Жгут кровоостанавливающий meridian венозный с пластмассовой застежкой

Жгут кровоостанавливающий — приспособление для временной остановки кровотечения из сосудов конечности путем кругового ее перетягивания и сдавления тканей конечности вместе с кровеносными сосудами. Кровоостанавливающий жгут  применяют и для обескровливания тканей при операциях на кисти и стопе, ампутациях конечностей и др. Для сдавления только венозных сосудов кровоостанавливающий жгут накладывают при венепункциях  и с целью удлинения срока действия регионарной внутрикостной и внутривенной анестезии.

Кровоостанавливающий жгут накладывают только при значительном артериальном кровотечении; при венозном и небольшом артериальном кровотечении можно наложить давящую повязку. Кровоостанавливающий жгут должен располагаться центральнее поврежденного участка: при ранении нижней   конечности  —   на  любом уровне бедра, верхней конечности — на плече, кроме средней его трети из-за опасности сдавления нервных стволов. Во избежание ущемления кожи под кровоостанавливающий жгут подкладывают мягкую подкладку, например полотенце, расправленную часть одежды, слой ваты и т. п. При правильном наложении кровоостанавливающего жгута исчезает пульс на периферической артерии, конечность дистальнее кровоостанавливающего жгута бледнеет, кровотечение прекращается. Слабо затянутый кровоостанавливающий жгут вызывает венозный застой, отек и усиление кровотечения из раны. Чрезмерное стягивание жгутом конечности может привести к сдавлению нервов с последующими параличами. Кровоостанавливающий жгут может находиться на конечности не более 2 часов во избежание омертвения тканей. Поэтому необходимо четко указывать время наложения кровоостанавливающего жгута на специальной бирке, закрепленной на жгуте, или в сопроводительном листке. При необходимости оставить кровоостанавливающий жгут на более длительное время его нужно распустить на несколько секунд (в этот момент артерию прижимают пальцем) или переложить на новое место, несколько центральнее.

кровоостанавливающий — это… Что такое кровоостанавливающий?

кровоостанавливающий

прил.

emostatico

Итальяно-русский словарь. 2003.

• кровообращение
• кровопийца

Смотреть что такое «кровоостанавливающий» в других словарях:

• кровоостанавливающий — кровоостанавливающий …   Орфографический словарь-справочник

• КРОВООСТАНАВЛИВАЮЩИЙ — и (устар.) кровеостанавливающий, кровеостанавливающая, кровеостанавливающее (мед.). Способствующий прекращению кровотечения. Кровоостанавливающие средства. Толковый словарь Ушакова. Д.Н. Ушаков. 1935 1940 …   Толковый словарь Ушакова

• кровоостанавливающий — прил., кол во синонимов: 3 • анастальтический (1) • гематостатический (1) • …   Словарь синонимов

• Кровоостанавливающий — прил. Предназначенный для остановки кровотечения. Толковый словарь Ефремовой. Т. Ф. Ефремова. 2000 …   Современный толковый словарь русского языка Ефремовой

• кровоостанавливающий — кровоостан авливающий …   Русский орфографический словарь

• кровоостанавливающий — кровоостана/вливающий …   Слитно. Раздельно. Через дефис.

• кровоостанавливающий — ая, ее. Предназначенный для прекращения кровотечения. К ие средства …   Энциклопедический словарь

• кровоостанавливающий — ая, ее. Предназначенный для прекращения кровотечения. К ие средства …   Словарь многих выражений

• кровоостанавливающий — кров/о/останавл/ива/ющ/ий …   Морфемно-орфографический словарь

• Кровоостанавливающий порошок — смесь из равных частей аравийской камеди, квасцов и канифоли …   Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

• Жгут кровоостанавливающий — I Жгут кровоостанавливающий приспособление для сдавления мягких тканей конечности с целью временной остановки кровотечения или временного выключения конечности из общего кровотока. Наибольшее распространение получил жгут Эсмарха, представляющий… …   Медицинская энциклопедия

Гемостатические средства для остановки догоспитального кровотечения: повествовательный обзор | Военно-медицинские исследования

1.

Stannard A, Morrison JJ, Scott DJ, Ivatury RA, Ross JD, Rasmussen TE. Эпидемиология кровоизлияния в несжимаемый торс в войнах в Ираке и Афганистане. J Trauma Acute Care Surg. 2013; 74 (3): 830–4.

PubMed Статья Google Scholar

5.

США Бремя болезней Соавторы. Состояние здоровья США, 1990–2010 годы: бремя болезней, травм и факторов риска. ДЖАМА. 2013. 310 (6): 591–606.

Артикул CAS Google Scholar

9.

Стивенс CT, Gumbert S, Holcomb JB. Кровотечение, связанное с травмой: лечение массивного переливания крови. Curr Opin Anesthesiol. 2016; 29 (2): 250–5.

CAS Статья Google Scholar

19.

Rappold JF, Bochicchio GV. Хирургические дополнения к кровотечениям из несжимаемого туловища как инструменты для контроля крови пациента. Переливание. 2016; 56 (Приложение 2): 203–7.

Артикул Google Scholar

23.

Pusateri AE, Delgado AV, Dick EJ Jr, Мартинес RS, Holcomb JB, Ryan KL. Применение гранулированного гемостатического средства на минеральной основе (QuikClot) для уменьшения кровопотери после повреждения печени V степени у свиней. J Trauma. 2004. 57 (3): 555–62.

PubMed Статья Google Scholar

30.

Otrocka-Domagała I, Jastrzębski P, Adamiak Z, Paździor-Czapula K, Gesek M, Mikiewicz M, et al. Безопасность длительного применения боевой марли QuikClot, ChitoGauze PRO и марли Celox на модели повреждения бедренной артерии у свиней — предварительное исследование.Pol J Vet Sci. 2016; 19 (2): 337–43.

PubMed Статья CAS PubMed Central Google Scholar

36.

Sanders S, Tien H, Callum J, Nascimento B, Peng H, Funk C и др. Фибриноген концентрируется в условиях сил специальных операций. Mil Med. 2018; 183 (1–2): e45–50.

PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

52.

Беннетт Б.Л., Литтлджон Л.Ф., Хейрабади Б.С., Батлер Ф.К., Котвал Р.С., Дубик М.А. и др.Лечение наружного кровотечения в тактических боевых действиях при оказании помощи раненым: гемостатические марлевые повязки на основе хитозана. Изменения в руководстве TCCC 13-05. J Spec Oper Med. 2014; 14 (3): 12–29.

Google Scholar

59.

Sperry JL, Guyette FX, Brown JB, Yazer MH, Triulzi DJ, Early-Young BJ, et al.Догоспитальная плазма при воздушной медицинской транспортировке у травмированных больных с риском геморрагического шока. N Engl J Med. 2018; 379 (4): 315–26.

PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

62.

Aubron C, Reade MC, Fraser JF, Cooper DJ. Эффективность и безопасность концентрата фибриногена у пациентов с травмами — систематический обзор.J Crit Care. 2014; 29 (3): 471 e11–7.

PubMed Google Scholar

66.

Peralta MR, Chowdary P. Использование новых прокоагулянтов при тупых и проникающих травмах.Curr Opin Anesthesiol. 2019; 32 (2): 200–5.

Артикул Google Scholar

88.

Озьер Й, Хант Б.Дж. Концентрат фибриногена для остановки кровотечения: от неизбирательного использования. J Thromb Haemost. 2011; 9 (1): 6–8.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

118.

Chan V, Sarkari M, Sunderland R, St. John AE, White NJ, Kastrup CJ. Тромбоциты, нагруженные инкапсулированным в липосомы тромбином, имеют повышенную свертываемость. J Thromb Haemost. 2018; 16 (6): 1226–35.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

124.

Онвукве С., Майша Н., Холланд М., Варлей М., Гройном Р., Хикман Д. и др. Разработка наночастиц, вводимых внутривенно, для уменьшения инфузионной реакции и остановки кровотечения в модели травмы на большом животном.Bioconjug Chem. 2018; 29 (7): 2436–47.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

127.

Чан Л.В., Ким СН, Ван Х, Пан Ш., Уайт Нью-Джерси, Ким Т.Х. Хитозановые сетки, модифицированные PolySTAT, для улучшения гемостаза при наружном кровотечении. Acta Biomater. 2016; 31: 178–85.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

130.

Hansen CE, Myers DR, Baldwin WH, Sakurai Y, Meeks SL, Lyon LA, et al. Гибриды тромбоцитов и микрокапсул усиливают сократительную силу для адресной доставки гемостатических агентов.САУ Нано. 2017; 11 (6): 5579–89.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

137.

Шауэр С.Г., апрель доктор медицины, Нейлор Дж.Ф., Мэддри Дж.К., Арана А.А., Дубик М.А. и др. Догоспитальное применение кровоостанавливающих средств в Ираке и Афганистане. Prehosp Emerg Care. 2018; 22 (5): 1–10.

Google Scholar

140.

Шина А., Липски А.М., Надлер Р., Леви М., Бенов А., Ран Y и др. Использование гемостатических повязок на догоспитальном этапе медицинским корпусом сил обороны Израиля: серия случаев с участием 122 пациентов. J Trauma Acute Care Surg. 2015; 79 (4): S204–9.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

143.

Sena MJ, Douglas G, Gerlach T., Grayson JK, Pichakron KO, Zierold D. Пилотное исследование использования пропитанной каолином марли (боевой марли) для упаковки тяжелых повреждений печени при гипотермической коагулопатии. модель свиньи. J Surg Res. 2013. 183 (2): 704–9.

CAS PubMed Статья Google Scholar

146.

Гегель Б.Т., Остин П.Н., Джонсон А. Научно обоснованный обзор использования боевой марли (QuikClot) для контроля кровотечения. ААНА J. 2013; 81 (6): 453–8.

PubMed PubMed Central Google Scholar

167.

Изуми Ю., Гика М., Шинья Н., Миябашира С., Имамура Т., Нозаки С. и др. Гемостатическая эффективность покрытого рекомбинантным тромбином листа полигликолевой кислоты, соединенного с жидким фибриногеном, оценивалась на собачьей модели кровотечения из легочной артерии.J Trauma. 2007; 63: 783–7.

PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

Гемостатические стратегии при травматических и хирургических кровотечениях

Abstract

Широкий интерес к новым гемостатическим подходам вызван неудовлетворенными потребностями в больнице и на поле боя.Многие современные коммерческие кровоостанавливающие средства не соответствуют требованиям безопасности, эффективности, стоимости и хранения. Академическая направленность привела к совершенствованию существующих стратегий, а также к новым разработкам. В этом обзоре будут определены и обсуждены три основных класса гемостатических подходов: материалы биологического происхождения, материалы синтетического происхождения и гемостатические агенты, вводимые внутривенно. Сначала обсуждается общий класс, затем подробно обсуждаются конкретные подходы, включая гемостатические механизмы и развитие метода.По мере развития гемостатических стратегий и более полного понимания синтетико-биологических взаимодействий текущие клинические методологии будут заменены.

