчивость детей к влиянию воспитания. Семейная наука 1 , 14–25 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 49.

    Хувер, Р.М.Э., Оттен, Р., де Фрис, Х. и Энгельс, Р.С.М. Э. Личность и стиль воспитания у родителей подростков. Journal of Adolescence 33 , 395–402 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 50.

    Моррис, А. С., Силк, Дж. С. и Стейнберг, Л. Темпераментная уязвимость и негативное воспитание как взаимодействующие предикторы адаптации ребенка. Journal of Marriage and Family 64 , 461–471 (2002).

    Артикул Google ученый

  • 51.

    Плюсс, М. и Бельски, Дж. Дифференциальная восприимчивость к опыту воспитания: случай ухода за детьми. Журнал детской психологии и психиатрии 50 , 396–404 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 53.

    Нагасава, М., Кикусуи, Т., Онака, Т. и Мицуаки, О. Взгляд собаки на своего хозяина увеличивает уровень окситоцина в моче хозяина во время социального взаимодействия. Гормоны и поведение 55 , 434–441 (2009).

    Артикул CAS Google ученый

  • 54.

    Хэндлин, Л., Нильссон, А., Эйдебек, М., Хайдбринг-Сандберг, Э. и Увнес-Моберг, К. Связь между психологическими характеристиками взаимоотношений человека и собаки и уровнями окситоцина и кортизола. Anthrozoos 25 , 215–228 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 55.

    Мендл, М., Бурман, О. Х. П. и Пол, Э. С. Интегративная и функциональная основа для изучения эмоций и настроения животных. Труды Королевского общества B: Биологические науки 277 , 2895–2904 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 56.

    Глейзер Д. Эмоциональное насилие и пренебрежение (психологическое жестокое обращение): концептуальная основа. Жестокое обращение с детьми и безнадзорность 26 , 697–714 (2002).

    Артикул Google ученый

  • 57.

    Арслан, Г.Психологическое жестокое обращение, стратегии выживания и проблемы психического здоровья: краткий и эффективный метод измерения психологического жестокого обращения с подростками. Жестокое обращение с детьми и безнадзорность 68 , 96–106 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 58.

    Кайрис, С. В. и Джонсон, К. Ф. Комитет по жестокому обращению с детьми и безнадзорности. Психологическое обращение с детьми — технический отчет. Педиатрия 109 , e68 – e68 (2002).

    Артикул Google ученый

  • 59.

    Хсу, Ю. и Серпелл, Дж. Разработка и проверка анкеты для измерения характеристик поведения и темперамента домашних собак. Журнал Американской ветеринарной медицинской ассоциации 223 , 1293–1300 (2003).

    Артикул Google ученый

  • 60.

    Райт, Х. М. Д. П., Миллс, Д. и Поллукс, П.М. Дж. Разработка и валидация психометрического инструмента для оценки импульсивности у домашней собаки (Canis knownis). Международный журнал сравнительной психологии 24 , 210–225 (2011).

    Google ученый

  • Что такое высокочувствительный человек (HSP)?

    Что такое высокочувствительный человек (HSP)?

    Высокочувствительный человек (HSP) — это термин для тех, кто, как считается, имеет повышенную или более глубокую чувствительность центральной нервной системы к физическим, эмоциональным или социальным раздражителям.Некоторые называют это чувствительностью к сенсорной обработке, или сокращенно SPS.

    Хотя высокочувствительных людей иногда негативно называют «слишком чувствительными», это черта личности, которая приносит как сильные стороны, так и проблемы.

    Эти термины впервые были введены психологами Элейн Арон и Артуром Ароном в середине 1990-х годов, и с тех пор интерес к этой концепции продолжает расти.

    Откуда ты знаешь?

    Говорили ли вам когда-нибудь, что вы «слишком чувствительны» или что «не следует так много думать», особенно от людей, которые производят на вас впечатление слишком чувствительных на или которые, по вашему мнению, должны думать немного больше? Вы можете быть так называемым «очень чувствительным человеком» или HSP.

    Важно помнить, что статус СЧЛ не означает, что у вас есть диагностируемое состояние. Это черта личности, которая подразумевает повышенную реакцию как на положительные, так и на отрицательные влияния.

    Высокая чувствительность применяется к нескольким различным категориям. По мнению исследователей, выявивших эту личностную черту, у СЧЛ есть несколько общих черт или характеристик:

    • Избегайте жестоких фильмов или телешоу , потому что они кажутся слишком напряженными и оставляют вас беспокойным
    • Глубоко тронуты красотой , выраженной в искусстве, природе или человеческом духе, или иногда даже в хорошей рекламе
    • Быть подавленным сенсорными стимулами , такими как шумная толпа, яркий свет или неудобная одежда
    • Ощущение необходимости простоя (не просто предпочтение), особенно в беспокойные дни; необходимость уйти в темную тихую комнату
    • Обладать богатой и сложной внутренней жизнью , полной глубоких мыслей и сильных чувств, которые идут вместе с ней

    Для более полной или официальной идентификации Ароны разработали личностный опросник, чтобы помочь людям идентифицировать себя как СЧЛ. Она известна как шкала высокочувствительных людей Арона (HSPS).

    Насколько распространены СЧЛ?

    Считается, что высокочувствительные люди составляют примерно 20% от общей популяции. Высокая чувствительность и интроверсия также имеют общие черты, но являются разными личностными чертами; однако между ними может быть некоторое совпадение.

    Чувствительность сенсорной обработки также иногда путают с состоянием, называемым расстройством сенсорной обработки, хотя считается, что эти два явления различаются.

    Реже быть высокочувствительным человеком, и общество, как правило, строится вокруг людей, которые замечают немного меньше и подвержены меньшему влиянию.

    Высокочувствительным людям может быть полезно найти способы справиться со стрессами, с которыми они часто сталкиваются. Это верно для тех, кто считает себя очень чувствительными, а также для тех, у кого есть любимый человек, более чувствительный, чем средний человек.

    Влияние того, чтобы быть HSP

    Быть СЧЛ имеет как преимущества, так и проблемы. Можно слишком легко обидеться на людей, не желающих зла или изо всех сил старающихся быть добрыми. Также возможно остро реагировать на повседневные стрессовые факторы или проблемы в отношениях, особенно если вы становитесь эмоционально агрессивными в качестве реакции.

    Однако быть СЧЛ не обязательно означает, что вы воображаете отрицательные мотивы, когда их нет. Более того, вы их легче воспринимаете. Или вы можете быть более глубоко затронуты негативным опытом, что не обязательно является слабостью.

    Вот некоторые из способов, которыми СЧЛ может повлиять на вашу жизнь:

    • Вы можете избежать ситуаций, в которых вы чувствуете себя подавленным . На высокочувствительных людей могут в большей степени влиять определенные ситуации, такие как напряжение, насилие и конфликт, что может побудить их избегать вещей, которые заставляют их чувствовать себя некомфортно.
    • Вы можете быть очень тронуты красотой или эмоциональностью . Очень чувствительные люди, как правило, глубоко тронуты красотой, которую они видят вокруг.Они могут плакать при просмотре особенно трогательных видео и действительно сочувствовать чувствам других, как отрицательным, так и положительным.
    • У вас могут быть близкие отношения с другими людьми . Они глубоко заботятся о своих друзьях и имеют тенденцию формировать глубокие связи с нужными людьми.
    • Вы можете быть благодарны за ту жизнь, что у вас есть . Высокочувствительные люди ценят хорошее вино, хорошую еду или красивую песню на уровне, недоступном большинству людей. Они могут чувствовать более экзистенциальную тревогу, но они также могут испытывать большую благодарность за то, что у них есть в жизни, зная, что это, возможно, мимолетно и ничто не является определенным.

    Если вы знаете, как управлять уникальными чертами СЧЛ, вы можете сделать это более сильным и менее сложным в своей жизни. Для этого нужно понять, с чем вы имеете дело, делаете ли вы это для себя или пытаетесь глубже понять кого-то в своей жизни, который может быть очень чувствительным.

    Для HSP минимумы могут быть ниже, но максимумы также могут быть выше.

    Возможные ловушки

    Неудивительно, что высокочувствительные люди склонны испытывать больший стресс в трудных ситуациях.Они также могут испытывать стресс от вещей, которые могут скатиться со спины других людей.

    Социальный стресс воспринимается большинством людей как более тяжелый, чем другие виды стресса. Этот вид стресса может быть особенно трудным для человека, который может по-разному воспринимать, что что-то может пойти не так, например, в конфликте, или может воспринимать враждебность или напряжение там, где другие могут этого не заметить. Конкретные вещи, которые могут вызвать значительный стресс у очень чувствительных людей, включают:

    Гектические расписания

    Не всем нравится быть слишком занятым, но некоторые люди преуспевают в волнении и веселье от насыщенной жизни.С другой стороны, HPS чувствуют себя подавленными и нервными, когда им нужно много сделать за короткий промежуток времени, даже если технически у них есть достаточно времени, чтобы все сделать, если они спешат. Необходимость совладать с неуверенностью в том, что, возможно, не удастся заставить все это работать, и давление таких ситуаций вызывают чрезмерный стресс.

    Ожидания других

    Очень чувствительные люди склонны улавливать потребности и чувства других. Они ненавидят подводить людей. Научиться говорить «нет» — это вызов и необходимость для СЧЛ, потому что они могут чувствовать себя подавленными требованиями других, особенно потому, что они могут чувствовать разочарование своих друзей, если СЧЛ должны сказать «нет».

    Очень чувствительные люди склонны быть худшими критиками самих себя. Они чувствуют ответственность за счастье других или, по крайней мере, остро осознают это, когда вокруг плавают негативные эмоции.

    Конфликты

    СЧЛ могут быть более подвержены стрессу из-за конфликта. Они могут быть более осведомлены о назревающих проблемах в отношениях, в том числе когда они чувствуют себя немного «не так» с кем-то, кто, возможно, не говорит о существовании проблемы. Это также может привести к неправильной интерпретации несвязанных сигналов как признаков конфликта или гнева.

    Социальное сравнение

    Высокочувствительные люди также могут быть подвержены стрессу социального сравнения. Они могут чувствовать не только свои собственные чувства, но и негативные чувства другого человека, и они могут испытывать их сильнее и глубже, чем другие.

    Они могут быть более осведомлены о возможности улучшения и расстраиваться, когда потенциально хорошие результаты уступают место более негативным результатам в ходе обострения конфликта.

    Они также могут быть более расстроены, когда понимают, что отношения закончились, чувствуя, что все можно было решить, в то время как кто-то другой может чувствовать, что ничего нельзя сделать, и уходит.

    Высокочувствительный человек может также острее почувствовать потерю отношений и погрузиться в размышления.