Ключевые слова: кровоостанавливающее средство, кровотечение, гемостаз, травма, хирургия

ВВЕДЕНИЕ

Неконтролируемое кровотечение сопряжено со значительными рисками и расходами со смертельным исходом на поле боя, в экстренных случаях и в больницах. В армии 50% смертей являются результатом обескровливания. Восемьдесят процентов этих смертей являются результатом несжимаемых травм, что делает их основной причиной смерти в военных условиях. ^1,2 Крайне важно немедленно остановить кровотечение, чтобы снизить уровень смертности, поскольку кровотечение может произойти в течение 5–10 минут. ³ Считается, что усовершенствования в лечении проникающих ранений и ранений туловища имеют наибольшее потенциальное влияние на снижение числа погибших в результате боевых действий и умерших от ран. ⁴ В условиях чрезвычайных ситуаций среди гражданского населения на кровотечение приходится треть всех случаев смерти на догоспитальном этапе, и эта цифра не уменьшалась за последние 30 лет. ⁵ В операционной при хирургических вмешательствах, включая сердечно-сосудистые, печеночные, ортопедические и спинномозговые, высока вероятность тяжелой кровопотери, требующей какого-либо гемостатического вмешательства. ⁶

Гемостаз — это многогранная реакция организма на кровотечение. При первичном гемостазе формируется начальная тромбоцитарная пробка. Когда сосудистая ткань повреждена, тромбоциты активируются и испускают химические сигналы, которые вызывают агрегацию и вызывают прилипание к субэндотелиальному матриксу. Активированные поверхностные рецепторы взаимодействуют, и между субэндотелием и другими активированными тромбоцитами образуются белковые мостики, образуя прочную начальную гемостатическую пробку. ⁷ Вторичный гемостаз, или каскад коагуляции, делится на два ферментативных пути: внутренний (контактная активация) и внешний (тканевой фактор).Эти пути сходятся и приводят к образованию фибринового сгустка, который укрепляет первичную пробку тромбоцитов (). Внешний путь начинается, когда травма сосудистой сети приводит к попаданию тканевого фактора в кровь, активируя фактор свертывания крови VII (FVII). Возникающее в результате образование комплекса FVII с активным тканевым фактором инициирует и усиливает каскад коагуляции. Внутренний путь активирует фактор XII при повреждении поверхности, что приводит к последующей протеолитической активации других факторов свертывания. Эти два пути сходятся в общий путь при активации фактора X (FX).FX расщепляет протромбин на тромбин, который, в свою очередь, активирует фибриноген в фибрин, укрепляя пробку тромбоцитов. ^8,9 В случае тяжелой или неконтролируемой кровопотери естественный процесс свертывания крови в организме сам по себе не может способствовать гемостазу.

Схема каскада коагуляции. Активация контактной активации и / или пути тканевого фактора вызывает последовательные протеолитические стадии, которые приводят к образованию сшитого фибринового сгустка. Каждый фактор свертывания крови представлен римской цифрой, а активная форма — буквой а.

Область исследования гемостатических материалов отстала от других медицинских достижений, сделав несколько крупных клинических разработок. Сжатие марлей по-прежнему является распространенной практикой при большинстве травм, и в последнее десятилетие используются наиболее распространенные хирургические методы с минимальными изменениями. Отсутствие значительного прогресса не означает уменьшения потребности. В самых последних полных обзорах местных гемостатических средств, ¹⁰ герметиков для ран, ¹¹ хирургических кровоостанавливающих средств, ¹² и кровоостанавливающих средств для применения в военных целях и для оказания первой помощи, ¹³ о необходимости будущих исследований и разработок улучшенных кровоостанавливающих средств и устройств подчеркивается.Их оценки кровоостанавливающих средств, доступных в настоящее время для коммерческого использования в хирургии и контроле травматических кровотечений, относятся к категории. Идеальный гемостат безопасен, эффективен, легко хранится и используется, дешев и может получить одобрение регулирующих органов. ^12,14,15 Многие материалы, доступные на коммерческом уровне, не соответствуют всем этим требованиям.

ТАБЛИЦА I

Коммерчески доступные кровоостанавливающие средства

В то время как обычная практика После этого радикально не изменилось, на академическом уровне были проведены серьезные исследования новых гемостатических подходов.Эти стратегии включают использование белков коагуляции, in situ, , образующих гели, синтетических полимеров и искусственных тромбоцитов, среди прочего. Этот обзор будет сосредоточен на материальных платформах, стратегиях функционализации и их целевых гемостатических механизмах. Мы выделили три основных класса гемостатических подходов: материалы биологического происхождения, материалы синтетического происхождения и гемостатические агенты, вводимые внутривенно. Сначала обсуждается общий класс, затем подробно рассматриваются конкретные подходы, включая гемостатические механизмы и развитие метода.Классификация каждого подхода на основе основной платформы; однако многие недавно разработанные агенты используют несколько материалов или механизмов и могут относиться к нескольким различным классам.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Преобладание гемостатических материалов биологического происхождения можно объяснить их четкими механизмами действия и эффективности. Встречающиеся в природе белки и полисахариды, которые обычно используются, могут либо играть прямую роль в гемостазе, например, факторы свертывания крови, либо иметь другие гемостатические свойства.Последний включает альбумин, коллаген, желатин, полипептиды, кератин, хитозан, целлюлозу и декстран. Хитозан, целлюлоза и декстран получены соответственно из ракообразных, растений и бактерий (). Все эти соединения изолированы и обрабатываются для создания эффективных и легко вводимых гемостатических агентов.

Структуры полисахаридов природного происхождения: (а) хитозан, (б) целлюлоза и (в) декстран.

Коагуляционные белки

Фибриноген, фибрин и тромбин широко исследовались для гемостатического использования, учитывая их прямую роль во вторичном гемостазе и образовании сгустков.В последнем общем каскаде тромбин реагирует с фибриногеном с образованием мономеров фибрина, которые полимеризуются с образованием структуры сгустка. Способы получения и концентрирования этих соединений со временем изменились, чтобы повысить эффективность и снизить риск заражения патогенами. ¹⁶ После выделения фибриноген и тромбин могут содержаться в повязках под давлением для контроля артериального кровотечения ¹⁷ и превращаться в рассасывающиеся сухие адгезивные повязки на основе фибрина. ^16,18,19 Фибриноген также был электроспряден в трехмерные структуры из нановолокон ²⁰ и подвергнут фотохимическому сшиванию с использованием рутения и персульфата in vivo для получения потенциально нецитотоксичного герметика для ран. ^21,22

Недавно были исследованы новые системы доставки этих белков свертывания крови. Smeets et al. разработали губку из коллагена, содержащую биоразлагаемые микросферы, нагруженные тромбином, для местного высвобождения тромбина и контроля послеоперационных кровотечений. ²³ Шукла и др. покрытие активных белков коагуляции путем послойной сборки на желатиновой губке с водопоглощающими свойствами. ²⁴ Успех этих типов агентов во многом обусловлен сочетанием нескольких механизмов прямого гемостаза.Ни один из этих подходов не позволил полностью решить проблемы коротких сроков хранения, высоких затрат на одно применение, потенциального риска вирусного заражения, неблагоприятных тромботических явлений на дистальных участках и значительных производственных препятствий. ^16,25

Альбумин

Альбумин — водорастворимый белок, полученный из плазмы крови, часто бычьей. Он приобрел популярность как коммерчески доступное кровоостанавливающее средство в форме хирургического клея. BioGlue ^® обычно используется в кардиохирургии и образует прочный тканевый герметик за счет химического сшивания альбумина бычьей сыворотки и глутаральдегида. ²⁶ Первоначально эффективный и относительно доступный, были серьезные опасения по поводу высвобождения глутаральдегида, вызывающего токсичность in vitro и in vivo . ²⁷ В качестве альтернативы Xie et al. продемонстрировали использование концентрированного альбумина в качестве хирургического клея для усиления эффектов коагуляции аргоновым лучом на модели повреждения печени. ²⁸ Этот метод улучшил время до гемостаза и общий результат хирургического вмешательства, но метод требовал доступа к пучку аргона и не уменьшал риск передачи болезней млекопитающих.

Коллаген и желатин

Коллаген — это соединение, присутствующее во внеклеточном матриксе клеток животных. Прилипание тромбоцитов к фибриллам коллагена или нерастворимым микрочастицам коллагена в ране сосудистой ткани является ранним этапом первичного гемостаза. ^29,30 Было показано, что несколько белков, таких как гликопротеины тромбоцитов и молекулы фактора фон Виллебранда, взаимодействуют и связываются с коллагеном типов I и III. ^31,32 Рекомбинантный человеческий коллаген III типа индуцирует агрегацию тромбоцитов и, в свою очередь, гемостатическую активность. ³³ Эффективность коллагена привела к тому, что вместо его высокой стоимости он был включен в коммерчески доступные кровоостанавливающие губки, подушечки, повязки и пены. ¹⁰

Желатин, полученный из денатурированного коллажа, используется в различных гемостатических материалах. Используя высокую пористость и шероховатость поверхности химически сшитого желатина, Hajosch et al. разработали губку с высокой впитывающей способностью крови. ³⁴ Гемостатическая активность в модели in vitro, и in vivo, объясняется взаимодействием и адгезией тромбоцитов и белков коагуляции с шероховатой поверхностью губки.В другом исследовании желатин, действующий вместо структурного белка, был сшит in situ кальций-независимым микробным ферментом трансглутаминазой с образованием хирургического клея, имитирующего естественный сгусток, продемонстрированный при повреждениях печени и бедренной артерии крыс. ³⁵

Ohya et al. исследовали термореактивную систему, в которой использовалась водная смесь гиалуронана с привитым поли (N-изопропилакриламидом) (PNIPAM) и макромолекул желатина с привитым PNIPAM. ^36–38 Гиалуронан — это естественный клеточный компонент с известной биосовместимостью, а PNIPAM — синтетический полимер, который претерпевает фазовый переход золь-гель при физиологической температуре.Полученная смесь оставалась водорастворимой при комнатной температуре, но превращалась в гель in situ при физиологической температуре. Протестированные на моделях повреждений уколом иглой, материал показал слабую адгезию и покрытие участка в течение минуты и достиг полного гемостаза в течение 1-2 часов. Хотя температурно-зависимый переход золь-гель может быть полезен, увеличенное время до гемостаза на модели нетяжелой травмы ставит под сомнение полезность этого конкретного подхода.

Желатин также исследовался как альтернатива альбумину или фибрину в сшивающем хирургическом клее.Первоначальные эксперименты показали увеличение прочности склеивания и устойчивости к давлению воды по сравнению с фибриновым клеем и снижение цитотоксичности по сравнению с коммерческим альбуминовым клеем. ³⁹ Материалы на основе желатина, хотя и эффективны, они дороги, чрезмерно набухают и часто используются с факторами свертывания, такими как тромбин, для улучшения гемостатических характеристик. ¹⁰

Полипептид

Использование полипептидных гемостатических средств привлекательно из-за присущей им биосовместимости и возможности самосборки.Клей поли (L-глутаминовая кислота) -желатин был разработан Отани и др., Но он требовал предварительного нагрева и стадии сшивания карбодиимидом, который может взаимодействовать с окружающей тканью. ^40,41 Ruan et al. использовали самособирающиеся комплементарные амфифильные пептиды, которые требуют обработки ультразвуком перед применением. ⁴² Эти предварительные этапы применения и высокая стоимость этих подходов ограничивают их потенциал для будущего использования в клинической среде.

Самособирающиеся полипептиды, которые претерпевают переходы золь-гель в ионных средах, также были исследованы. ^43,44 Эти стратегии не требуют предварительного этапа применения и способны немедленно вызвать гемостаз в различных моделях травм крыс. Хотя гемостатические средства на основе полипептидов считаются биоразлагаемыми, долгосрочные исследования биосовместимости или разложения для любого из обсуждаемых подходов не проводились. Кроме того, не решаются вопросы стоимости и производства, связанные с текущими коммерческими кровоостанавливающими средствами.

Кератин

Кератины — это белки, которые образуют защитные структуры у позвоночных и обычно извлекаются из волос, но также присутствуют в эпидермальных и скелетных тканях. ⁴⁵ Группа Ван Дайка исследовала гемостатический потенциал материалов на основе кератина, используя гидрогели человеческого волоса, которые вызывают значительную агрегацию красных кровяных телец, хорошо прилипают к ткани и имеют аналогичные показатели выживаемости на модели кролика со смертельным рассечением печени по сравнению с коммерческие кровоостанавливающие средства Hemcon ^® и Quikclot ^® . ⁴⁶ Также была продемонстрирована способность кератина стимулировать клеточную адгезию в качестве лиганда и гемостатическую способность на модели летального перерезки печени свиней. ^47,48 Дальнейшее исследование гемостатических механизмов кератинового гидрогеля выявило прямое ускорение каскада коагуляции, но конкретный механизм активации не был определен, оставив опасения по поводу безопасности. ⁴⁹ Ожидается, что гидрогели кератина будут биосовместимыми и биоразлагаемыми посредством фагоцитоза макрофагов. ^50,51 Однако ни об одном из них не сообщалось о применении гемостатических средств, а временные рамки деградации недостаточно хорошо описаны.

Хитозан

Хитозан, полисахарид, представляет собой деацетилированную форму хитина и получают из экзоскелета ракообразных.Хитозан образует сгусток в контакте с цельной кровью, что обусловлено его поликатионной структурой и неспецифическим связыванием с клеточными мембранами, что вызывает широкий интерес к гемостатическим материалам. ⁵² Кроме того, было показано, что хитозан нетоксичен и ферментативно разлагается. ⁵³ Benesch et al. обнаружили, что ацетилированный хитозан является сильным активатором коагуляции, но не связывает фибриноген или другие белки плазмы, как деацетилированный хитозан. ⁵⁴ Ян и др. исследовали различия в молекулярной массе хитозана и степени деацетилирования в дополнение к сравнению гемостатического механизма хитозана в твердом состоянии, хитозана в физиологическом растворе уксусной кислоты и карбоксиметил хитозана в физиологическом растворе. ⁵⁵ Они пришли к выводу, что хитозан в твердом состоянии способствует гемостазу за счет адсорбции тромбоцитов, тогда как хитозан в растворе способен вызывать агрегацию эритроцитов. Кроме того, они обнаружили, что молекулярная масса и деацетилирование оказывают значительное влияние на гемостатическую активность.

Немодифицированный хитозан в растворе, композитные волокна, покрытия, порошок, пленки и гидрогели с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования для гемостатического применения были всесторонне рассмотрены Whang et al. ⁵⁶ Эти подходы к материалам привели к широкому использованию в военных целях в виде повязок HemCon ^® и ChitoFlex ^® . ^56–58 Хотя они показали значительные преимущества по сравнению со стандартной марлей, сообщалось об ограничениях, связанных с серьезными травмами и вариабельностью повязок. ^59,60 Несмотря на эти недостатки, хитозан по-прежнему является очень многообещающим кандидатом для разработки гемостатического материала, ведущего к исследованию его функционализации () и использования в композитных материалах.

Структура (а) хитозана, (б) хитозана, функционализированного ПЭГ-тирамином, ⁶⁸ (в) хитозана, конъюгированного с катехином, ⁶⁷ и (г) гидрофобно модифицированного хитозана. ⁶⁶

Онг и др. предприняли шаги по улучшению гемостатических средств на основе хитозана путем включения полифосфатов и наночастиц серебра с целью улучшения гемостатических и антимикробных свойств. Полифосфат улучшает структуру фибринового сгустка и действует как прокоагулянт. ^61–63 Однако этот подход привел к in vitro, фибробластной токсичности, ⁶⁴ и связан со значительными затратами.Kumar et al. сформировали микропористый хитозановый гидрогелевый композит оксида цинка для улучшения агрегации тромбоцитов и абсорбции кровью, а также для введения антибактериальных элементов. ⁶⁵ Материал был протестирован только на моделях заживления ран, и повышенное содержание оксида цинка привело к снижению жизнеспособности клеток в течение 24 часов in vitro .

Модификации хитозана добились похвальных успехов. Доулинг и др. гидрофобно модифицированный хитозан для создания «обратимого» гемостатического агента с предполагаемым механизмом гидрофобного закрепления в мембранах эритроцитов. ⁶⁶ Этот механизм был обратимым за счет введения α-циклодекстрина, который содержит гидрофобный карман. Добавление алифатических цепей — это простое и экономичное дополнение, которое резко улучшило результаты повреждения бедренной артерии как на моделях повреждения бедренной артерии у крыс, так и у свиней. Функционализация хитозана была дополнительно исследована Ryu et al. кто использовал катехол и тиолированный плюроник для образования термочувствительных композитных гидрогелей in situ . ⁶⁷ Это было достигнуто за счет использования катехол-хитозана и катехол-тиолированного плюронового ковалентного сшивания при окислении.Lih et al. применили аналогичный подход, используя хитозан, функционализированный ПЭГ-тирамином, пероксидазой хрена и перекисью водорода. ⁶⁸ При нанесении образуется гидрогель посредством ферментативного сшивания, поскольку пероксидаза хрена катализирует конъюгацию фенола и производных анилина in situ . Эти материалы обладают большим потенциалом в плане минимизации затрат, тромботических осложнений и риска передачи заболеваний. Дальнейшая оценка долгосрочного хранения, особенно в отношении подходов, основанных на окислении или ферментативных реакциях, необходима для полной оценки их потенциала.

Целлюлоза

Окисленная целлюлоза, нерастворимое в воде производное целлюлозы и важный структурный компонент растительных клеток, широко использовалась и рассматривалась для клинического применения. ⁶⁹ Считается, что он способствует гемостазу за счет различных механизмов, включая взаимодействие ионов кальция и натрия, вызванное кислотой сокращение мелких сосудов и свойства герметика. ^70–72 Чтобы улучшить основные целлюлозные повязки, Wu et al. создали микромасштабную градиентную структуру, в которой использовалась целлюлоза различной гидрофильности за счет различной степени функционализации карбоксилата натрия. ⁷³ Это позволило материалу использовать различные гемостатические механизмы на разных стадиях и привело к двухнедельному профилю деградации in vivo . Хамфрис и др. применили другой подход, используя микрочастицы микропористой целлюлозы, которые действуют как молекулярные сита для концентрации белков свертывания, и продемонстрировали эффективность на модели повреждения селезенки. ⁷⁴ Подобно хитозану, целлюлоза обладает огромным потенциалом в плане минимизации затрат, тромботических осложнений и рисков передачи заболеваний.Эти подходы также должны обеспечивать преимущество длительного срока хранения. Дальнейшее исследование использования клинически значимых моделей травматических кровотечений позволит оценить всю полезность этих подходов.

Декстран

Другой полисахарид, декстран и его производные недавно были включены в широкий спектр гемостатических материалов. Peng et al. разработали in situ , образующие гидрогели с использованием окисленного декстрана и различных полимеров, содержащих первичный амин, включая ПАК.При использовании реакции основания Шиффа () две смеси полимеризуются при нанесении. ⁷⁵ Этот материал сокращал время свертывания и улучшал силу сгустка, как измеряли с помощью тромбэластографии, но гемостатическая эффективность не оценивалась in vivo .

Схема реакции основания Шиффа, используемой для образования геля или адгезии тканей.

Другой адгезивный материал, сделанный из биосовместимого эластомера и модифицированный окисленным декстраном, был разработан с плотной наностолбчатой ​​морфологией, напоминающей лапы геккона.Эта архитектура более подробно обсуждается в разделах, посвященных биологически активным тканевым адгезивам. Покрытие из окисленного декстрана обеспечивает альдегидную функциональность, позволяя материалу ковалентно сшиваться с аминогруппами белков в ткани. Химическое сшивание и оптимизация структуры массива столбов способствовали сильным адгезионным и герметизирующим свойствам как in vitro , так и in vivo . ⁷⁶ Материалы на основе декстрана перспективны из-за их низкой стоимости, стабильности при хранении и легкости придания альдегидной функциональности.Для оценки гемостатического потенциала материалов на основе декстрана необходимо дальнейшее исследование клинически значимых моделей повреждений in vivo .

СИНТЕТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Полностью синтетические материалы в различных полимерных и минеральных формах могут быть эффективными кровоостанавливающими средствами с адгезивными, антимикробными, биосовместимыми, адсорбционными и биоразлагаемыми свойствами. Их можно отнести к категории биологически имитирующих клеев, in situ, образующих герметики, прямых активаторов и агрегаторов, а также алюмосиликатов.Как правило, синтетические герметики и клеи не предназначены для неконтролируемого кровотечения под высоким давлением, но применимы в хирургии, тогда как алюмосиликаты на минеральной основе предназначены для быстрого контроля артериального кровотечения в полевых условиях.

Основным преимуществом этих синтетических полимерных систем является снижение инфекционного риска или аллергической реакции, связанной с белковосодержащими продуктами. ^75,77 В недавнем обзоре гемостатических хирургических клеев и герметиков Lodi et al.подчеркивает важность синтетических гемостатических агентов в хирургии и призывает исследования сосредоточиться на лучшем понимании их механизмов и применения. ⁷⁸

Биологические тканевые адгезивы

Временные тканевые адгезивы часто моделируют естественные процессы, наблюдаемые в биологических системах, таких как гекконы и морские мидии. ^76,79,80 Гекконы могут лазать вертикально и вверх ногами благодаря уникальным адгезионным свойствам их ног. ⁷⁶ Плотный набор наношерстей обеспечивает большую площадь поверхности и сильные временные силы сцепления в сухой системе.Мидии обладают мощной способностью прикрепляться к влажным поверхностям за счет секреции катехоловых функциональных аминокислот, которые вызывают образование химических поперечных связей за счет присоединения Михаэля с амино- и сульфгидрильными группами, а также посредством реакции основания Шиффа (). ^81–83 Ли и др. объединили эти естественные физические и химические механизмы адгезии для создания влажного / сухого биологического адгезива с большим потенциалом для медицинского применения. Органический каркас, состоящий из наностолбиков, был покрыт полимерной пленкой на основе адгезионного белка мидий. ⁷⁹ Требование техники мягкой литографии может уменьшить преимущества этого подхода.

Схема реакций катехолов с тиол и аминсодержащими соединениями.

Mehdizadeh et al. разработали и протестировали инъекционные биоадгезивы на основе цитрата на основе мидий (iCMBA) из лимонной кислоты, полиэтиленгликоля (PEG) и мономеров, содержащих катехол. ⁸⁴ Материал способствует сильному химическому сшиванию окисленных катехиновых и первичных аминогрупп в тканях.Этот синтетический биоадгезив продемонстрировал мгновенный гемостаз в разрезе раны на спине крысы и имеет потенциал в качестве хирургического клея. Совсем недавно Barrett et al. продемонстрировали общий механизм химического сшивания с контролируемым набуханием и механическими свойствами посредством термочувствительного окисления модифицированного катехином амфифильного блок-сополимера, вдохновленного адгезивными белками мидий. ⁸⁵ Для того, чтобы функциональность катехина была клинически полезной, он должен быстро окисляться в месте повреждения.Это создает проблемы хранения, а также возможные проблемы токсичности для биологических применений, если восстанавливающие агенты должны присутствовать во время хранения или окислители должны присутствовать для применения.