    Допуски

    Лайф-коучи называют те ежедневные потери энергии, которые у всех нас есть, терпимостью, то есть «вещами, которые мы терпим», которые создают стресс и не являются строго необходимыми. Отвлечения могут быть более неприятными для СЧЛ, который пытается сосредоточиться, например, или неприятные запахи в доме могут ощущаться сильнее и делать расслабление более труднодостижимым для СЧЛ в грязном доме.

    Высокочувствительных людей легче удивить. Они «голодны», когда голодны — плохо переносят это. Таким образом, повседневные жизненные факторы стресса часто усугубляют разочарование высокочувствительных людей.

    Личные неудачи

    Поскольку СЧЛ сами являются худшими критиками, они более склонны к размышлениям и неуверенности в себе. Они могут долго помнить, совершили ли досадную ошибку, и смущаться из-за этого больше, чем обычный человек.

    Им не нравится, когда за ними наблюдают и оценивают, когда они пытаются что-то сложное, и даже могут ошибиться из-за стресса от наблюдения. Они чаще перфекционисты, но также могут быть лучше осведомлены о том, что стресс не является неизбежным и как он влияет на них.

    Советы / хитрости

    Поиск способов справиться со стрессом в жизни может быть особенно полезным, если вы склонны к более чувствительной личности. Большая часть вашего плана снятия стресса как высокочувствительного человека может включать в себя изоляцию от слишком большого количества раздражителей.Установите барьер между вами и сенсорными раздражителями, которые кажутся подавляющими. И, прежде всего, знайте, что вызывает у вас стресс, и научитесь избегать этого.

    • Добавьте позитива , создавая положительные впечатления в своем графике, чтобы оградить вас от дополнительного стресса, с которым вы можете столкнуться.
    • Избегайте стрессовых факторов , таких как слэшеры и людей, которые лишают вас позитивной энергии, предъявляют к вам тяжелые требования или заставляют вас плохо относиться к себе.
    • Научитесь говорить «нет» непреодолимым требованиям и почувствуйте себя хорошо с этим, и создайте периметр в своей жизни.
    • Создайте безопасное место . Пусть в вашем доме будет уютная обстановка.

    Слово от Verywell

    Быть очень чувствительным человеком означает, что вы с большей вероятностью будете глубоко переживать, независимо от того, положительные они или отрицательные. В то время как подъемы могут быть радостными, спады могут создавать проблемы, которые могут повлиять на ваш уровень стресса, отношения и способность справляться с ситуацией. Составьте план того, как вы будете управлять своими чувствами в сложных ситуациях, чтобы не перегружать себя.

    Ржаные мутанты определяют роль белков Ssn / Srb голофермента РНК-полимеразы II при переходе в стационарную фазу у Saccharomyces cerevisiae

    Abstract

    Клетки Saccharomyces cerevisiae переходят в особое состояние покоя, известное как стационарная фаза, в ответ на определенные типы недостатка питательных веществ. Мы определили коллекцию мутантов, которые показали дефектный транскрипционный ответ на ограничение питательных веществ и не смогли войти в нормальную стационарную фазу.Эти мутанты ржи были выделены на основании дефектов регуляции экспрессии YGP1 . В клетках дикого типа уровни YGP1 и увеличиваются во время остановки роста, вызванной лишением питательных веществ или инактивацией пути передачи сигналов Ras. Напротив, уровни YGP1, и родственных генов были значительно повышены у мутантов ржи во время лог-фазы роста. Дефекты ржи не были специфичными для этого ответа YGP1 , поскольку эти мутанты также демонстрировали множественные дефекты в свойствах стационарной фазы, включая неспособность пережить периоды длительного голодания.Эти данные показали, что гены RYE могут кодировать важные регуляторы роста дрожжевых клеток. Интересно, что три из генов RYE кодируют белки Ssn / Srb, Srb9p, Srb10p и Srb11p, которые связаны с холоферментом РНК-полимеразы II. Таким образом, холофермент РНК-полимеразы II может быть мишенью сигнальных путей, ответственных за координацию роста дрожжевых клеток с доступностью питательных веществ.

    SACCHAROMYCES cerevisiae пролиферация клеток контролируется в первую очередь доступностью питательных веществ (Pringle and Hartwell 1981; Werner-Washburne et al. 1993). При недостатке питательных веществ дрожжевые клетки останавливают деление в фазе G 1 клеточного цикла и могут впоследствии переходить в особое состояние покоя, известное как стационарная фаза. Переход в это состояние покоя отмечен рядом изменений в клеточной физиологии, которые в конечном итоге приводят к повышенной устойчивости к длительному голоданию и другим стрессам окружающей среды (Werner-Washburne et al. 1993, 1996). Генетические и биохимические данные свидетельствуют о том, что клетки в стационарной фазе не задерживаются в клеточном цикле, а вместо этого находятся в отдельной фазе роста вне цикла (Drebot et al. 1987; Werner-Washburne et al. 1993, 1996; Braun et al. 1996). Общая природа стационарной фазы S. cerevisiae предполагает сходство с фазой G 0 , описанной для клеток млекопитающих (Pardee 1989).

    Многие из изменений, которые происходят в дрожжевых клетках при лишении питательных веществ и переходе в стационарную фазу, хорошо задокументированы (см. Обзор Werner-Washburne et al. 1993, 1996). Одним из наиболее заметных является заметное снижение общей скорости клеточного метаболизма. Скорость трансляции белка в клетке с неподвижной фазой в 300 раз меньше, чем в делящейся дрожжевой клетке (Boucherie 1985; Fuge et al. 1994; Werner-Washburne et al. 1996). Кроме того, РНК-pol II-опосредованная транскрипция большинства генов значительно снижена (Choder 1991). В результате общий уровень мРНК в клетке со стационарной фазой примерно в 35 раз ниже, чем уровень в клетке с логарифмической фазой (Choder 1991; Choder and Young 1993). Несмотря на эту общую тенденцию, относительная численность некоторых мРНК и белков действительно увеличивается во время стационарной фазы (Choder 1991; Werner-Washburne et al. 1993; Fuge et al. 1994; Padilla et al. 1998). Эти последние белки, вероятно, ответственны за многие свойства, связанные с клеткой неподвижной фазы.

    Наиболее изученным примером реакции дрожжевых клеток на недостаток питательных веществ является реакция, возникающая после ферментативного роста на глюкозе (Lagunas 1986). Когда уровень глюкозы становится ограничивающим, клетка временно останавливает рост, а затем переключается на респираторный режим производства энергии. Этот переходный период известен как диауксический сдвиг.В течение последующего периода дыхания клетки растут довольно медленно и используют побочные продукты предыдущей ферментации в качестве своих основных источников углерода. Когда они окончательно истощены, клетки входят в истинную стационарную фазу, когда количество клеток больше не увеличивается (Werner-Washburne et al. 1996). Каждый из этих переходов роста сопровождается широко распространенными изменениями в экспрессии генов (Werner-Washburne et al. 1996; DeRisi et al. 1997). Например, некоторые гены временно включаются в течение периода диауксического сдвига, тогда как другие включаются гораздо позже, когда клетки уже находятся в стационарной фазе (Choder 1991; Werner-Washburne et al. 1993; Braun et al. 1996; DeRisi et al. 1997). Строгое согласование этих профилей экспрессии, вероятно, важно для правильного ответа на депривацию питательных веществ и, следовательно, для перехода в стационарную фазу.

    Хотя транскрипционный ответ является частью процесса вхождения в стационарную фазу, до сих пор неизвестно, как дрожжевые клетки воспринимают различные типы ограничения питательных веществ и как этот исходный сигнал передается в аппарат транскрипции. В С.cerevisiae , как и у других эукариот, РНК pol II присутствует в виде большого мультибелкового комплекса, известного как холофермент РНК pol II (Kim et al. 1994; Koleske and Young 1994, 1995). Этот холофермент, вероятно, является функциональной формой pol II, которая активно рекрутируется на промоторы с помощью ДНК-связанных trans -активаторов (Ptashne and Gann 1997). В этой модели специфичность транскрипционного ответа достигается дополнительными белками, связанными с РНК pol II, которые, взаимодействуя с этими активаторами, направляют полимеразу к конкретным промоторам (Barberis et al. 1995; Keaveney и Struhl 1998; Koh et al. 1998; Han et al. 1999). Следовательно, есть две цели a priori для пищевого сигнала, который опосредует переход в стационарную фазу: trans -активаторы на каждом из отвечающих промоторов или эти регуляторные белки внутри самого голофермента.

    Мы заинтересованы в понимании генетических требований для входа в стационарную фазу и поддержания внутри нее в S.cerevisiae. В этом отчете описывается набор мутантов, которые не смогли войти в стационарную фазу после лишения питательных веществ. Эти мутанты ржи (дефектные для r эгуляции YGP1 e xpression) были идентифицированы на основе дефектов в паттерне экспрессии YGP1 , гена, обычно индуцируемого при депривации питательных веществ (Destruelle et al. 1994; Riou et al. 1997). Интересно, что некоторые из генов RYE кодируют белки Ssn / Srb, которые связаны с холоферментом РНК pol II.Эти белки Ssn / Srb регулируют экспрессию генов, модулируя активность РНК pol II в отношении субнабора дрожжевых промоторов (Carlson 1997). Наши данные показали, что эти белки Ssn / Srb также необходимы для правильного перехода в стационарную фазу. В целом, наши наблюдения предполагают, что холоэнзим РНК pol II может быть мишенью сигнальных путей, ответственных за координацию роста клеток с доступностью питательных веществ.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Среда для выращивания: Стандарт Escherichia coli Условия роста и среды использовались на протяжении всего этого исследования (Miller 1972).Обогащенная дрожжами (YPAD) и синтетическая полная (SC) питательная среда была, как описано (Kaiser et al. 1994). YM-глюкозная среда относится к минимальной дрожжевой среде, содержащей 0,67% дрожжевого азотного основания (Difco, Detroit), 2% глюкозы и только те добавки для роста, которые необходимы для пролиферации клеток. Селекционная среда бромкрезоловый пурпурный (BCP) -сахароза была такой же, как описано, за исключением того, что 75 мкг антимицина A 1 наносили сверху на чашки непосредственно перед использованием (Robinson et al. 1988).Для большинства экспериментов со стационарной фазой дрожжевые клетки выращивали в минимальной среде YM-глюкозы при 30 °. Культивирование обычно начинали при плотности 0,1 OD 600 единиц на миллилитр. В этих условиях клетки, по-видимому, претерпевали диауксический сдвиг через 1 день роста и переходили в стационарную фазу примерно через 4 дня роста.