Формирование in situ

Формирование синтетических тканевых герметиков in situ — это материалы, которые переходят из жидкого в твердое или гелевое состояние посредством физического или химического сшивания в локализованном месте. ⁷⁵ Физические сшивки могут быть инициированы через чувствительное к температуре гелеобразование ³⁶ или ионные зарядовые взаимодействия. ⁸⁶ Химическое сшивание, наблюдаемое в гемостатических материалах, достигается за счет химических реакций, таких как фотоинициированная полимеризация, ^77,87 реакция основания Шиффа между первичными аминами и альдегидными группами, ^88,89 и реакции между производными ПАК и ПЭГ . ⁷⁵

Фотоинициированная полимеризация может вызвать образование геля, когда световое облучение инициирует радикальную активность и последующее сшивание между соединениями. ⁹⁰ ПЭГ-лактид был использован для формирования биоразлагаемого окклюзионного барьера и сцепляющейся ткани с многообещающими кровоостанавливающими свойствами.Праймер эозин-ПЭГ-лактид наносили кистью на место хирургического повреждения почки, добавляли макромер ПЭГ-лактида и использовали ксеноновый свет высокой интенсивности для инициирования фотополимеризации двух сетей in situ . ⁷⁷ Nivasu et al продемонстрировали другой подход, в котором полиэфирполиолы были синтезированы из янтарной кислоты и PEG, акрилированы и фотополимеризованы с использованием длинноволнового УФ-света. ⁸⁷ Полученная пленка имеет переменную механическую прочность, набухание, разрушение, предел прочности на разрыв и эластичность, которые можно оптимизировать, варьируя содержание PEG и добавляя реактивные разбавители.Цитотоксичность вызывает беспокойство при выборе фотоинициатора, но достижения в области фотополимеризации продемонстрировали ее потенциал в биоматериалах. ⁹¹ Требование специального источника света увеличивает сложность применения этих подходов, делая их менее полезными.

Реакция основания Шиффа также использовалась для химического сшивания полимеров in situ . Сшиваемые гидрогели мицелл с концевыми альдегидными группами, изготовленные из поли (этиленгликоль) -поли (DL-лактида) (PEG-PLA), смешанного с полиаллиламином (PAA), индуцировали местный гемостаз и тканевую адгезию на моделях печени мышей. ^89,92 Реакция основания Шиффа происходит за секунды, поскольку ковалентные связи образуются между концевыми альдегидными группами на поверхности мицеллы и аминогруппами в ПАК. Было также показано, что PAA образует химически сшитый гидрогель in situ при смешивании с многофункциональным PEG. ⁷⁵ Использование реакции основания Шиффа для сшивания нескольких компонентов обычно требует стадии предварительного смешивания или установки двойного сопла, что снижает легкость этих подходов.

Полимерные активаторы и агрегаторы

Совсем недавно были разработаны синтетические материалы для нацеливания на активацию и агрегацию тромбоцитов при первичном гемостазе, ^93,94 активации фактора свертывания крови, ^95,96 и агрегации красных кровяных телец для стимулирования образования сгустка. ^97,98

Активация и агрегация тромбоцитов может указывать на гемостатический потенциал. Ou et al. синтезированы и охарактеризованы биоразлагаемые и биосовместимые поли (3-гидроксибутират- co -4-гидроксибутират) блок-поли (сложный эфир-уретан) s (PU3 / 4HB). ⁹⁴ Используя SEM и анализ лактатдегидрогеназы, были продемонстрированы высокие адгезионные и активационные свойства PU3 / 4HB тромбоцитов. Некоторые свойства материала были определены как ключевые факторы, влияющие на адгезию тромбоцитов.К ним относятся степень кристалличности, гидрофобность, поверхностная свободная энергия и заряд. Наличие уретановых связей увеличивает степень отрицательного заряда полимера, что связано с повышенной активацией тромбоцитов. Другой класс полимеров с гемостатическим потенциалом — это полимеры на основе полиакрилатов из-за простоты манипуляции и функционализации. Используя метод флуоресцентного высокопроизводительного полимерного микрочипа, несколько полиакрилатных полимеров были идентифицированы как активаторы и агрегаторы тромбоцитов. ⁹⁹ Было показано, что некоторые из них избирательно связывают различные белки, включая фактор фон Виллебранда и фибриноген, в то время как другие связывают белки, такие как фибронектин, тем самым обеспечивая взаимодействие с тромбоцитами. Гемостатическая активность этих полимеров объясняется содержанием катионного заряда. Более высокая доступность нестерически затрудненных третичных аминов коррелировала со значительным увеличением связывания тромбоцитов. Гемостатическая эффективность этих полимеров в растворах, порошках или гелях не оценивалась.

Электростатический заряд и покрытия из полиэлектролитного комплекса (PEC) также являются обычными механизмами, с помощью которых действуют многие из этих синтетических кровоостанавливающих средств. Амфифильная и покрытая PEC полимолочная кислота и материалы на основе 2- (диметиламино) этилметакрилата (DMAEMA), содержащие амин, увеличивают содержание эритроцитов и усиливают внутренние и внешние пути свертывания крови, что проявляется в снижении протромбинового и частичного тромбопластинового времени. плазма крови. ^97,98 Электростатический заряд функциональных групп на основе ДМАЭМА, вероятно, определяет функцию этих материалов.Влияние электростатического заряда на вторичный гемостаз было также продемонстрировано первичным аминсодержащим синтетическим полимерным гидрогелем, который индуцировал активацию FVII in vitro . ⁹⁵ Подобные катионные гидрогели проявляли высокую набухаемость и гемостатическую способность in vitro и in vivo . ^100,101 Синтетические полимеры с механизмами, которые непосредственно воздействуют на первичный и вторичный гемостаз, становятся все более распространенными характеристиками гемостатических агентов. Эти подходы вызывают озабоченность в отношении долгосрочного иммунологического ответа, деградации и токсичности.

Цеолит, каолин и силикаты

Минеральный цеолит, каолин и другие родственные силикаты алюминия используются в коммерческих целях с тех пор, как в 2003 году военные США одобрили QuikClot ^® первого поколения для обработки в полевых условиях. ¹⁰² Эти гранулированные агенты являются состоит из неактивных оксидов металлов, солей и минеральных силикатов и имеет высокую пористость. Считается, что их механизм действия заключается в концентрации факторов свертывания и тромбоцитов в ране за счет быстрой адсорбции воды, тем самым способствуя образованию сгустка. ¹⁰³ Было показано, что из-за механизма действия продукты на основе цеолита, такие как QuikClot ^® первого и второго поколения, вызывают тяжелую экзотермическую реакцию при адсорбции воды с температурами в диапазоне от 44 до 95 ° C и в среднем 67,4 ° C. . ^104–111 Вторичные ожоги тканей также были зарегистрированы в серии тематических исследований, и эти продукты были прекращены к 2008 году. ¹¹² Каолин, силикат алюминия, похожий на цеолит, но без заметных связанных экзотермических реакций, заменил цеолит в недавних коммерческих продуктах в в виде пропитанной марли (Combat Gauze ^® ).Было показано, что каолин активирует внутренний путь свертывания крови и не может оставаться в месте повреждения. ^58,103

Биоматериалы, изготовленные из оксидов металлов, продемонстрировали гемостатический потенциал за счет контактно-активируемого гемостаза, отчасти благодаря так называемому эффекту стекла без разрушительной экзотермической реакции минерального цеолита. Этот эффект приписывают сильно электроотрицательному характеру неорганических оксидов металлов, таких как диоксид кремния или кремнезем. ¹¹³ Микросферы из неорганического мезопористого биоактивного стекла, ¹¹⁴ сфер из мезопористого диоксида кремния, ¹¹⁵ и мезоклеточные силикатные пены, ¹¹⁶ также проявляют кровоостанавливающие свойства в силу своего отрицательного заряда и высокой абсорбционной способности пор. Эти пористые биоматериалы были успешно загружены ионами кальция для высвобождения in situ для помощи в гемостазе и реконструкции зубов или костей, ¹¹⁴ серебра, обмененного на антибактериальные свойства, ¹¹⁵ и загруженного тромбином для непосредственного инициирования образования фибрина при релиз. ¹¹⁶ Сферы и пена на основе оксидов металлов не вызывают экзотермических реакций и могут значительно сократить время свертывания, но большая часть этих материалов еще не продемонстрировала свою биосовместимость или биоразлагаемость.

Гели, синтезированные из природных полисахаридов, о которых известно, что они биосовместимы, могут иметь высокую пористость и могут быть объединены с другими известными кровоостанавливающими средствами для использования нескольких гемостатических механизмов. Dai et al. объединили цеолит с хитозаном в комплексном синтезе ксерогеля и продемонстрировали контактную активацию, высокую адсорбцию воды и иммобилизацию эритроцитов. ¹¹⁷ Анализы цитотоксичности in vitro показали пролиферацию и отсутствие повреждения клеток. Эффективность in vivo была установлена ​​на модели повреждения летальной артерии кролика. Аналогичным образом было показано, что цеолитные композитные полые микросферы, изготовленные из различных биоразлагаемых полимеров, включая желатин, хитозан и альгинат, и содержащих антибиотики, обладают высоким водопоглощением и пролонгированным высвобождением лекарственного средства. ¹¹⁸ Неясно, могут ли какие-либо из этих частиц остаться в месте раны, или тромботические осложнения представляют собой значительный риск.

ВНУТРИВЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ

Гемостатические средства, вводимые внутривенно, вызывают значительный интерес благодаря их способности лечить травмы без прямого доступа к месту кровотечения. Клинические подходы сосредоточены на использовании факторов свертывания крови, антифибринолитических агентов и лиофилизированных или замороженных тромбоцитов. Заменители тромбоцитов стали широко исследуемой альтернативой этим вариантам лечения на академическом уровне.

Рекомбинантный фактор VIIa

Рекомбинантный фактор VIIa (rFVIIa), впервые примененный для лечения эпизодов кровотечений у больных гемофилией, показал успех во время клинических исследований для использования при хирургических и травматических кровотечениях. ^119–122 rFVIIa является фактором свертывания крови, который играет важную роль в тканевом факторе (или внешнем) пути. Фактор ткани высвобождается в месте повреждения при повреждении эндотелия сосудов и комплексов с rFVIIa. Этот комплекс запускает общий каскад свертывания крови непосредственно через активацию фактора X или опосредованно через активацию фактора IX. Поскольку rFVIIa не может привести к активации последующих стадий каскада коагуляции без присутствия тканевого фактора, считается, что серьезные тромботические осложнения не представляют серьезной угрозы. ^123,124 Однако осложнения, включая инфаркт миокарда и тромбоз глубоких вен, все еще наблюдались у значительного процента пациентов. ¹²⁵

Антифибринолитики

Антифибринолитические подходы, которые непосредственно ингибируют плазмин или связывание плазмина с фибрином, использовались в клинической практике. ^126,127 Плазмин — это фибринолитический фермент, который является активной формой плазминогена. ¹²⁸ Апротинин, аминокапроновая кислота и транексамовая кислота являются фармацевтическими препаратами, которые действуют как ингибиторы и, как было показано, минимизируют потребность в переливании крови в хирургии. ^{6,129,130 ​​} Апротонин напрямую ингибирует плазмин, калликреин и трипсин. ¹³¹ Аминокапроновая кислота и транексамовая кислота действуют как аналоги лизина, ингибируя связывание плазмина с фибрином. ^132,133 Использование этих методов лечения было связано с инфарктом миокарда, инсультом и почечной недостаточностью, но некоторые из опубликованных клинических исследований подверглись тщательной проверке. ^{6 134 135}

Тромбоциты и заменители пластинок

Лиофилизированные, замороженные и фрагменты тромбоцитов использовались внутривенно с различной эффективностью. ^136–138 Все продукты, полученные из тромбоцитов, требуют инактивации вируса и имеют проблемы с изменчивостью и хранением. ^139,140 Для решения некоторых из этих проблем широко исследуются заменители тромбоцитов (). Как правило, заменители тромбоцитов нацелены на усиление первичного гемостаза с использованием нацеливающих групп, специфичных к участку повреждения, для стимулирования агрегации тромбоцитов и усиления образования тромбоцитарной пробки ().

Схема кровоостанавливающего механизма заменителя тромбоцитов при сосудистой травме.Заменители тромбоцитов пассивно циркулируют, пока не достигнут цели травмы.

ТАБЛИЦА II

Внутривенные гемостатические агенты

Ранние подходы к замене тромбоцитов, в которых использовались компоненты, полученные из крови, были впервые предназначены для разработки методов лечения тромбоцитопении.Фибриноген был добавлен к множеству платформ доставки, чтобы служить в качестве нацеливающего фрагмента, поскольку он связывается с рецепторами гликопротеина IIb-IIIa активированных тромбоцитов.

Аутологичные эритроциты, ковалентно связанные с фибриногеном, использовали с целью пассивного участия в агрегации тромбоцитов, значительно сокращая время кровотечения у тромбоцитопенических крыс. ¹⁴¹ Используя последовательность пептида, имитирующего фибриноген, в качестве нацеливающего фрагмента на поверхности аутологичных красных кровяных телец, Coller et al.устранены риски и трудности, связанные с использованием фибриногена человеческого происхождения. ¹⁴² Beer et al. также исследовали использование иммобилизованных пептидных цепей для исследования рецептора гликопротеина IIb-IIIa. ¹⁴³

Levi et al. и Takeoka et al. использовали покрытые фибриногеном микрокапсулы альбумина, демонстрирующие взаимодействие in vitro с тромбоцитами, и вводили их кроликам с индуцированной химиотерапией тромбоцитопенией, демонстрируя значительное снижение кровотечения. ¹⁴⁴¹⁴⁵ Okamura et al.также использовали частицы альбумина, но вместо этого использовали додекапептид (h22) из ​​γ-цепи фибриногена, заменяя фибриноген в качестве активированного нацеливающего на тромбоциты фрагмента, и продемонстрировал эффективность in vitro и у крыс с тромбоцитопенией. ¹⁴⁶

Рыбак и др. использовали липосомы, используя различные белки, полученные из тромбоцитов и красных кровяных телец, а именно гликопротеин IIb-IIIa и фрагментированную мембрану эритроцитов. ¹⁴⁷ Эти белки собирали и адсорбировали на гетерогенной липосоме.Они обнаружили, что содержание липидов сильно влияет на гемостатическую эффективность у крыс с тромбоцитопенией. Аналогичным образом были использованы конъюгированные с поверхностью пептиды для модуляции связывания без использования компонентов человеческого или животного происхождения. ¹⁴⁸ Okamura et al. сочетали этот подход с высвобождением аденозиндифосфата, активатора тромбоцитов. ¹⁴⁹ Дальнейшие итерации этого подхода использовали как фактор фон Виллебранда, так и мотивы пептидов, способствующих адгезии коллагена, в сочетании с пептидами, способствующими агрегации тромбоцитов, на поверхности липосом для увеличения поверхностного взаимодействия in vitro . ^150,151

Группа Лавика исследовала использование функционализированной поли (молочной- co -гликолевой кислоты) — b -поли (L-лизин) — b -ПЭГ наночастиц, которые также используют гликопротеиновый рецептор IIb – IIIa. связывание и подтвержденная эффективность на моделях хирургических и тупых травм. ^152,153 Совсем недавно они продемонстрировали точный контроль плотности лиганда, продемонстрировав резкое улучшение гемостатической способности. ¹⁵⁴ Okamura et al. также сконструировали нанолисты h22-поли (молочная со -гликолевая кислота), состоящие из агрегатов микрочастиц, и показали повышенную скорость адгезии по сравнению с одними микрочастицами. ¹⁵⁵ Хотя эти подходы являются многообещающими и имеют большое преимущество в виде отсутствия прямого доступа к месту повреждения, высокая стоимость производства и ограниченная масштабируемость могут ограничить клиническую применимость.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отсутствие доступных, безопасных и эффективных гемостатических материалов привело к широкому интересу к разработке новых подходов. Оценка новых технологий затруднена из-за большого разнообразия моделей травм, используемых в исследованиях гемостатической эффективности. Многие исследования отказываются от оценки in vivo целиком или используют единственную модель травмы мелких животных.В то время как модель повреждения уколом иглой печени крысы может быть полезна в качестве доказательства концепции, одно и то же животное следует использовать для травм различной степени тяжести (ампутация хвоста, резекция легкого и печени). Оценка моделей травм у крупных животных, таких как овцы или свиньи, позволяет более точно прогнозировать материальные характеристики человека.

В данной области существует множество ниш для материалов, но в существующие коммерческие варианты были внесены лишь многократные улучшения. Хотя активные системы могут достигать впечатляющих гемостатических результатов и имеют очевидные механизмы, они несут в себе риск тромботических осложнений и передачи заболеваний.Пассивное участие в образовании сгустков или агрегатов тромбоцитов, как показано на примере последних достижений в области внутривенной гемостатики, позволяет использовать естественный гемостатический процесс без этого риска. Биологически вдохновленная архитектура и химия также привели к захватывающим достижениям. Исследована лишь небольшая часть химического состава биосовместимых клеев для влажных тканей. Эти подходы к мокрому клею заслуживают дальнейшего изучения.

Академические стратегии должны тщательно учитывать конечную цель клинического перевода.При разработке новых решений часто упускаются из виду сложные методы доставки, высокая стоимость, ограниченная масштабируемость и даже безопасность. Приветствуется сотрудничество с хирургами или другими клиницистами для проверки неклинически применимых технологий. Одноэтапные подходы, применяемые местно или внутривенно, должны стать основным направлением будущих исследований.

Использование местных гемостатических средств | NATA

Эллен К. Пейн, доктор философии, ATC, EMT, Дэвид К. Берри, доктор философии, AT, ATC, и С. Роберт Зейтц, MEd, RN, NRP

Это расширенная версия статьи «Использование местных гемостатических средств в спортивной тренировке», опубликованной в январе NATA News .Статья является второй частью серии, состоящей из двух частей. В первой части серии, опубликованной в октябрьском выпуске NATA News за октябрь 2016 г., были рассмотрены концепции кровотечения, шока и контроля кровотечения, связанные со спортивными тренировками и неотложной догоспитальной помощью. ¹ Часть первая посвящена использованию жгутов на догоспитальном этапе. Во второй части данной серии статей будет рассмотрен гемостаз в его связи с механизмом свертывания крови, а спортивным тренерам будут представлены доказательства использования местных гемостатических средств в условиях спортивных тренировок.

Гемостаз

Физиологическая реакция организма (гемостаз) на потерю крови в результате травмы включает сложный трехфазный процесс. Скоординированная активация тромбоцитов и факторов свертывания плазмы, необходимых для образования тромбоцито-фибриновой пробки, зависит от первичной (формирование мягкой тромбоцитарной пробки) и вторичной (стабилизация и перекрестное связывание) фаз гемостаза. Центральное значение в обеих фазах гемостаза имеет активация каскада свертывания, который разбивается на два основных пути: внутренний (активируется коллагеном, обнажается при повреждении кровеносного сосуда) и внешний (активируется повреждением ткани и высвобождением крови). тканевых факторов).

Каскад свертывания крови включает серию зависимых реакций после травмы с участием белков плазмы, ионов кальция и тромбоцитов, которые приводят к превращению фибриногена в фибрин и, в конечном итоге, к образованию мягкой тромбоцитарной пробки. ² Во время начальной фазы мышечная стенка кровеносного сосуда сокращается, чтобы уменьшить кровоток, создавая турбулентный поток крови. Этот турбулентный поток инициирует вторую фазу ответа, привлекая тромбоциты, которые прилипают в присутствии коллагена к слизистой оболочке сосуда, окружающей ткани и друг к другу; дальнейшее уменьшение кровотока по сосуду.Хотя первоначальный сгусток, образующийся в сосудах, значительно снижает кровопотерю, он крайне нестабилен. Третья фаза коагуляции укрепляет сгусток за счет включения фибрина и красных кровяных телец, что приводит к его увеличению и увеличению.

Когда кровотечение неконтролируемое, доступны многочисленные местные гемостатические агенты, влияющие на биологический механизм действия каскада свертывания крови через активацию контакта и стимуляцию агрегации тромбоцитов. ²

Местные кровоостанавливающие средства

Во время травм, когда массивное внешнее кровотечение не может быть остановлено прямым давлением и / или с использованием жгута (т. Е. Кровотечение происходит в местах, не поддающихся наложению жгута, таких как живот, пах или грудь), наложение актуальные кровоостанавливающие средства необходимы. ^3-8 Местные кровоостанавливающие средства обычно используются для остановки сильного кровотечения, особенно в военной, а теперь и в гражданской догоспитальной помощи. ^4,7 Государственные службы неотложной медицинской помощи (EMS) добавляют различные местные гемостатические средства в списки поставок скорой помощи. ⁸

Эти антигеморрагические вещества вызывают гемостаз при помещении в кровоточащие раны, прилипая к поврежденным тканям и герметизируя поврежденный кровеносный сосуд (сосуды) и / или ускоряя и усиливая каскад свертывания. ⁵ Желаемые характеристики местных гемостатических агентов представлены в таблице 1, но в настоящее время на рынке нет «идеальных» местных гемостатических агентов. ^9,10

Таблица 1. Характеристики идеального кровоостанавливающего средства

Изменено по Пусатери и др., ¹⁵ Хейрабади, ⁵ и Стьюк ¹²

Несколько типов местных гемостатических агентов были разработаны и проданы для гражданского догоспитального применения.Кровоостанавливающие препараты, разделенные на три класса по механизму действия и по двум формам доставки, не имеют общих альтернатив и различаются по способу доставки даже среди продуктов одного и того же класса, поэтому продукты одной компании могут сильно отличаться от продуктов другой (-ых). ^4,10 Коммерчески доступные продукты прошли несколько этапов разработки и должны быть одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, прежде чем станут доступными. Благодаря постоянным исследованиям и разработкам (например, в военной среде) в настоящее время коммерчески доступны три поколения агентов. ⁸ В таблице 2 приведены обзоры различных местных гемостатических средств.

Таблица 2. Гемостатические средства местного действия

Источник: по материалам Granville-Chapman et al. ⁴ и Bennett & Littlejohn ^{8 ;} Цены на 4.10.2016

Гемостатические средства бывают двух видов: гранулированный порошок и заделанные / пропитанные повязки. Эти агенты используют два механизма для обеспечения гемостаза: физическое прилипание к поврежденным тканям и герметизация поврежденных сосудов для предотвращения дальнейшей кровопотери, а также ускорение и усиление свертывания крови, присутствующей в ране, путем включения в развивающийся сгусток и обеспечения гемостаза.Второй механизм достигается за счет двух связанных реакций: быстрого поглощения воды из крови в ране, в результате чего все элементы свертывания крови концентрируются на поврежденных тканях, и химической реакции (реакций), активирующих внутренний путь коагуляции и тромбоцитов, способствующих образованию сгустка. Эти продукты зависят от нормальной коагуляционной функции пациентов. Следует отметить, что большинство гемостатических средств, в том числе встроенных в повязки, способствуют гемостазу за счет второго механизма.