    Плазмидные конструкции: Плазмида слияния YGP1-SUC2 , pYGP1-SUC2 (первоначально называемая pGPI354-308), содержащая частичный промотор YGP1 , была описана ранее (Destruelle et al. 1994). Эта репортерная плазмида кодирует слитый белок Ygp1p-Suc2p, который содержит всю открытую рамку считывания Ygp1p, слитую с аминокислотой 22 белка Suc2. Экспрессия этого репортера управляется последовательностями промотора YGP1 и , присутствующими в пределах 350 п.н. непосредственно перед инициирующим кодоном Ygp1p.

    Конструкции штаммов дрожжей: Штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Если не указано иное, штаммы были из наших лабораторных коллекций или были получены в ходе этой работы.В этом исследовании использовались стандартные генетические методы дрожжей (Kaiser et al. 1994). Штаммы PHY1220 и PHY1222 являются производными SEY6210 и SEY6211 соответственно (Robinson et al. 1988). Штаммы PHY1025 и PHY1682 являются изогенными с генетическим фоном W303. ПЦР-опосредованные делеции локуса SUC2 были выполнены с PHY1682 и PHY1025 для конструирования PHY1106 и PHY1108 соответственно (Baudin et al. 1993). Штаммы cdc28-4 (PHY1348) и cdc25-1 (PHY1452) были сконструированы путем обратного скрещивания исходных изолятов (JT249 и JRY0890 соответственно) с фоном W303 пять раз и затем трансформации полученных штаммов с помощью pYGP1-SUC2.

    Выделение и генетическая характеристика мутантов ржи : Выделение мутантов ржи было выполнено в двух штаммах MAT α (PHY1184 и PHY1185) и в двух штаммах MAT a (PHY13551354) и PHY1354. . Для отбора мутантов Rye ~ 3 × 10 7 клеток высевали на чашки с BCP-сахарозой и инкубировали при 30 ° в течение 3-4 дней. Колонии, образовавшиеся на этих чашках, наносили штрихами на среду BCP-сахароза и снова инкубировали при 30 °.Кандидатами, которые образовали одиночные колонии на этом втором наборе чашек, были потенциальные мутанты ржи и . Рецессивную или доминантную природу каждого аллеля определяли путем скрещивания каждого мутанта обратно с диким типом и тестирования способности полученного диплоида расти на среде с сахарозой. Распределение по группам комплементации было выполнено путем скрещивания мутантов противоположных типов спаривания и тестирования полученных диплоидов на рост на среде BCP-сахароза.

    Гены RYE клонировали путем комплементации плазмиды роста Suc + , проявляемого мутантами ржи .Библиотеку геномной ДНК дрожжей, сконструированную в плазмиде pSB32, вводили в соответствующий мутант ржи (Spencer et al. , 1990). Трансформанты отбирали при 30 ° на среде YM-глюкоза, не содержащей как урацила, так и лейцина; плазмида pSB32 помечена геном LEU2 дикого типа. Образованные колонии репликами высевали на среду BCP-сахароза, инкубировали при 30 ° и идентифицировали те колонии, которые не могли расти на сахарозе. Библиотечные плазмиды, присутствующие в этих производных Suc , были выделены, клонально очищены в E.coli , а затем повторно введен в мутанты ржи . Те плазмиды, которые снова скорректировали фенотип Suc + мутанта ржи , были дополнительно охарактеризованы. Сравнения между последовательностями плазмид и геномными базами данных проводили с помощью программ анализа, доступных в базе данных генома Saccharomyces. Нулевые аллели клонированных генов RYE были сконструированы с помощью протокола делеции на основе ПЦР, описанного ранее (Baudin et al. 1993). Штаммы ржи Δ проявили спектр фенотипов, по существу идентичный фенотипам мутантов ржи , описанных в этой статье.

    Чтобы гарантировать, что клонированный ген RYE соответствует измененному локусу в исходном мутанте, соответствующий нулевой мутант ржи был скрещен с исходным изолятом ржи . Затем полученные диплоиды спорулировали, и мейотическое потомство охарактеризовали как по их росту на сахарозе, так и по их склонности к флокуляции.Для каждого мутанта ржи исследовали не менее 30 тетрад. Было обнаружено, что все потомство представляет собой Suc + и флокулирует при выращивании в жидкой культуре. Эти данные показали, что клонированные гены представляют собой измененные геномные локусы в исходных штаммах ржи .

    ТАБЛИЦА 1

    Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании

    Анализы инвертазы: Анализы инвертазы выполняли, как описано ранее (Johnson et al. 1987).Одна единица активности эквивалентна высвобождению 1 нмоль глюкозы за 30 мин на единицу OD 600 клеток. Для экспериментов со стрессом окружающей среды клетки PHY1184 выращивали в среде YM-глюкозы без урацила до фазы midlog, а затем подвергали воздействию следующих условий в течение 60 мин: 0,3 м NaCl; 7,5% этанол; 0,4 мм В 2 O 2 ; 0,4 м сорбитола; и инкубация при 37 °. После обработки клетки обрабатывали и анализировали на активность инвертазы. Для экспериментов ras2-23 и cdc28-4 клетки выращивали в минимальной среде YM-глюкозы до фазы midlog при 25 °, сдвигали на 37 ° и обрабатывали на активность инвертазы с указанными интервалами.

    Анализы характеристик стационарной фазы: Анализы жизнеспособности стационарной фазы проводили на культурах, которые выращивали в течение 7-10 дней в среде YM-глюкозы. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в дистиллированной воде при концентрации 1 OD 600 единицы на миллилитр. Суспензии подвергали серии пятикратных разведений, и 200 мкл каждой суспензии помещали в лунку планшета для микротитрования. Эти суспензии помещали в среду YPAD с 48-зубцовым репликатором и инкубировали в течение 3 дней при 30 °.Затем определяли относительное количество выживших для каждого проанализированного штамма. Аналогичное количество выживших наблюдалось в культурах дикого типа, которые выращивали в течение 2 или 8 дней при 30 °.

    Чувствительность к тепловому шоку культур с неподвижной фазой проверяли, помещая аликвоты культур по 200 мкл в микроцентрифужную пробирку и инкубируя при 50 ° в течение 20 мин. Разведения культур высевали на богатую среду до и после режима теплового шока. Затем эти планшеты инкубировали при 30 ° в течение 3 дней для образования колоний.Относительную выживаемость определяли путем сравнения количества колоний, образованных исходными культурами, с количеством, образованным теми же культурами после обработки тепловым шоком.

    анализов РНК: Общую РНК получали из дрожжевых клеток методом экстракции горячим фенолом (Ausubel et al. 1995). Двадцать микрограммов общей РНК на дорожку наносили на формальдегид-агарозный гель и подвергали электрофоретическому разделению. Гель наносили на нейлоновые мембраны, которые затем гибридизовали с соответствующими зондами, меченными 32 P (Ausubel et al. 1995). Обычно эти зонды представляли собой ПЦР-фрагменты размером 0,5–1,0 т.п.н., которые получали с помощью набора для маркировки олигомеров (Amersham, Piscataway, NJ). Чтобы гарантировать равномерную загрузку для экспериментов с РНК стационарной фазы, уровни рРНК контролировали путем визуального осмотра после окрашивания геля бромидом этидия.

    ТАБЛИЦА 2

    Репортер YGP1-SUC2 был индуцирован переходом в стационарную фазу, но не другими стрессовыми условиями

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Уровни YGP1 увеличиваются при потере активности пути Ras, но не в ответ на другие стрессы окружающей среды: Экспрессия YGP1 возрастает при депривации питательных веществ и переходе в стационарную фазу (Destruelle et al. 1994; Riou et al. 1997). Дрожжевые клетки, которым не хватало источника углерода, азота или фосфата, демонстрируют значительное увеличение уровней мРНК YGP1 . Эти наблюдения позволили предположить, что увеличение уровней YGP1 может использоваться как индикатор наступающего наступления стационарной фазы. Однако большинство генов, которые индуцируются при лишении питательных веществ, не специфичны для стационарной фазы. Вместо этого эти гены часто связаны с общей реакцией на стресс и могут быть вызваны множеством условий, включая голод, тепловой шок и воздействие окислительных агентов (Mager and De Kruijff 1995; Ruis and Schuller 1995).Поэтому мы проверили, были ли уровни YGP1 индуцированы различными стрессовыми условиями, каждое из которых способно вызвать общую стрессовую реакцию.

    Мы обнаружили, что ни одно из испытанных стрессовых условий, за исключением недостатка питательных веществ, не вызывало значительной индукции уровней YGP1 (Таблица 2). Каждое из этих условий запускало общий стрессовый ответ, поскольку уровни мРНК CTT1 или стресс-ответного репортера lacZ увеличивались в 6-32 раза в обработанных клетках (данные не показаны; см. Marchler et al. . 1993). CTT1 кодирует цитоплазматическую каталазу, экспрессия которой индуцируется множеством различных стрессовых состояний (Schuller et al. 1994; Martinez-Pastor et al. 1996). Для этих экспериментов мы использовали слияние гена YGP1-SUC2 в качестве репортера экспрессии YGP1 (Destruelle et al. 1994). Этот репортер экспрессируется на очень низком уровне во время роста в лог-фазе и сильно индуцируется при переходе в стационарную фазу (таблица 2; см. Destruelle et al. 1994). В наших экспериментах эта индукция была> 150 раз в ответ на депривацию глюкозы. Мы также обнаружили, что для индукции YGP1-SUC2 не требовалась функция гена MSN2 или MSN4 (данные не показаны). Гены MSN2 и MSN4 кодируют факторы транскрипции, которые ответственны за значительную часть транскрипционного ответа S. cerevisiae на стресс окружающей среды (Marchler et al. 1993; Schmitt and McEntee 1996).Таким образом, индукция репортера YGP1-SUC2 не была общей реакцией на стресс окружающей среды, а скорее была более конкретным следствием перехода в стационарную фазу.

    Скорость роста дрожжевых клеток значительно снижается, когда количество необходимых питательных веществ становится ограниченным. Следовательно, индукция YGP1 может быть ответом либо на недостаток питательных веществ, либо на снижение скорости роста клетки. Чтобы различить эти возможности, мы проанализировали экспрессию YGP1 в мутантах пути Ras, которые останавливают рост даже в присутствии питательной среды для роста (обзор у Broach 1991; Thevelein 1994).В этом эксперименте использовали три мутанта, которые проявляют чувствительный к температуре дефект в сигнальной активности Ras: ras2-23 ras1 Δ, cdc25-1 и cyr1-230 (Matsumoto et al. 1985; Broek и др., 1987; Мицудзава, и др., , 1989). В каждом случае термическая инактивация пути Ras приводила к> 200-кратному увеличению уровней активности инвертазы YGP1-SUC2 (рис. 1). Напротив, мутант cdc28-4 , который вызывает G 1 -специфический арест, не привел к значительному увеличению уровней YGP1-SUC2 (Рисунок 1).В каждом из этих экспериментов блокировка клеточного цикла была успешно наложена, поскольку> 90% клеток были арестованы с морфологией без бутонов. Эти данные показали, что индукция стационарной фазы YGP1 не была вызвана недостатком питательных веществ как таковой , а была вместо этого следствием сопровождающей G 0 -подобной остановки роста.

    Выделение мутантов ржи : Приведенные выше данные предполагают, что индукцию YGP1 можно использовать в качестве индикатора последующего перехода в стационарную фазу.Поэтому мы создали генетический отбор для выявления мутантов, у которых обнаружены дефекты в регуляции экспрессии YGP1 . В частности, этот отбор выявил мутанты, которые экспрессировали репортер YGP1-SUC2 на повышенных уровнях во время логарифмической фазы роста. Основное объяснение состоит в том, что эти дефекты в экспрессии YGP1 могут быть предвестниками более глобальных дефектов транскрипционной реакции на депривацию питательных веществ. Следовательно, эти мутанты могут идентифицировать гены, важные для перехода в стационарную фазу, а также, возможно, более глобальных аспектов контроля роста.

    Ключевой особенностью этого репортера YGP1-SUC2 была его низкая экспрессия во время логарифмической фазы роста (таблица 2). SUC2 кодирует фермент инвертазу, который необходим для роста S. cerevisiae на сахарозе (Johnston and Carlson 1992). В результате клетки дикого типа, которые содержали только эту гибридную версию SUC2 , не могли расти на сахарозной среде (см. Фигуру 2). Мутанты ржи были выделены путем посева таких штаммов Suc2 Δ, несущих репортер YGP1-SUC2 , на сахарозную среду и отбора мутантов, которые могли образовывать колонии.Для всех мутантов ржи рост на сахарозе зависел от присутствия слияния YGP1-SUC2 . Из 48 выделенных независимых мутантов ржи 41 содержал рецессивные мутации (Таблица 3). Путем скрещивания рецессивных мутантов мы обнаружили, что они определили восемь различных групп комплементации и что почти половина всех мутантов были членами группы rye1 (таблица 3). Один из доминантных мутантов определил отдельный ген, который был обозначен как RYE9. Остальная часть этой статьи будет сосредоточена на пяти дополнительных группах, от ржи1 до ржи5 , которые имели несколько членов.

    Рисунок 1.

    — Снижение активности пути Ras привело к индукции экспрессии YGP1-SUC2 . Клетки дикого типа (PHY2161), ras-2-23 (PHY1340), cdc25-1 (PHY1452) и cdc28-4 (PHY1348) выращивали до фазы midlog при 25 ° в минимальной среде, а затем сместился на 37 °. Клетки собирали в указанные сроки после изменения температуры и обрабатывали на активность инвертазы, как описано в материалах и методах.Стандартные ошибки составляли от 10 до 15%. Каждое значение представляет собой среднее значение трех независимых экспериментов.

    Три гена RYE кодируют компоненты Ssn / Srb холофермента РНК pol II: Мутанты в группах комплементации ржи2, ржи3, и ржи5, обладают интересным набором фенотипов, которые отличают эти мутанты от мутантов других групп. группы (см. ниже). Эти данные предполагают, что продукты генов RYE2, RYE3 и RYE5 могут действовать на аналогичной стадии регуляции биологии стационарной фазы.Эти три гена RYE были клонированы, и было обнаружено, что каждый кодирует белок, связанный с субкомплексом холофермента РНК-полимеразы II. RYE2 был идентичен SSN8 / SRB11, RYE3 до SSN2 / SRB9 и RYE5 до SSN3 / SRB10 (рисунок 2A). Три белка Rye, Rye2p / Srb11p, Rye3p / Srb9p и Rye5p / Srb10p, вместе с четвертым белком, Srb8p, составляют функциональный комплекс Ssn / Srb (Carlson 1997; Myer and Young 1998).Этот комплекс Ssn / Srb, по-видимому, функционирует в первую очередь как негативный регулятор транскрипции РНК pol II на субнаборе дрожжевых промоторов (Carlson 1997; Hengartner et al. 1998; Holstege et al. 1998). Мы сконструировали нулевые аллели этих трех локусов RYE и обнаружили, что каждый нулевой мутант был жизнеспособным и проявлял фенотип Rye (рис. 2B). Эти данные согласуются с предыдущими сообщениями, указывающими на то, что эти гены не являются важными для жизнеспособности дрожжевых клеток (Surosky et al. 1994; Hengartner et al. 1995; Кучин и др. 1995; Liao et al. 1995; Song et al. 1996). В оставшейся части статьи мы будем ссылаться на эти гены по их обозначениям RYE и SRB , но в будущих сообщениях будут использоваться только более известные имена SRB .

    Фигура 2.

    — Гены RYE2, RYE3 и RYE5 кодируют компоненты Ssn / Srb холофермента РНК-полимеразы II.(A) Мутации ржи были дополнены наличием соответствующего гена SSN / SRB . Штаммы дрожжей выращивали с указанными плазмидами в течение 2-3 дней при 30 ° на среде YPAD (Glc) или BCP-сахароза (Suc). Используемые штаммы были дикого типа (PHY1220), ржи2 (PHY1378), ржи3 (PHY1382) и ржи 5 (PHY1397). (B) Нулевые аллели генов SSN / SRB привели к фенотипу ржи . Следующие штаммы выращивали в течение 3 дней при 30 ° на среде YPAD (Glc) или BCP-сахароза (Suc): дикого типа (PHY1220), srb11, Δ (PHY1616), srb9, Δ (PHY1606) и srb10 Δ (PHY1615).

    У мутантов ржи и srb обнаружены дефекты в регуляции YGP1 : Способность мутантов ржи расти на среде, содержащей сахарозу, предполагает, что эти мутанты экспрессируют репортер YGP1-SUC2 повышенные уровни во время роста в лог-фазе. Действительно, мутанты ржи имели в 13–57 раз более высокие уровни активности инвертазы, чем клетки дикого типа во время этой фазы роста (Таблица 4). В общем, относительная скорость роста на сахарозной среде была прямо пропорциональна уровню инвертазы, продуцируемой слитой конструкцией.Предыдущие исследования показали, что экспрессия YGP1 контролируется на уровне продукции мРНК (Destruelle et al. 1994). Наши данные согласуются с этим наблюдением, поскольку культуры логарифмической фазы мутантов ржи обладают повышенными уровнями мРНК YGP1-SUC2 (рис. 3А). Мутации ржи также повлияли на эндогенный ген YGP1 , поскольку экспрессия этого промотора также была повышена в культурах логарифмической фазы мутантов ржи (данные не показаны).Следовательно, гены RYE необходимы для правильной регуляции экспрессии гена YGP1 .

    ТАБЛИЦА 3

    Резюме рожь мутантные фенотипы

    Приведенные выше наблюдения предполагают, что мутанты ржи и могут быть дефектными по транскрипционной реакции на недостаток питательных веществ и / или задержку роста. Поэтому мы исследовали экспрессию трех дополнительных генов, HSP12, HSP26 и CTT1 , которые частично контролируются статусом роста клетки.В клетках дикого типа эти гены экспрессируются на очень низких уровнях во время экспоненциального роста, но индуцируются несколько раз во время диуксического сдвига (Petko and Lindquist 1986; Praekelt and Meacock 1990; DeRisi et al. 1997). Уровень мРНК каждого из этих генов был повышен в культурах логарифмической фазы большинства протестированных мутантов ржи (рис. 3А). Мутанты rye2 / srb11 и rye5 / srb10 продемонстрировали самый высокий уровень дерепрессии — уровни в четыре-семь раз выше, чем у клеток дикого типа.Мутации rye1 обычно приводили к трех-пятикратному увеличению уровней CTT1 и HSP12 , но оказывали лишь очень умеренное влияние на HSP26. Таким образом, дефекты мутанта ржи не были специфичными для YGP1 и вместо этого представляли более общий дефект в контроле роста.

    ТАБЛИЦА 4

    Уровни инвертазы из репортера YGP1-SUC2 были повышены у ржи мутантов

    Ростовые характеристики мутантов ржи были дополнительно проанализированы в различных условиях.Мутанты ржи показали относительно нормальные скорости роста при 25 ° и 30 ° на средах, содержащих глюкозу, галактозу или неферментируемый источник углерода. Однако некоторые из штаммов ржи показали медленную скорость роста при 38 ° (Таблица 3). Кроме того, мутанты rye1 и RYE9-1 и, в меньшей степени, rye4 плохо росли на средах без инозита (таблица 3). Многие из мутантов ржи также проявляли склонность к флокуляции в жидкой культуре (таблица 3).Наконец, многие из мутантов ржи и показали аномальную клеточную морфологию во время экспоненциального роста. Это было наиболее серьезным явлением у штаммов rye1 , где клетки часто были сильно удлиненными и иногда содержали несколько почек. Эти митотические дефекты могут либо указывать на митотическую роль продуктов гена RYE , либо быть вторичным следствием митотической экспрессии генов, обычно необходимых в периоды остановки роста.

    Мутанты ржи и srb не смогли войти в нормальную стационарную фазу в ответ на недостаток питательных веществ: Переход в стационарную фазу, по-видимому, связан с жестко регулируемой программой изменений экспрессии генов (Choder 1991; Werner-Washburne et al. 1993, 1996). Следовательно, нарушение этой программы может привести к невозможности перехода к нормальной стационарной фазе. Приведенные выше данные указывают на то, что мутанты ржи действительно обнаруживают дефекты в регуляции нескольких генов, которые индуцируются во время диуксического сдвига или при переходе в стационарную фазу. Поэтому мы спросили, будут ли мутанты ржи проявлять дефекты в других ответах, обычно связанных с переходом в стационарную фазу.

    Рисунок 3.

    — уровни мРНК в мутантах ржи и srb .(A) Уровни мРНК YGP1-SUC2, CTT1, HSP12, и HSP26 повышены во время логарифмической фазы у мутантов ржи и srb . Стационарные уровни мРНК YGP1-SUC2, CTT1, HSP12, HSP26, и ACT1 в культурах midlog указанных штаммов измеряли с помощью блоттинга Нозерн-РНК. Для каждого образца загружали двадцать микрограммов общей РНК. (B) Мутанты ржи и srb проявляли дефекты в репрессии стационарной фазы ACT1. Стационарный уровень мРНК ACT1 в культурах в стационарной фазе указанных штаммов измеряли с помощью Нозерн-блоттинга. Тотальную РНК получали из культур, выращенных в течение 6 дней при 30 ° в минимальной среде. Для каждого образца загружали двадцать микрограммов общей РНК. В качестве контроля загрузки уровни рРНК оценивали визуальным осмотром после окрашивания геля бромидом этидия. Анализируемые штаммы перечислены в легенде к Таблице 4; показан соответствующий генотип.