Три класса действия местных гемостатических агентов включают концентраторы факторов, мукоадгезивные агенты и прокоагулянты. Концентраторы факторов быстро поглощают воду, содержащуюся в крови, и концентрируют клеточные и белковые компоненты крови; это способствует образованию сгустка. ⁴ TraumaDEX является примером кровоостанавливающего средства этого типа. Он использует микропористые полисахаридные атмосферы из картофельного крахмала, чтобы способствовать гемостазу за счет желирующего действия, концентрирующего естественные компоненты свертывания крови. ¹⁰ Этот продукт не вызывает экзотермической реакции при использовании, как исходный продукт QuikClot. Хотя TraumaDEX считается безопасным и простым в использовании, он не использовался вооруженными силами США, потому что продукт кажется более эффективным при ранениях легкой и средней степени тяжести, а не при тяжелых ранениях, наблюдаемых в бою. ¹⁰ Этот продукт может найти более широкое применение в гражданских целях.

Мукоадгезивные агенты обеспечивают прочную адгезию к поврежденным тканям и физически закрывают кровоточащие раны. ^12,13 Продукты на основе хитозана, доступные от нескольких производителей, являются примерами этого типа агента. К ним относятся HemCon Bandage, ChitoGauze и Celox Gauze и многие другие. Когда продукт контактирует с кровью, хитозан набухает, загустевает и слипается, образуя гелеобразный сгусток, не вызывая экзотермической реакции. ¹⁴ Эти продукты работают совершенно независимо от системы свертывания крови, что является одним из преимуществ этих агентов. ⁸ Мукоадгезивные агенты должны иметь прямое давление на рану после нанесения, чтобы продукт работал должным образом.

Прокоагулянты — это третий тип местных кровоостанавливающих средств. Они действуют, активируя каскад свертывания крови или доставляя высокие концентрации прокоагулянтных факторов в кровоточащую рану. ¹⁰ Этот тип включает боевую марлю, текущую первую линию лечения для армии США, когда жгуты не рекомендуются или не подходят. ^8,10 Активным ингредиентом Combat Gauze является каолин, силикат алюминия, который активирует внутренний путь свертывания и ускоряет образование сгустка. ¹⁰ Применение требует, чтобы рана была набита боевой марлей, а затем прикладывалась прямое давление в течение трех минут или до остановки кровотечения.

Клинические доказательства

Большинство контролируемых исследований местных гемостатических агентов проводилось на животных моделях, в то время как ретроспективные исследования проводились на вооруженных силах, и методологии в этих исследованиях сильно различались. ^{4,7,8,12,15,16} Всесторонние обзоры литературы, относящейся к местным гемостатическим средствам, были опубликованы в 2006 г. Pusateri et al. ¹⁵ , а затем в 2011 г. Granville-Chapman et al. ⁴ В самом последнем обзоре, проведенном Беннеттом и Литтлджоном за 2014 год. ⁸ обсуждаются многие из продуктов нового третьего поколения. Авторы рекомендуют рассмотреть возможность использования Celox Gauze и ChitoGauze вместе с принятой в настоящее время Combat Gauze, используемой военными. ⁸ Чего не хватает, так это глубины и широты исследований, касающихся использования местных гемостатических средств в гражданских догоспитальных учреждениях.

Из доступной литературы в одном исследовании изучалась эффективность повязки HemCon Bandage в гражданской службе неотложной помощи. ⁶ Повязка была добавлена ​​к травматологическим комплектам пожарной службы, и медицинский персонал обучен ее использованию; Персонал принимающей больницы был также обучен удалению продуктов. В ходе исследования было зарегистрировано 37 случаев использования повязки HemCon Bandage, и были доступны полные спецификации для 34 случаев. Повязка контролировала кровотечение в 79 процентах из 34 случаев, в 74 процентах случаев в течение трех минут после наложения. В 74 процентах (n = 34) случаев прямое давление изначально не смогло остановить кровотечение, в то время как повязка HemCon была эффективна в остановке кровотечения в 76 процентах из 25 случаев. ⁶ Повязка HemCon Bandage не остановила кровотечение в течение 10 минут в семи случаях. Авторы объясняют шесть из семи сбоев ошибкой пользователя. Был сделан вывод, что повязка HemCon помогает остановить неконтролируемое кровотечение в условиях гражданской службы неотложной помощи, когда традиционные методы, такие как прямое давление, не помогли. Было подчеркнуто надлежащее обучение использованию повязки, поскольку ошибка пользователя была фактором, способствующим большинству задокументированных неудач в исследовании. ⁶ Когда случаи с ошибкой пользователя удаляются из анализа, показатель успеха увеличивается до 97 процентов, что согласуется с предыдущими исследованиями. ¹⁷

TraumaDEX также был исследован за пределами военных моделей и животных, и положительные результаты привели к поддержке этого местного гемостатического агента в гражданских условиях. ¹⁸ В этом исследовании 29 здоровым испытуемым сделали два разреза на предплечьях. Один разрез обработали TraumaDEX, а другой разрез (контрольный) — нет. Оба разреза обрабатывались легким надавливанием в течение 30 секунд после нанесения TraumDEX на тестируемый участок и регистрировали время кровотечения.Было обнаружено, что TraumaDEX имеет среднее время гемостаза 84 секунды по сравнению с 381 секундой для необработанного контрольного участка. Время кровотечения сократилось на пять минут с использованием TraumaDEX по сравнению с контрольным участком. ¹⁸

Кроме того, у 79 процентов субъектов сразу прекратилось кровотечение на обработанном участке. Через семь дней после лечения не было отмечено различий в рубцах между группами. Авторы пришли к выводу, что TraumaDEX сокращает время кровотечения и приносит пользу, потому что это низкая стоимость и низкий риск. ¹⁸

Клиническое использование в спортивной тренировке

Не существует универсального подхода при выборе местных гемостатических средств. ¹⁵ Каждая ситуация различается, равно как и расположение раны и вовлеченные структуры (артерии, вены или и то, и другое). Разные кровоостанавливающие средства местного действия имеют разные показания и противопоказания к применению. Спортивным тренерам необходимо ознакомиться с информацией о продукте перед покупкой любого типа кровоостанавливающего средства, и они могут рассмотреть возможность приобретения более одного типа средств для удовлетворения потенциальных потребностей организации. ¹⁹ Должно быть обеспечено надлежащее обучение для всех сотрудников, которые могут рассмотреть возможность использования местных гемостатических средств во время чрезвычайной ситуации. ^6,7,10,16 Стоимость различных кровоостанавливающих средств — еще один фактор, который следует учитывать при выборе продуктов. Цена различных агентов сильно различается между продуктами и дистрибьюторами (Таблица 2).

Приложение

Перед применением любого кровоостанавливающего средства следует также рассмотреть возможность наложения жгута. Как уже говорилось в первой части этой серии статей, существует множество доказательств в пользу использования жгутов для остановки кровотечения на догоспитальном этапе. ¹ Местные кровоостанавливающие средства можно применять в дополнение к жгуту, если кровотечение все еще не контролируется. ³ В таблице 3 приведены общие шаги по применению местного гемостатического агента.

Таблица 3. Этапы использования местного кровоостанавливающего средства на догоспитальном этапе

* Всегда соблюдайте рекомендации производителя для правильного использования.

Показания, противопоказания и меры предосторожности

Местные кровоостанавливающие средства рекомендуются для использования во время сосудистых травм, которые невозможно контролировать одним лишь прямым ручным давлением. ^3,4,7 Их использование особенно важно, когда кровотечение происходит в областях, не поддающихся наложению жгута, таких как паховая и подмышечная области, грудная клетка и брюшная полость, а также при кровоизлиянии в суставы. ^3-5,7,20 Местные кровоостанавливающие средства также следует рассматривать, когда жгут недоступен или не может остановить кровотечение. ³

Противопоказания зависят от местного кровоостанавливающего средства и его основных активных ингредиентов; таким образом, невозможно решить все возможные проблемы. Как правило, эти продукты не предназначены для внутреннего (хирургического) использования, не должны использоваться в глазах и не показаны для использования в полости рта по мнению производителей многих из этих продуктов. В отношении агентов, содержащих хитозан (из моллюсков), пациентов может потребоваться опросить об аллергии на моллюсков. ^4,5 Всегда обращайтесь к инструкциям производителя для получения списка противопоказаний и мер предосторожности. ⁵

Большинство местных гемостатических агентов при применении все еще требуют от двух до пяти минут прямого давления, чтобы быть эффективным, что считалось недостатком в военных условиях, но не должно быть проблемой для физически активного населения в гражданских условиях. Другие меры предосторожности зависят от местных гемостатических средств и их основных активных ингредиентов.

Заключение

Использование местных кровоостанавливающих средств спортивными тренерами не всегда входило в рамки нашего базового образования по разным причинам.Необходимая подготовка по основным жизненно важным навыкам имеет первостепенное значение, учитывая вероятность того, что спортивный тренер первым окажется на месте чрезвычайной ситуации. При наличии сильного неконтролируемого внешнего кровотечения, когда прямое давление и жгуты не работают, а также в областях, где жгуты не подлежат исправлению, целесообразно рассмотреть возможность использования местных гемостатических средств.

ССЫЛКИ

1. Пейн Е.К., Берри, округ Колумбия, Зейтц, Р.С. Использование жгута в спортивных тренировках: во время острой травмы необходимо правильное управление кровотечением. Новости НАТА . В прессе.

2. Самудрала С. Местные кровоостанавливающие средства в хирургии: взгляд хирурга. АОРН J . 2008; 88 (3): S2 – S11.

3. Синглетарий Е.М., Чарльтон Н.П., Эпштейн Дж. Л., Фергюсон Дж. Д., Дженсен Дж. Л., Макферсон А. И., Пеллегрино Дж. Л., Смит В. В., Суэйн Дж. М., Лоджеро-Уитли Л. Ф., Зидеман Д. А.. Часть 15: Первая помощь: Обновление рекомендаций Американской кардиологической ассоциации и Красного Креста 2015 года по оказанию первой помощи. Тираж. 2015; 3; 132 (18 Приложение 2): С574-89. DOI: 10.1161 / CIR.0000000000000269.

4. Гранвилл-Чепмен Дж., Джейкобс Н., Мидвинтер М.Дж. Догоспитальные кровоостанавливающие повязки: систематический обзор. Травма . 2011. 42 (5): 447–459.

5. Хейрабади Б. Оценка местных гемостатических средств для боевой обработки ран. Медицинский отдел армии США J . 2011 г .; апрель – июнь: 25–37.

6. Браун М.А., Дайя М.Р., Уорли Дж. Опыт использования хитозановой повязки в гражданской системе скорой медицинской помощи. J Emerg Med . 2009; 37 (1): 1–7

7.Bulger EM, et al. Основанное на фактических данных догоспитальное руководство по контролю внешнего кровотечения: Комитет Американского колледжа хирургов по травмам. Неотложная догоспитальная помощь. 2014; 18 (2): 163-173.

8. Беннетт Б.Л., Литтлджон Л. Обзор новых гемостатических повязок местного действия для оказания медицинской помощи раненым. Mil Med. 2014; 179 (5): 497-514.

9. Li H et al. Сравнение местных гемостатических агентов на модели артериального кровотечения в конечности у свиней: BloodSTOP iX Battle Matrix vs.Боевая марля QuikClot. Int J Mol Sci. 2016; 17.

10. Гриссом Т.Е., Фанг Р. Местные кровоостанавливающие средства и повязки на догоспитальном этапе. Curr Opin Anesthesio. 2015; 28 (2): 210-216.

11. Кинг К., Нойффер М.С., МакДивитт Дж., Роуз Д., Клунан С.К., Вайер Дж. С.. Гемостатические повязки для скорой помощи: обзор. Мил Мед . 2004. 169 (9): 716–720.