    При переходе в стационарную фазу уровень большинства мРНК резко снижается (Choder 1991). Этот феномен репрессии был лучше всего охарактеризован для локуса ACT1 , и поэтому мы измерили уровни мРНК ACT1 в мутантах ржи в разное время после лишения питательных веществ. В клетках дикого типа уровень мРНК ACT1 резко падал после 2 дней роста в минимальной среде (данные не показаны). Это наблюдение было похоже на наблюдение, сделанное в других исследованиях экспрессии генов стационарной фазы (Choder 1991; Choder and Young 1993).Напротив, уровни мРНК ACT1 оставались значительно повышенными после 6 дней роста во всех протестированных мутантах ржи , за исключением ржи (рис. 3В). Следовательно, мутанты ржи не показали нормального транскрипционного ответа на это ограничение питательных веществ.

    Рисунок 4.

    — Мутанты ржи и srb показали пониженную жизнеспособность после продолжительного периода нехватки питательных веществ. Штаммы дикого типа и указанные мутантные штаммы выращивали при 30 ° в течение 8 дней в минимальной среде YM-глюкозы.Клетки из этих культур собирали центрифугированием, промывали и ресуспендировали в дистиллированной воде при концентрации 1 OD 600 единицы на миллилитр. Пятикратные серийные разведения этих суспензий затем помещали в среду YPAD и инкубировали в течение 3 дней при 30 °. Количество сформированных колоний было мерой количества выживших в исходных культурах. Анализируемые штаммы перечислены в легенде к Таблице 4; показан соответствующий генотип.

    Одним из отличительных признаков ячеек со стационарной фазой является способность выдерживать длительные периоды голодания (Werner-Washburne et al. 1993). Мутанты, которые не могут войти в это состояние покоя, быстро теряют жизнеспособность при ограничении питательных веществ (Cannon and Tatchell 1987; Toda et al. 1987; Werner-Washburne et al. 1993). Поэтому мы оценили относительное количество выживших в культурах стационарной фазы дикого типа и мутантных штаммов ржи и . Как и ожидалось, мы обнаружили, что клетки дикого типа оставались жизнеспособными после 8 дней роста в минимальной среде (рис. 4). Напротив, мутанты ржи быстро утратили жизнеспособность из-за недостатка питательных веществ.После 8 дней роста штаммы rye1 , srb9, srb10 и srb11 показали выживаемость, по крайней мере, в 200 раз ниже, чем у изогенных штаммов дикого типа (рис. 4). Дефект жизнеспособности, связанный с мутантами rye4 , был менее серьезным. В целом культуры rye4 имели в 5-7 раз меньше выживших, чем контрольные культуры дикого типа. Следовательно, мутанты ржи и быстро теряли жизнеспособность из-за ограничения питательных веществ и, следовательно, не обладали одним из самых основных свойств, обычно связанных с клетками неподвижной фазы.

    Клетки с неподвижной фазой дикого типа также демонстрируют повышенную устойчивость к режимам теплового шока, которые убивают клетки логарифмической фазы (Werner-Washburne et al. 1993). Поэтому была протестирована чувствительность к тепловому шоку культур ржи , выращенных в течение 4 дней при 30 ° в минимальной среде. В это время дефект жизнеспособности в стационарной фазе, связанный с культурами ржи и , не был таким серьезным, как наблюдаемый через 8 дней. Тем не менее, мы обнаружили, что все мутанты ржи были намного более чувствительны, чем клетки дикого типа, к 20-минутной инкубации при 50 ° (рис. 5).Повышение чувствительности варьировало от 7 раз для мутантов rye1 и до 50 раз для мутантов rye4. Таким образом, эти данные предоставили независимое свидетельство того, что мутанты ржи не могли перейти в нормальную стационарную фазу.

    Рисунок 5.

    — Стационарные культуры мутантов ржи и srb были чувствительны к кратковременному тепловому шоку. Указанные штаммы выращивали при 30 ° в течение 4 дней в минимальной среде YM-глюкозы, а затем подвергали тепловому шоку 50 ° в течение 20 мин.Показан процент клеток, выживающих после этой обработки. Анализируемые штаммы перечислены в легенде к Таблице 4; показан соответствующий генотип. RAS2 val19 контроль представляет собой штамм дикого типа (PHY1220), несущий плазмиду с доминантным аллелем RAS2 val19 . Стандартные ошибки обычно составляли <10%. Каждое значение представляет собой среднее значение трех независимых экспериментов.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Гены RYE необходимы для перехода в стационарную фазу: Мы заинтересованы в понимании механизмов, регулирующих рост клеток и биологию стационарной фазы в S.cerevisiae. В этом исследовании мы определили набор мутантов, которые не смогли войти в нормальную стационарную фазу. Эти дефекты стационарной фазы, вероятно, были вызваны дефектной транскрипционной реакцией на ограничение питательных веществ. В клетках дикого типа лишение питательных веществ вызывает упорядоченную серию изменений в экспрессии генов, кульминацией которой является правильный переход в стационарную фазу (Choder 1991; DeRisi et al. 1997). Мутации ржи , выявленные в этом исследовании, нарушили эту транскрипционную программу; гены, которые обычно экспрессировались только при ограничении питательных веществ, вместо этого экспрессировались конститутивно во время лог-фазы роста.В результате клетки были неспособны подвергнуться нормальной остановке роста и, следовательно, не смогли принять многие характеристики, обычно связанные с клетками стационарной фазы. В целом, эти данные указывают на то, что гены RYE необходимы для правильного перехода в стационарную фазу роста.

    Белки Ssn / Srb холофермента РНК pol II необходимы для перехода в стационарную фазу: Это исследование установило, что по крайней мере три компонента определенного комплекса в составе холофермента РНК pol II играют роль в входе в стационарную фазу.Этот комплекс состоит из четырех белков: Rye2p / Srb11p, Rye3p / Srb9p, Rye5p / Srb10p и Srb8p, которые, по-видимому, функционируют в основном как негативные регуляторы транскрипции РНК pol II (Carlson 1997; Myer and Young 1998). Более того, недавнее исследование экспрессии генов у нуль-мутантов srb10 и подтвердило роль этого комплекса Ssn / Srb в транскрипционном ответе на депривацию питательных веществ (Holstege et al. 1998). Первичным дефектом штамма srb10 была повышенная лог-фазовая экспрессия многих генов, включая YGP1 , которые обычно экспрессируются во время недостатка питательных веществ.Наши данные согласуются с этими наблюдениями и расширяют их, показывая, что Srb10p требуется для правильного перехода в стационарную фазу. Столкнувшись с недостатком питательных веществ, наши мутанты rye5 / srb10 не смогли достичь многих свойств, обычно связанных с клетками стационарной фазы. Кроме того, наши результаты показали, что другие члены субкомплекса Srb10p, в частности Srb9p и Srb11p, также необходимы для нормального транскрипционного ответа на ограничение питательных веществ и для входа в стационарную фазу.

    Одна интересная возможность состоит в том, что этот комплекс Ssn / Srb служит мишенью для тех путей передачи сигналов, которые контролируют рост клеток в ответ на стимулы окружающей среды (Carlson 1997; Holstege et al. 1998; Cooper et al. 1999). В такой модели недостаток питательных веществ будет генерировать сигнал, который в конечном итоге приведет к инактивации этого комплекса Ssn / Srb, что приведет к повышенной экспрессии тех генов, которые необходимы в течение этого периода ограничения питательных веществ.Возможный механизм этой инактивации уже был предложен в предыдущих исследованиях этого регуляторного комплекса. Эти исследования показали, что Srb10p и Srb11p быстро разлагаются в ответ на депривацию глюкозы и, в случае Srb11p, в некоторых других стрессовых условиях (Cooper et al. 1997, 1999; Holstege et al. 1998). Однако еще не ясно, какие сигналы генерируются недостатком питательных веществ и какой путь передачи сигнала впоследствии отвечает за запуск деградационной реакции.Возможно, дополнительные мутанты ржи и дадут некоторое понимание механизмов, регулирующих этот комплекс Ssn / Srb.

    Гены RYE и контроль роста дрожжевых клеток: Хотя мы специально обсуждали комплекс Ssn / Srb как эффектор сигналов окружающей среды на экспрессию генов, интересно подумать, можно ли применить такой регуляторный механизм. в более общем смысле в эукариотических клетках. Было показано, что многие вспомогательные белки в составе холофермента РНК pol II взаимодействуют со специфическими подмножествами ДНК-связанных регуляторов транскрипции (Barberis et al. 1995; Пташне и Ганн 1997; Keaveney и Struhl 1998; Koh et al. 1998; Han et al. 1999). Следовательно, отдельные холоферментные белки могут нести ответственность за транскрипцию с разных наборов промоторов (Hampsey and Reinberg 1999; Han et al. 1999). Посредством прямого воздействия на эти холоферментные белки клетка сможет контролировать транскрипцию с нескольких промоторов за один шаг. Такой регуляторный механизм может позволить клетке вызывать довольно глобальные изменения в паттернах транскрипции очень быстрым и точным образом.Этот тип регуляторного подхода был бы очень полезен в тех случаях, когда клетки претерпевают драматические изменения в своей общей физиологии, например, во время перехода в состояние покоя, подобное G 0 .

    Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы, многие из событий, которые приводят к переходу в стационарную фазу, остаются плохо изученными. Например, хотя путь Ras явно является важным регулятором стационарной фазы, точные цели этого пути, имеющие отношение к контролю роста, остаются неуловимыми (Broach 1991; Werner-Washburne et al. 1993; Thevelein 1994; Герман и Райн 1997; Reinders et al. 1998). Эти трудности могут быть связаны с такими факторами, как существенная природа белков Ras и перекрывающиеся функции среди мишеней этого пути. Описанная здесь селекция рожь могла бы преодолеть такие сложности, позволяя идентифицировать мутанты только со скромными дефектами в передаче сигналов Ras (наши неопубликованные данные). Следовательно, другие гены RYE , идентифицированные в этом исследовании, представляют большой интерес, поскольку они могут пролить дополнительный свет на сигнальные пути, регулирующие биологию стационарной фазы.

    Благодарности

    Мы благодарим докторов наук. D. Balciunas, S. Emr, F. Estruch, D. Klionsky, H. Mitsuzawa и J. Thorner за предоставленные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании. Это исследование было поддержано грантами Американского онкологического общества, Ассоциации исследований рака Огайо, программы посевных грантов Университета штата Огайо (для P.K.H.), а также Национальных институтов здравоохранения (GM 35827 для J.R.). На ранних этапах этой работы P.K.H. был поддержан специальной наградой Американского общества лейкемии.