12. Stuke LE. Догоспитальные местные гемостатические агенты: обзор Текущая литература .Клинтон, MS: Национальная ассоциация техников скорой медицинской помощи, Исполнительный комитет по догоспитальным травмам и жизнеобеспечению; 2011.

13. Горди С.Д., Рихи П., Шрайбер М.А. Военное применение новых кровоостанавливающих устройств. Экспертная версия Med Devices . 2011; 8 (1): 41–47.

14. Medtrade Products Ltd. Как работает Celox; 2014. http: // www. celoxmedical.com/usa/usaresources/resourceshow-it-works/. По состоянию на 14 января 2014 г.

15. Пусатери А.Е., Холкомб Дж.Б., Хейрабади Б.С., Алам Х.Б., Уэйд К.Э., Райан К.Л.Разбираемся в доклинической литературе по передовым гемостатическим препаратам. J Травма . 2006. 60 (3): 674–682.

16. Shina A et al. Использование гемостатической повязки на догоспитальном этапе Медицинским корпусом Сил обороны Израиля: серия случаев с участием 122 пациентов. J Trauma Acute Care Surg. 2015; 79 (4 Приложение 1): 204-209.

17. Wedmore I, McManus JG, Pusateri AE, Holcomb JB. Спецрепортаж о кровоостанавливающей повязке на основе хитозана: опыт текущих боевых действий. J Травма .2006. 60 (3): 655–658.

18. Эрет М. Х., Донг Й., Гордон Э. А., Наттолл Г. А., Оливер В. К.. Микропористые полисахаридные атмосферы обеспечивают эффективное местное кровоостанавливающее действие в модели разреза, измененной по времени кровотечения у человека. Ежегодное собрание Американского общества анестезиологов; 2002.

19. Heiskell LE, Olesnicky BT, Vail SJ. Сгустки крови. http: // www. Policemag.com/channel/swat/articles/2004/08/blood-clotters.aspx. По состоянию на 31 января 2014 г.

20. Tourtier JP, Palmier B., Tazarourte K, et al.Концепция борьбы с повреждениями: расширение парадигмы в догоспитальных условиях. Анналы Франсези д’Анестези и реанимации . 2013; 32 (7–8): 520–526.

Гемостатическое средство — обзор

Гемостаз и диагностика заболеваний

Целью гемостаза является поддержание баланса коагуляции и фибринолиза для сохранения правильной структуры и функции сосудов, а также текучести крови. Когда сосудистая структура повреждена, необходимо иметь адекватное количество и функцию тромбоцитов (первичный гемостаз), а также достаточные факторы и кофакторы системы свертывания (вторичный гемостаз), чтобы остановить кровотечение.Неповрежденная фибринолитическая система локализует свертывание в области повреждения сосудов и действует для повторного открытия кровеносных сосудов во время заживления. Дисбаланс этих факторов приводит либо к гиперкоагуляции и тромбоэмболическим нарушениям, либо к гипокоагуляции и кровотечению, либо к тому и другому при ДВС-синдроме.

Эта глава состоит из трех разделов. В первом разделе представлены компоненты нормального гемостаза, включая эндотелий сосудов, тромбоциты, факторы свертывания и фибринолиз. Во втором разделе описаны избранные гемостатические тесты и факторы, влияющие на то, как они могут использоваться в диагностике.В третьем разделе кратко описаны избранные наследственные и приобретенные нарушения гемостаза и их лабораторная диагностика.

Оценка причины кровотечения варьируется от устранения явных проблем (например, тяжелого носового кровотечения) до выявления предполагаемых проблем (например, болезнь фон Виллебранда [vWD] у добермана) и расследования неожиданных проблем, обнаруженных во время лабораторного обследования. (например, легкая или умеренная тромбоцитопения, свидетельство заболевания печени). Признаки проблем с кровотечением могут включать продолжительное кровотечение после родов, течки или незначительной травмы (например.g., венепункция, потеря временных зубов) или спонтанные кровоизлияния (например, петехии, экхимозы, гематомы). Кровотечение из желудочно-кишечного тракта может проявляться в виде свежей красной крови или темного дегтеобразного стула и часто бывает скрытым. Кровотечение в суставы и мышцы может вызвать хромоту. Кровотечение в полости тела может быть диагностировано с помощью цитологического исследования жидкости. Небольшие кровоизлияния, такие как петехии и экхимозы, указывают на тромбоцитарный или сосудистый дефект (рис. 5-1). Носовое кровотечение часто связано с дефектами тромбоцитов, возможно, из-за недостатка ткани между сосудами и слизистой оболочкой носа.Напротив, дефекты коагуляции характеризуются большими глубокими кровоизлияниями (например, гематомами, гемартрозами).

Обследование пациента с подозрением на нарушение свертываемости крови требует не только выбора соответствующих тестов, но и для постановки точного диагноза требует полного анамнеза и физического обследования из-за высокой связи нарушений гемостаза с породой, возрастом, лечением и отравлениями. Некоторые скрининговые тесты следует проводить в частной практике. Анализаторы в местах оказания медицинской помощи, такие как анализатор коагуляции VetScan VSpro (Abaxis North America, Юнион-Сити, Калифорния), доступны для анализа АЧТВ и протромбинового времени (ПВ) в клинике.Тем не менее, тестирование гемостаза в справочных лабораториях и особенно в центрах гемостаза должно лучше контролировать методы и реагенты и иметь более полный набор тестов, которые могут потребоваться для выявления легких или необычных проблем (см. Обсуждение методологии ниже).

Простой подход к выбору теста показан на рисунке 5-2. Если физикальное обследование не выявляет причины кровотечения или кровотечение кажется несоразмерным травме, оправданы расходы на гемостатические тесты (относительно дорогостоящие исследования) для документирования и локализации дефекта.В некоторых ситуациях требуется только один тест (например, анализ фактора фон Виллебранда [vWF] или время капиллярного кровотечения в качестве предоперационного скрининга для плановой операции на добермане из-за высокой вероятности наличия у них vWD). Точно так же ПВ является предпочтительным единственным тестом при подозрении на прием родентицида варфаринового типа. Однако для локализации неизвестного дефекта кровотечения рекомендуется профиль тестов, выполненных в тот же день (Таблица 5-1; Таблица 5-2). Некоторые нарушения гемостаза влияют на несколько участков гемостаза, поэтому оценка только одного или двух тестов может привести к неполному или ошибочному заключению.Изменения в производстве и инактивации факторов свертывания и антикоагуляции, а также изменения в производстве и удалении тромбоцитов и эффекты лечения затрудняют диагностику; следовательно, одновременное выполнение полного профиля тестов при первичном обращении позволяет поставить более вероятный правильный диагноз. Нормальные результаты в профиле исключают из рассмотрения некоторые заболевания.

Разумный профиль включает количество тромбоцитов, тест функции тромбоцитов, АЧТВ для оценки внутренних и общих путей коагуляции, PT для оценки внешних и общих путей и тест фибринолитической активности, такой как D-димер (см. Таблицу 5 -1).В определенных ситуациях используются альтернативные и дополнительные тесты (см. Раздел «Лабораторные тесты»).

Дефекты гемостаза изначально должны быть локализованы в общей области механизма гемостаза, который состоит из четырех основных компонентов: кровеносных сосудов, тромбоцитов, факторов свертывания и фибринолитической системы (Таблица 5-2). Пробка агрегированных тромбоцитов первоначально закрывает поврежденные сосуды после того, как циркулирующие тромбоциты вступают в контакт с обнаженным субэндотелиальным коллагеном (первичный гемостаз).Тромбоциты связываются с коллагеном и друг с другом с помощью vWF (Рисунок 5-3; см. Рисунок 5-1). Факторы свертывания, стимулируемые коллагеном, тканевым тромбопластином и тромбоцитами, образуют нити фибрина для стабилизации тромбоцитарной пробки (вторичный гемостаз). Фибринолитическая система разрушает сгусток, чтобы снова открыть сосудистый просвет для кровотока во время заживления сосуда. Пробка тромбоцитов образуется при коагулопатиях, но легко разрушается и вызывает повторное кровотечение, поскольку не стабилизируется нитями фибрина. Сильный дефицит одного или нескольких факторов свертывания замедляет образование сгустка, который должен быстро образовываться после контакта с субэндотелиальным коллагеном.В это время могут возникнуть кровотечения большего размера, прежде чем окончательно сформируется фибриновый сгусток или давление соседних тканей остановит кровотечение (см. Рисунок 5-1).

Примечание

Обычно более эффективно использовать профиль гемостатических тестов во время первоначальной диагностики неопределенной проблемы кровотечения, чем выбирать слишком мало тестов для локализации проблемы.

Системный гемостатический агент на полимерной основе

ВВЕДЕНИЕ

На протяжении десятилетий неконтролируемое кровотечение было основной причиной смерти среди населения в возрасте от 1 до 46 лет, и от 30 до 40% этих смертей связаны с большой кровопотерей в обеих группах. гражданское и военное население ( 1 — 5 ).Поскольку большинство смертей происходит в течение первого часа после травмы, контроль кровотечения чрезвычайно чувствителен ко времени, что иллюстрируется понятием «золотого часа» для оказания помощи при травмах; гемостатическое вмешательство в течение первого часа определит выживаемость пациентов с травмой ( 6 , 7 ). Тем не менее, доступные в настоящее время на месте вмешательства, такие как жгуты и местные гемостатические повязки, могут применяться только к доступным извне и потенциально сжимаемым ранам.В последние годы были достигнуты некоторые успехи в разработке внутритканевых или внутриполостных инъекционных технологий саморасширяющейся гемостатической полимерной пены, например XSTAT и ResQFoam, а также технологий эмболических катетеров, например, реанимационной эндоваскулярной окклюзии аорты с помощью баллона, которая может позволить более высокая эффективность контроля кровоизлияния в торс ( 8 ). Однако при внутреннем, диффузном и несжимаемом кровотечении, помимо нескольких гемостатических препаратов ( 9 ), переливание продуктов крови (т.(эритроциты, свежезамороженная плазма и тромбоциты) и концентраты факторов свертывания крови остаются основным клиническим средством для остановки кровотечения ( 6 , 10 ). Несмотря на высокую эффективность, существует несколько логистических проблем, связанных с применением биопрепаратов по месту оказания медицинской помощи. Если взять в качестве примера тромбоцит, его применение ограничено (i) коротким сроком хранения (от 5 до 7 дней) при строгих требованиях к хранению, (ii) обширным предварительным скринингом, чтобы избежать проблем с иммуногенностью, и (iii) высоким риском биологического загрязнения ( 11 — 13 ).Даже в стерильных клинических условиях нехватка тромбоцитов от доноров усугубляет проблемы поддержания запасов тромбоцитов для лечения кровотечений у пациентов с хирургическим кровотечением, онкологическими нарушениями свертывания крови и миелосупрессией, вызванной химиотерапией / лучевой терапией, помимо травмы (). 12 , 14 ). Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в разработке внутривенных кровоостанавливающих средств, которые могли бы преодолеть вышеупомянутые проблемы и способствовать быстрому образованию сгустка в недоступных местах повреждения.