    • Получено 26 июня 2000 г.
    • Принято 12 сентября 2000 г.
    • Авторское право © 2001 Американского генетического общества

    jcli2616 3127..3145

    % PDF-1.4 % 1 0 obj > endobj 5 0 obj > endobj 2 0 obj > транслировать Acrobat Distiller 7.0 (Windows) 2009-06-20T11: 57: 55 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.0.223 / W2009-06-20T11: 57: 55 + 05: 30application / pdf

  • jcli2616 3127..3145
  • uuid: 4b578204-435f-4332-b9af-c3118af24b93uuid: 432eec00-3b90-4e4b-be52-e10e227073c3 конечный поток endobj 3 0 obj > endobj 4 0 obj > endobj 6 0 obj > endobj 7 0 объект > endobj 8 0 объект > endobj 9 0 объект > endobj 10 0 obj > endobj 11 0 объект > endobj 12 0 объект > endobj 13 0 объект > endobj 14 0 объект > endobj 15 0 объект > endobj 16 0 объект > endobj 17 0 объект > endobj 18 0 объект > endobj 19 0 объект > endobj 20 0 объект > endobj 21 0 объект > endobj 22 0 объект > endobj 23 0 объект > endobj 24 0 объект > endobj 25 0 объект > endobj 26 0 объект > endobj 27 0 объект > endobj 28 0 объект > транслировать x +

    Различные механизмы активируют путь PI 3-киназы / mTOR в меланомах: значение для использования ингибиторов PI 3-киназы для преодоления устойчивости к ингибиторам BRAF и MEK | BMC Cancer

    Корреляция между генотипами и активацией клеточного сигнального пути

    Основными генетическими дефектами, идентифицированными в пути PI3K при меланоме, на сегодняшний день являются делеции PTEN и небольшое количество мутаций PIK3CA .Однако наш генетический анализ клеточных линий NZM указывает на более сложную картину генетических изменений пути PI3K в клеточных линиях NZM, при этом многие линии имеют варианты более чем в одном гене этого пути (рис. 1). Из 52 секвенированных линий 3 имели онкогенных вариантов PIK3CA (NZM40 (h2047R), NZM52 (h2047R) и NZM91 (E545K)), подтвержденных как массивом масс Sequenom, так и секвенированием всего экзома (дополнительные таблицы S1, S2). Другая клеточная линия имела вариант PIK3CA I391M, вариант, ранее идентифицированный при раке толстой кишки, но не повышающий каталитическую активность [32].Вариант PIK3CA при h2047L в NZM13 был замечен только в анализе секвенирования. Амплификации в PIK3CA также наблюдались в 3 линиях. Мы идентифицировали варианты кодирования de novo в PIK3CB и PIK3CG в одной и двух строках соответственно (дополнительная таблица S2). Удивительно, но не было обнаружено de novo генетических вариантов в PIK3CD , учитывая, что варианты PIK3CD были идентифицированы ранее в ряде клеточных линий других типов рака [32].Основные новые открытия для каталитических субъединиц класса IA ​​заключались в том, что 11 линий имеют амплификации в PIK3CG , а в случае регуляторных субъединиц PI3K (дополнительная таблица S2) в ряде линий показано уменьшенное количество копий, а в нескольких линиях также имели варианты кодирования de novo в генах PIK3R1 , PIK3R2 , PIK3R3 , PIK3R5 и PIK3R6 (рис. 1 и дополнительная таблица S3).

    Рис. 1

    Генетические варианты генов пути PI3K.ДНК, выделенную из клеточных линий NZM, подвергали секвенированию всего экзома. Верхний ряд указывает количество вариантов на клеточную линию для включенных генов. Средние строки показывают отдельные варианты с цветовой кодировкой, обнаруженные в 52 клеточных линиях NZM. Боковые панели показывают процент клеточных линий с мутациями на ген. В нижнем ряду указаны названия линий клеток.

    Было обнаружено уменьшение количества копий PTEN , и, как ранее сообщалось, при меланоме, все они были в линиях, которые также содержали мутации BRAF .Мы также идентифицировали общее снижение количества копий других липидных фосфатаз, важных для регуляции пути PI3K. К ним относятся INPP4B , PHLLP1 , PHLLP2 и INPP5J , причем многие линии имеют одновременное сокращение числа копий в нескольких из этих генов, а также в генах PIK3R (рис. 1, дополнительная таблица S3 и Дополнительная таблица S4). Несколько удивительно, что генетические варианты, наблюдаемые в генах AKT, имели тенденцию к уменьшению числа копий, а не к вариантам, которые увеличивали бы активность (рис.1). В гене MTOR 10/52 секвенированных линий имели генетические варианты de novo (рис. 1 и дополнительная таблица S5). Хотя их функциональное влияние неизвестно, один новый миссенс-вариант находился в сайте Ser2448, который, как мы ранее показали, фосфорилируется с помощью Akt и участвует в регуляции активности mTOR [33]. Это было обнаружено в двух строках, сделанных для биопсий, последовательно взятых у одного и того же пациента. Вестерн-блоттинг этих линий (NZM42 и 48) подтвердил отсутствие фосфорилирования этого сайта в этих клетках (дополнительный рис.S1). Эти линии также содержали варианты Arg460Ter и Ile459Thr, комбинация, которая также была замечена в одной другой строке. Необходимы дальнейшие исследования механизма, с помощью которого эти варианты влияют на функцию mTOR.

    Вестерн-блоттинг был проведен на 75 линиях клеток меланомы NZM, чтобы понять уровни экспрессии компонентов сигнального пути PI3K (дополнительный рисунок S1). Это также важно для понимания того, могут ли эпигенетические факторы регулировать экспрессию таких генов, как PTEN .Это показало, что экспрессия всех изоформ PI3K класса 1 может быть обнаружена в панели линий клеток меланомы. Все клеточные линии показали сильную экспрессию каталитических субъединиц PI3K класса IA ​​p110α или p110β. Большинство клеточных линий также продемонстрировало сильную экспрессию p110δ, другой изоформы PI3K класса IA. Это не коррелировало с генотипом BRAF , NRAS или TERT . Экспрессия p110δ обычно ограничивается лейкоцитами, но сообщается о меланоцитах и ​​меланоме [34], а также в ограниченном диапазоне других видов рака [35].Все клеточные линии экспрессировали детектируемые уровни регуляторной субъединицы p85α адаптера PI3K класса IA, которая кодируется геном PIK3R1 (дополнительный рисунок S1). Большинство клеточных линий также экспрессируют PI3K p110γ класса IB, изоформу с ограниченной тканевой экспрессией [36]. Эта изоформа сигнализирует о рецепторах, связанных с G-белком, путем взаимодействия с субъединицей G-βγ гетеротримерных G-белков в сочетании с его адаптерной субъединицей p101 (кодируемой геном PIK3R5 ). Большинство клеточных линий также экспрессируют p101, что указывает на возможность передачи сигналов через PI3K класса IB в этих клетках.PI3K класса II и PI3K класса III также были обнаружены в большинстве клеточных линий (дополнительный рисунок S1, дополнительные таблицы S6 и дополнительные таблицы S7). Уменьшение числа копий PTEN [12, 37], INPP5J [38] и INPP4B [39, 40], как сообщается, является относительно частым явлением при меланоме. Эти изменения, вероятно, функционально важны для передачи сигналов PI3K, поскольку они, как правило, подавляют уровни конечного продукта PI3K PIP3. В целом, 17 из 75 клеточных линий показали потерю экспрессии PTEN, как измерено с помощью вестерн-блоттинга, а 20 из 75 клеточных линий показали отсутствие полноразмерного INPP4B.Активность эффектора Akt PIP3 может регулироваться фосфатазами PHLPP [41]. Только 2 из 75 клеточных линий показали полное отсутствие полноразмерного PHLPP1, а 6 из 75 клеточных линий показали полное отсутствие PHLPP2. Не наблюдали корреляции между низкими уровнями PHLPP1 и статусом мутации, хотя для PHLPP2 все линии с низкой экспрессией, кроме одной, оказались мутантными линиями BRAF .

    Все линии демонстрировали сильную экспрессию Akt1 и Akt2, которые лежат ниже PI3K, даже в клеточных линиях с уменьшением числа копий генов AKT (дополнительный рис.S1). Сообщалось о высоком уровне экспрессии Akt3 в некоторых меланомах, который может способствовать устойчивости к вемурафенибу [42]. Мы обнаружили, что Akt3 экспрессируется в 21 из 75 клеточных линий NZM, хотя это не коррелирует с генотипом BRAF или NRAS. Кроме того, 30 из 75 протестированных линий клеток имели высокие уровни экспрессии pAkt-Ser473, в то время как только 10 линий имели высокие уровни экспрессии pAkt-Thr308. Уровни pAkt в растущих клетках не коррелировали с уровнями Akt3 или со статусом делеции INPP4B , как сообщалось ранее [43, 44].Однако все линии NZM с онкогенными мутациями PIK3CA (3/75) или потерей PTEN на уровне белка (17/75) экспрессировали высокие базальные уровни pAkt-Ser473, что согласуется с предыдущими исследованиями [30, 43] .

    Понимание роли PI3K в росте клеток меланомы

    Затем мы протестировали ингибиторы пути PI3K на рост клеток в 5% -ном кислороде на более крупной панели клеточных линий (дополнительная таблица S8). Сначала мы использовали ZSTK474, который является нМ ингибитором всех PI3K класса I, но не ингибирует mTOR в этих концентрациях [45, 46].ZSTK474 сильно ингибировал пролиферацию большинства клеточных линий NZM, независимо от мутации драйвера в этих клеточных линиях (рис. 2a). Однако это ингибирование происходило в основном из-за индукции цитостаза, а не за счет гибели клеток. Кроме того, мы выполнили корреляционный анализ Пирсона и не обнаружили корреляции между ответом клеточных линий NZM на ZSTK474 и уровнями их экспрессии AKT1, AKT2, AKT и pAKT. Учитывая диапазон присутствующих изоформ PI3K, мы затем спросили, какая из них наиболее важна для эффектов роста, опосредованных PI3K.Однако селективные по отношению к изоформам ингибиторы PI3K в качестве отдельных агентов только ослабляли рост подмножества клеточных линий в концентрациях, при которых они, как считается, действуют на мишени (фиг. 2b-e). Ингибитор p110β TGX221 [30, 47] и ингибитор p110γ AS252424 [30, 48] мало влияли на рост клеток NZM (дополнительный рисунок S3). Однако A66 [30, 49], селективный ингибитор p110α, тесно связанный с BYL719, ослаблял рост значительной части клеточных линий в диапазоне концентраций, до 100 раз превышающих in vitro IC 50 препарата (рис.2б). Отзывчивость линий не зависит от статуса BRAF / NRAS. Клеточные линии, содержащие варианты генов PIK3CA и PIK3R1, не были особенно чувствительны к A66 (рис. 2c, d). Однако A66, как правило, был менее эффективным в линиях, показывающих потерю PTEN (рис. 2e). Селективный ингибитор p110δ IC-87114 [30, 50] ослаблял рост некоторых клеточных линий в диапазоне концентраций до 100 раз превышающих in vitro IC 50 препарата (рис. 3a). Однако важно отметить, что эффекты ингибирования роста A66 и IC87114 как отдельных агентов были намного меньше, чем у ZSTK474, что предполагает, что лекарство, нацеленное на все PI3K класса I, эффективно в большинстве клеточных линий NZM.Тем не менее, селективные по отношению к изоформам ингибиторы имели относительно небольшой эффект, и только ингибиторы p110α и p110δ имели частичное действие в ограниченном диапазоне клеточных линий. Клеточные линии с высокими уровнями экспрессии p110δ имели тенденцию быть более устойчивыми к IC87114 (рис. 3b). Не было корреляции между статусом PIK3CA или PIK3R1 и ответом на A66 или IC87114 (рис. 2 c, d и рис. 3 c, d). Кроме того, обработка клеток комбинацией A66 и IC87114 не имитировала эффект ингибитора pan-PI3K ZSTK474 (дополнительный рис.S4).

    Рис. 2

    Роль PI3K в росте клеток меланомы. Клетки меланомы высевали в 96-луночные планшеты (5000 клеток / лунку) и через 24 часа обрабатывали ингибиторами ( a ) ZSTK-474), ( b ) A66 в течение 3 дней. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа сульфородамина B (SRB). c Ответ на A66 в линиях NZM с вариантами PIK3CA. d Ответ на A66 в линиях NZM с вариантами PIK3R1. BRAF: линии мутантных клеток BRAF; RAS: линии мутантных клеток RAS; другое: клеточные линии дикого типа для BRAF и RAS.Данные были от 2 до 4 независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. Желтые области представляют собой диапазоны концентраций между биохимическими значениями IC50 и 100 x IC50 ингибиторов для их конкретных мишеней; ось x представляет значения EC50 на основе клеток; Ось у представляет% ингибирования при 100 мкМ соответствующих ингибиторов, где 100% ингибирование указывает на полную остановку роста клеток.

    Рис. 3

    Роль изоформы PI3-дельта в росте клеток меланомы. a Клетки меланомы высевали в 96-луночные планшеты (5000 клеток / лунку) и через 24 часа обрабатывали ингибиторами IC87114. b Ответ на IC87114 в линиях с высоким и низким уровнями экспрессии изоформы PIK3-Delta. c Ответ на IC87114 в строках с вариантами PIK3CA. d Ответ на IC87114 в строках с вариантами PIK3R1. BRAF: линии мутантных клеток BRAF; RAS: линии мутантных клеток RAS; другое: клеточные линии дикого типа для BRAF и RAS. Данные были от 2 до 4 независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. Желтые области представляют собой диапазоны концентраций между биохимическими значениями IC50 и 100 x IC50 ингибиторов для их конкретных мишеней; ось x представляет значения EC50 на основе клеток; Ось y представляет собой% ингибирования при 100 мкМ соответствующих ингибиторов, где 100% ингибирование указывает на полную остановку роста клеток

    Эффективность ингибиторов PI3K в линиях клеток, устойчивых к вемурафенибу

    Выводы о том, что ингибитор pan-PI3K эффективен в качестве единственного агента в большинстве клеточных линий NZM заставляет нас исследовать, будет ли он потенциально эффективен при меланомах, которые стали устойчивыми к ингибиторам BRAF.Для этого мы взяли линии NZM, которые изначально были чувствительны к вемурафенибу, CI1040 и ZSTK474, и культивировали их в возрастающих дозах вемурафениба от 0,5 до 20 микромоль в течение периода до 3 месяцев (рис. 4а). У шести из этих линий развилась устойчивость к вемурафенибу, они получили названия NZM 7PR, 12PR, 20PR, 22PR, 49PR и 65PR (рис. 4b). Это дало 6 модельных линий для изучения механизмов преодоления этого сопротивления. В четырех из этих линий также была частично снижена чувствительность к CI-1040 (NZM 7PR, 12PR, 20PR и 65PR — рис.4b), показывающий, что устойчивость к пути MEK / ERK может развиваться одновременно с устойчивостью к вемурафенибу. ZSTK474 оставался эффективным в снижении роста клеток во всех клеточных линиях, устойчивых к вемурафенибу, демонстрируя потенциал ингибирования пути PI3K в преодолении устойчивости к вемурафенибу. Однако чувствительность к ZSTK474 была частично снижена в 2 из этих линий (рис. 4в). Это сопровождалось изменениями экспрессии некоторых белков, участвующих в регуляции активности PI3K (дополнительный рис.S5). Не было обнаружено доказательств того, что изменения в передаче сигналов ERK в устойчивых линиях влияли на эффективность ингибиторов PI3K (дополнительные рисунки S5 и S6). Это указывает на то, что также может иметь место устойчивость к ингибированию пути PI3K.

    Рис. 4

    Эффективность ингибиторов PI3K в линиях клеток, устойчивых к вемурафенибу. a Шесть линий меланомы, изначально чувствительных к вемурафенибу, обрабатывались увеличивающимися концентрациями вемурафениба в течение 2 месяцев для создания устойчивых к лекарству клонов.Затем эти клоны были протестированы на их чувствительность к ( b ) вемурафенибу, ( c ) CI1040 и ( d ) ZSTK474. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа сульфородамина B (SRB). Данные были от 3 до 4 независимых экспериментов, выполненных в дубликатах

    Чтобы изучить степень устойчивости к ингибированию PI3K, мы культивировали эти линии в увеличивающихся концентрациях препарата до 10 мкМ, чтобы понять, может ли возникнуть полная устойчивость к PI3K (рис. 5а). ). Это действительно развилось в NZM7PR и NZM20PR, двух линиях, которые были частично устойчивы (рис.5б). Затем мы спросили, вызвана ли эта устойчивость к ZSTK474 постоянным изменением в опухолевых клетках, поэтому мы культивировали клетки в среде без лекарств, по крайней мере, в течение 4 пассажей. После этого отпуска с лекарственным средством клеточные линии повторно подвергали воздействию лекарственного средства во время анализа роста клеток. Интересно, что мы обнаружили, что одна из клеточных линий, устойчивых к ZSTK474, восстановила некоторую чувствительность к препарату (рис. 5c), но обе клеточные линии остались устойчивыми к вемурафенибу (рис. 5d), что позволяет предположить, что как адаптивная, так и приобретенная устойчивость к PI3K могут Это может быть подходом, который следует учитывать при приобретении устойчивости к ингибиторам PI3K в этом контексте.

    Рис. 5

    Эффективность нацеливания на PI3K в линиях клеток с двойной устойчивостью. а Схема развития линий клеток с двойной устойчивостью. NZM7PR и NZM20PR поддерживали в возрастающих концентрациях ZSTK474 для создания устойчивых к ZSTK474 клонов и тестировали на его чувствительность к ним по сравнению с его родительскими линиями ( b ). Кроме того, устойчивые к лекарственным средствам клоны поддерживали в среде, не содержащей лекарств, по меньшей мере в течение 4 пассажей и повторно заражали лекарственным средством в анализе кривой роста с ZSTK474 ( c ) и вемурафенибом ( d ).Все данные представляли собой среднее значение от 2 до 4 отдельных экспериментов, проведенных в дубликатах. Данные были от 3 до 4 независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах.

    Роль mTOR в пролиферации клеток

    Обнаружение того, что устойчивость развивается к ингибиторам PI3K, а также к вемурафенибу, привело нас к исследованию, может ли нацеливание на mTOR преодолеть эти проблемы. Для проверки роли mTOR в пролиферации клеток мы использовали селективный ингибитор mTOR KU-0063794 [51]. Эти исследования показывают, что ингибирование mTOR дает такую ​​же степень ингибирования в клетках, что и ZSTK474, лекарство, которое не реагирует перекрестно с mTOR (рис.6а). Поэтому мы проверили эффекты сочетания ингибирования PI3K и mTOR, чтобы увидеть, может ли быть какой-либо синергетический эффект. Для этого мы использовали NVP-BEZ235, препарат, который одинаково эффективен против mTOR и PI3K класса 1 [52]. Это было более эффективно при блокировании роста клеток, чем только ингибирование PI3K или mTOR во всех трех группах генотипов (рис. 6b). EC 50 эффектов находился в очень узком диапазоне для всех 75 клеточных линий, что соответствовало его действию на цель. Затем мы исследовали, может ли ингибирование mTOR преодолеть резистентность, развившуюся к ингибиторам BRAF и PI3K.Мы обнаружили, что все эти клетки остаются чувствительными к ингибированию mTOR (рис. 6c и d).

    Рис. 6

    Роль mTOR в пролиферации клеток меланомы. Клетки меланомы высевали в 96-луночные планшеты (5000 клеток / лунку) и через 24 часа обрабатывали ингибиторами ( a ) KU-0063794 и ( b ) NVP-BEZ235. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа сульфородамина B (SRB). c , d Пять родительских линий меланомы, их резистентность к вемурафенибу (PR для NZM7, 12, 20, 22 и 49) и соответствующие клетки с изъятым лекарственным средством были протестированы на их чувствительность к ингибитору mTOR ( c ) KU0063794 и ( d ) mTOR плюс двойной ингибитор PI3K NVP-BEZ235.BRAF: линии мутантных клеток BRAF; RAS: линии мутантных клеток RAS; другое: клеточные линии дикого типа для BRAF и RAS. Данные были от 3 до 4 независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. Желтые области представляют собой диапазоны концентраций между биохимическими значениями IC50 и 100 x IC50 ингибиторов для их конкретных мишеней; ось x представляет значения EC50 на основе клеток; Ось у представляет% ингибирования при 100 мкМ соответствующих ингибиторов, где 100% ингибирование указывает на полную остановку роста клеток.

    «Высокая чувствительность» является реальной характеристикой.Вот что он чувствует Li

    Как я преуспеваю в этом мире как (очень) чувствительное существо.

    Здоровье и благополучие затрагивают каждого из нас по-разному. Это история одного человека.

    На протяжении всей моей жизни я был глубоко поражен ярким светом, сильными запахами, зудящей одеждой и громкими звуками. Иногда мне кажется, что я могу интуитивно уловить чувства другого человека, улавливая его печаль, гнев или одиночество, прежде чем он сказал хоть слово.

    Кроме того, чувственные переживания, такие как прослушивание музыки, иногда переполняют меня эмоциями. Имея склонность к музыке, я могу играть мелодии на слух, часто угадывая, какая нота будет следующей, основываясь на ощущениях от музыки.

    Поскольку у меня усилилась реакция на свое окружение, мне сложно выполнять несколько задач одновременно, и я могу нервничать, когда происходит слишком много всего одновременно.

    Но в детстве мои манеры не считались артистичными или уникальными, а их называли причудливыми. Одноклассники часто называли меня «Человек дождя», а учителя обвиняли меня в невнимательности в классе.

    Списанный как странная утка, никто не упомянул, что я, скорее всего, был «высокочувствительным человеком» или СЧЛ — человеком с чувствительной нервной системой, на которого сильно влияют тонкости своего окружения.

    HSP — это не расстройство или состояние, а скорее личностная черта, также известная как чувствительность к обработке сенсорной информации (SPS). К моему удивлению, я совсем не чудак. Доктор Элейн Арон утверждает, что от 15 до 20 процентов населения являются СЧЛ.

    Оглядываясь назад, я могу сказать, что мой опыт СЧЛ сильно повлиял на мою дружбу, романтические отношения и даже привел меня к тому, что я стал психологом.Вот что на самом деле значит быть СЧЛ.

    В мой первый день в детском саду учитель прочитала правила класса: «Каждое утро кладите рюкзак в свою каморку. Уважайте своих одноклассников. Никакой болтовни ».

    Прочитав список, она сказала: «И, наконец, самое важное правило из всех: если у вас есть вопросы, поднимите руку».

    Несмотря на открытое приглашение, я задал мало вопросов. Прежде чем поднять руку, я изучал выражение лица учительницы, пытаясь понять, устала она, сердита или раздражена.Если она поднимала брови, я предполагал, что она расстроена. Если она говорила слишком быстро, я думал, что она нетерпелива.

    Прежде чем задать какой-либо вопрос, я спрашивал: «Можно ли задать вопрос?» Сначала мой учитель с сочувствием отнесся к моему неустойчивому поведению: «Конечно, все в порядке», — сказала она.

    Но вскоре ее сострадание превратилось в раздражение, и она закричала: «Я же говорила тебе, что тебе не нужно спрашивать разрешения. Разве ты не обратил внимания в первый день занятий? »

    Опозорившись за плохое поведение, она сказала, что я «плохой слушатель», и посоветовала мне «перестать требовать особого ухода.

    На детской площадке я изо всех сил пытался найти друзей. Я часто сидел один, потому что считал, что все злятся на меня.

    Насмешки со стороны сверстников и строгие слова учителей заставили меня отступить. В результате у меня было мало друзей, и я часто чувствовал себя чужим. «Держись подальше, и никто тебя не побеспокоит», — стала моей мантрой.

    3 вещи, которые СЧЛ хотят, чтобы вы знали


    • Мы глубоко чувствуем вещи, но можем скрывать свои эмоции от других, потому что мы научились отступать.
    • Мы можем чувствовать себя некомфортно в групповых ситуациях, таких как рабочие встречи или вечеринки, из-за слишком сильного раздражения, например громких шумов. Это не означает, что мы не ценим отношения.
    • Начиная новые отношения, такие как дружба или романтическое партнерство, мы можем искать утешения, потому что мы сверхчувствительны к любым предполагаемым признакам отказа.

    Когда мои друзья были влюблены в кого-то, они обращались ко мне за советом.

    «Как вы думаете, такой-то хочет, чтобы я позвонил, а он пытается получить доступ?» — спросил друг.«Я не верю в жесткую игру. Просто будь собой, — ответил я. Хотя мои друзья думали, что я чрезмерно анализирую каждую социальную ситуацию, они начали ценить мою проницательность.

    Однако постоянный эмоциональный совет и угождение другим стало привычкой, которую трудно сломать. Боясь быть замеченным, я вставлял себя в рассказы других людей, используя свою чувствительную натуру, чтобы выразить сочувствие и соболезнования.

    Пока одноклассники и друзья бегали ко мне за поддержкой, они почти ничего обо мне не знали, и я чувствовал себя невидимым.

    К тому времени, когда подошел мой последний год в старшей школе, у меня появился первый парень. Я свел его с ума.

    Я постоянно изучал его поведение и говорил ему, что мы должны поработать над нашими отношениями. Я даже предложил пройти тест Майерса-Бриггса, чтобы узнать, совместимы мы или нет.

    «Я думаю, что ты экстраверт, а я — интроверт!» — заявил я. Его не позабавила моя гипотеза, и он расстался со мной.

    «Очень чувствительных людей часто беспокоит громкий шум.Им может потребоваться отдых после интенсивной стимуляции. На высокочувствительных людей глубоко влияют чувства других, и они часто верят, что могут интуитивно уловить эмоции другого человека ».

    В 1997 году на уроке психологии профессор моего колледжа описал тип личности, о котором я никогда раньше не слышал, — очень чувствительного человека.

    Когда он перечислял типичные характеристики СЧЛ, мне казалось, что он читает мои мысли.

    По словам моего профессора, доктор Элейн Арон, психолог, ввела термин HSP в 1996 году.В ходе своего исследования Арон написала книгу «Очень чувствительный человек: как добиться успеха, когда мир подавляет вас». В книге она описывает типичные черты личности СЧЛ и то, как преуспевать в этом мире как чувствительное существо.

    Мой профессор сказал, что СЧЛ часто обладают интуицией и их легко чрезмерно стимулировать. Он поспешил указать, что Арон считает СЧЛ не личностными недостатками или синдромом, а скорее набором черт, проистекающих из чувствительной системы.

    Эта лекция изменила ход моей жизни.

    Заинтригованный тем, как чувствительность формирует нашу личность и взаимодействие с другими людьми, я пошел в аспирантуру и стал психологом.

    Как преуспеть в мире как HSP


    • Научитесь распознавать свои эмоции. Помните, что неприятные чувства, такие как беспокойство, грусть и подавленность, будут временными.
    • Управляйте стрессом, регулярно занимаясь спортом, хорошо выспавшись и рассказывая друзьям или терапевту о своих трудностях.
    • Сообщите друзьям, коллегам и членам семьи, что вы становитесь чрезмерно возбужденными в шумной обстановке. И дайте им знать, как вы справитесь с такими ситуациями: «Меня засыпает яркий свет, если я выйду на несколько минут, не волнуйтесь».
    • Начните практику самосострадания, направляя на себя доброту и благодарность вместо самокритики.

    Марва Азаб, профессор психологии и развития человека в Калифорнийском государственном университете в Лонг-Бич, в своем выступлении на TED о HSP отмечает, что высокочувствительные черты были подтверждены несколькими научными исследованиями.

    Хотя необходимы дополнительные исследования в области HSP, различных способов его проявления в людях и того, как мы можем справиться с сверхчувствительностью, для меня было полезно просто знать, что эта черта существует, и что я не одинок.

    Теперь я принимаю свою чувствительность как дар и забочусь о себе, избегая шумных вечеринок, страшных фильмов и неприятных новостей.

    Я также научился не принимать вещи на свой счет и осознавать ценность отказа от чего-либо.


    Джули Фрага — лицензированный психолог из Сан-Франциско, Калифорния.Она получила степень доктора психологических наук в Университете Северного Колорадо и училась в докторантуре Калифорнийского университета в Беркли. Страстно заботясь о женском здоровье, она подходит ко всем своим занятиям с теплотой, честностью и состраданием. Узнайте, чем она занимается, в Twitter .

    Влияние предполагаемых маркеров раковых стволовых клеток и экспрессии рецепторов факторов роста на чувствительность клеток рака яичников к лечению различными формами ингибиторов HER и цитотоксических препаратов

    Пуванентиран, Соозана, Эссапен, Шарадах, Седдон, Алан и Моджтахеди, Хельмут (2016) Влияние предполагаемых маркеров раковых стволовых клеток и экспрессии рецепторов фактора роста на чувствительность клеток рака яичников к лечению различными формами ингибиторов HER и цитотоксических препаратов. Международный онкологический журнал , 49 (5), С. 1825-1838. ISSN (печатный) 1019-6439

    Аннотация

    Повышенная экспрессия и активация рецептора эпидермального фактора роста человека (EGFR) и HER-2 были зарегистрированы при многочисленных раковых заболеваниях. Целью этого исследования было определение чувствительности большой панели линий клеток рака яичников человека (OCCL) к лечению различными формами низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназы (TKI) и цитотоксических препаратов.Цель состояла в том, чтобы увидеть, существует ли какая-либо связь между экспрессией белков различных биомаркеров, включая три предполагаемых маркера стволовых клеток рака яичников (CSC) (CD24, CD44, CD117 / c-Kit), P-гликопротеин (P-gp) и Члены ЕЕ семьи и реакция на лечение этими агентами. Чувствительность 10 линий опухолевых клеток яичников к лечению различными формами ИТК HER (гефитиниб, эрлотиниб, лапатиниб, сапитиниб, афатиниб, канертиниб, нератиниб), а также другими ИТК (дазатиниб, иматиниб, NVP-AEW541, кризотиниб) и цитотоксические агенты (паклитаксел, цисплатин и доксорубицин) в виде отдельных агентов или в комбинации определяли с помощью анализа SRB.Влияние этих агентов на распределение клеточного цикла и последующие сигнальные молекулы и миграцию опухоли определяли с помощью проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и анализа миграции клеток IncuCyte Clear View соответственно. Из ингибиторов HER необратимые пан-TKI (канертиниб, нератиниб и афатиниб) были наиболее эффективными TKI для ингибирования роста всех клеток рака яичников и для блокирования фосфорилирования EGFR, HER-2, AKT и MAPK в клетках SKOV3. . Интересно, что хотя большинство раковых клеток были очень чувствительны к лечению дазатинибом, они были относительно устойчивы к лечению иматинибом (т.е. IC50> 10 мкМ). Из цитотоксических агентов паклитаксел был наиболее эффективным для ингибирования роста OCCL, и из различных комбинаций этих препаратов только лечение комбинацией NVP-AEW541 и паклитаксела оказывало синергетический или аддитивный антипролиферативный эффект во всех трех клеточных линиях. исследовали (т.е. SKOV3, Caov3, ES2). Наконец, из TKI только лечение афатинибом, нератинибом и дазатинибом могло снизить миграцию клеток SKOV3, гиперэкспрессирующих HER-2.