Было предпринято несколько попыток разработать заменители тромбоцитов, которые либо инициируют, либо дополняют процесс естественного гемостаза ( 14 ). К ним относятся использование пептида Arg-Gly-Asp (RGD) для нацеливания на активированные тромбоциты или использование коллаген-связывающего пептида (CBP) и связывающего пептида фактора фон Виллебранда (vWF) (VBP) для нацеливания на участки повреждения сосудов. Эти пептиды обычно доставляются с использованием микро- или наночастиц, включая микросферы альбумина ( 15 ), липосомы ( 16 ), наночастицы поли (1-молочной и гликолевой кислоты) ( 17 ), слой за слоем. дискоидные наночастицы, собранные слоями ( 18 ), и микрогели поли ( N -изопропилакриламид-соакриловая кислота) ( 19 ).Полимерные конструкции предлагают привлекательную платформу для терапии благодаря их высокой растворимости в воде, гибкости и поливалентному сродству к целевым группам на молекулярном уровне ( 20 ). Используя гиалуроновую кислоту (HA) в качестве модельного полимерного скелета, мы сообщаем, что конъюгаты HA с VBP (TRYLRIHPQSQVHQI) и CBP ([GPO] ₇ H) ( 16 , 18 ) называются гемостатическими агентами через полимерный пептид. интерфузии (HAPPI), которые очень эффективны в обеспечении гемостаза без системной токсичности.CBP опосредует связывание HAPPI с коллагеном, экспонированным в месте повреждения сосуда, тогда как VBP, короткая последовательность белка фактора VIII, который отвечает за его связывание с vWF, опосредует связывание HAPPI с vWF, иммобилизованным на активированных тромбоцитах и ​​поврежденном эндотелием в месте повреждения. сайт.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дизайн и синтез HAPPI

Как один из ключевых компонентов внеклеточного матрикса и эндотелиального гликокаликса ( 21 ), HA обеспечивает отличную основу для разработки макромолекулярных терапевтических средств.Наряду с фибрином, он также является основным регулятором макромолекул в процессе заживления ран после повреждения сосудов. Вскоре после повреждения ткани с денудацией сосудов происходит увеличение содержания ГК в ране, после чего он связывается с фибриновым сгустком и реорганизует сгусток в матрицу ГК-фибрина ( 22 ). С точки зрения синтеза, HA представляет собой отличный строительный блок из-за наличия нескольких функциональных групп в его основной цепи ( 23 ).На основании этого объяснения CBP и VBP были конъюгированы с HA с использованием реакций связывания, опосредованных 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимидом (EDC) / сульфо-NHS ​​( N -гидроксисукцинимид) (рис. 1A). . Группа карбоновой кислоты НА была сначала активирована EDC и сульфо-NHS, а затем прореагировала с первичными аминами пептидов, давая конъюгаты НА-CBP-VBP, то есть HAPPI. Таким образом, ориентация пептидов принимается, поскольку С-конец пептида направлен наружу, а N-конец — к остову НА.Флуоресцентный краситель [Alexa Fluor 647 (AF 647)] также был конъюгирован с основной цепью HA для облегчения биораспределения in vivo и фармакокинетических исследований. Конъюгацию подтверждали гельпроникающей хроматографией (GPC) (фиг. S1A).

( A ) Схема реакции для конъюгации флуоресцентного красителя и пептидов на основной цепи НА с использованием химии EDC / сульфо-NHS. ( B ) ¹ H-спектр ядерного магнитного резонанса (ЯМР) показывает присутствие характерных пиков b, c, d и e пептидов, что указывает на их успешное конъюгацию с HA.( C ) Профиль GPC HAPPI показывает появление ультрафиолетового (УФ) поглощения во время элюирования конъюгатов [сигналы показателя преломления (RI)], в отличие от профиля только флуоресцентного HA, что дополнительно подтверждает химическую конъюгацию. ( D ) Изображение лиофилизированного HAPPI в виде голубоватого вещества во флаконе. Микрофотографии атомной силы в топографическом режиме воздушной врезки для HA ( E ), HA-VBP ( F ), HA-CBP ( G ) и HAPPI ( H ) (масштабные полосы, 500 нм).Фото: (D) Я. Гао, Гарвардский университет.

Химическая и структурная характеристика HAPPI

HAPPI охарактеризовали с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), ГПХ и атомно-силовой микроскопии (АСМ) для подтверждения успешной конъюгации и исследования их морфологии. Характерные пики ¹ H ЯМР VBP, CBP и HA были обнаружены в конечных очищенных продуктах, что свидетельствует об успешном конъюгации (фиг. 1B). В частности, пики на 6,8 и 7.1 часть на миллион (м.д.) соответствует ароматическим кольцам тирозина из VBP. Пики при 8,6 и 7,3 м.д. принадлежат гистидину из VBP и CBP соответственно. Кроме того, пик при 1,95–2,05 м.д. соответствует метильным группам в ацетамидной части НА. Для количественного анализа метильный резонанс ацетамидного фрагмента НА при (δ 1,95 до 2,05 м.д.) использовали в качестве внутреннего стандарта (a на фиг. 1B). Степень модификации ВБП оценивалась как ок. 7,8 мол.% (Мол.%) При сравнении площадей пиков тирозина и НА (d и e на рис.1Б). Аналогичным образом модификация CBP составила ~ 5,6 мол.%. На основании этого было оценено, что среднее количество конъюгированных молекул VBP и CBP на одну цепь HA составило 51 и 37 соответственно. VBP и CBP также конъюгировали с HA по отдельности аналогичным образом, получая конъюгаты HA-VBP и HA-CBP со сравнимой степенью замещения (фиг. S2).

Успешное конъюгирование с HA было дополнительно подтверждено с помощью GPC (фиг. 1C, фиг. S1, B и C). Немодифицированный ГК не поглощает при 280 нм, и, следовательно, при обнаружении ультрафиолета (УФ) не наблюдалось пика.С другой стороны, HAPPI поглощает в том же месте и показывает пик показателя преломления (RI), указывающий на то, что пептиды были ковалентно присоединены к молекулам HA, а не просто физически смешаны с полимером. Сходный удерживаемый объем AF 647-HA и AF 647-HAPPI продемонстрировал, что HA был интактным, без заметного разложения, происходящего во время реакции конъюгации и процесса очистки. Увеличение молекулярных масс после конъюгации (HA-VBP, HA-CBP и HAPPI по сравнению с HA), определенное по их нефлуоресцентным аналогам, дополнительно проявляется в параллельном смещении пиков молекулярно-массового распределения (рис.S1, D и E). Чтобы оценить стабильность при хранении HAPPI, их хранили при комнатной температуре в лиофилизированных твердых веществах (фиг. 1D) в течение 3 месяцев и оценивали с помощью GPC. Профиль элюирования конъюгатов был сравним с исходными материалами, что демонстрирует выдающуюся стабильность этих составов.

Для исследования их морфологии, HA и HAPPI, вместе с конъюгатами HA с отдельными пептидами, были нанесены на высокоупорядоченную подложку из пиролитического графита (HOPG) из разбавленных водных растворов и отображены на воздухе в режиме AFM (рис.1, с E по H). Молекулы HA проявляют как конденсированные глобулярные формы, так и структуры протяженных клубков, которые, как известно, происходят из-за внутримолекулярной и межмолекулярной агрегации ( 24 ). В то время как как глобулярные, так и спиральные формы наблюдались также для HA-VBP, HA-CBP и HAPPI, HA-VBP имеет тенденцию образовывать расширенную конформацию, тогда как HA-CBP образует более изолированные глобулярные формы. Это конформационное различие может быть связано с различием в гидрофобности и изоэлектрических точках VBP и CBP, которые могут регулировать их молекулярные конформации как в растворе, так и на поверхности ( 24 ).Хотя было бы идеально охарактеризовать морфологию HAPPI в физиологически значимых условиях, например в физиологическом растворе, гидрофильная природа основной цепи HA делает это практически сложной задачей, поскольку HA имеет более слабое сродство к субстрату, чем к водному раствору ( 24 ) . После модификации слюдяного субстрата положительно заряженным полилизином мы получили морфологию HAPPI в физиологическом растворе (рис. S3), аналогичную морфологии, наблюдаемой на воздухе.

Гемостатическая эффективность in vivo на модели кровотечения из хвоста мыши

Затем HAPPI исследовали in vivo на способность останавливать кровотечение на модели разреза (разрыва) хвостовой вены мыши, хорошо зарекомендовавшей себя модели для определения гемостатической способности (рис.2А) ( 25 , 26 ). Только HA (4,6 мг / кг; без пептидов) и только свободные пептиды не показали какого-либо уменьшения времени кровотечения по сравнению с необработанной группой (фиг. 2B). Это разумно, поскольку, насколько нам известно, молекулы НА не обладают какой-либо предпочтительной связывающей способностью по отношению к тромбоцитам, vWF или коллагену. Отсутствие гемостатической эффективности свободных пептидов можно предположительно объяснить отсутствием способности к поливалентному связыванию, что приводит к неспособности ускорить процесс образования сгустка.Однако HAPPI, введенный с эквивалентной дозой HA 4,6 мг / кг, продемонстрировал выдающиеся гемостатические свойства (рис. 2, B и C). В частности, HA-VBP и HAPPI значительно снижали время кровотечения и объем кровотечения по сравнению с группой, не получавшей лечения. При использовании HAPPI было достигнуто сокращение времени кровотечения на 99% и уменьшение кровопотери на 97%. В то время как группа с физиологическим раствором продемонстрировала неожиданное сокращение времени кровотечения и кровопотери по сравнению с группой HA, HAPPI все же привел к значительному сокращению времени и объема кровотечения.Среди этих двух пептидов VBP явно доминировал в гемостатическом эффекте, поскольку HA-CBP не демонстрировал значительного сокращения времени или объема кровотечения. С другой стороны, эквивалентная доза HA-VBP показала сильное снижение обоих. Чтобы исключить вклады, возникающие из-за разной степени конъюгирования пептидов в HA-VBP, HA-CBP и HAPPI, дозировку препарата дополнительно калибровали по общему количеству пептидов (0,68 мкмоль / кг) путем настройки концентрации конъюгата. Наблюдалась аналогичная тенденция сокращения времени кровотечения и кровопотери (рис.2, D и E), дополнительно подтверждая, что гемостатический эффект возникает в первую очередь от двух пептидов, в частности, VBP. Когда мышам вводили смесь HA-VBP и HA-CBP (HA-VBP / HA-CBP; рис. 2, B и C), их время кровотечения и кровопотеря были сопоставимы с таковыми, полученными HA-VBP, и немного выше, чем у группы HAPPI, что указывает на синергетический эффект конъюгирования двух типов пептидов с одной молекулой НА.

( A ) Схематическое изображение исследований гемостатической эффективности на мышах BALB / c. Мышам внутривенно вводили солевой раствор, HA или конъюгаты HA-пептид и вызывали разрыв хвостовой вены через 1 или 20 минут времени циркуляции. Количественно оценивали время кровотечения (B, D и F) и общую кровопотерю (C, E и G). ( B и C ) Гемостатическая эффективность HA-CBP, HA-VBP, HA-VBP / HA-CBP и HAPPI с необработанными, физиологическим раствором, природным HA и свободными пептидами (CBP и VBP) в качестве контроля.В группах HA-CBP, HA-VBP и HAPPI мышам вводили 4,6 мг / кг эквивалентной дозы HA. HA-VBP / HA-CBP был составлен путем смешивания желаемых количеств конъюгатов HA-VBP и HA-CBP для получения конечных индивидуальных концентраций, равных группе HA-VBP и группе HA-CBP, соответственно ( n = 5 мышей) . ( D и E ) HA-CBP *, HA-VBP * и HAPPI * добавляли такое же количество пептидов, как описано в материалах и методах ( n ≥ 3 мыши). ( F и G ) Эффективность HAPPI с 20-минутным временем циркуляции сравнивали с необработанными мышами и мышами, получавшими физиологический раствор с 20-минутной циркуляцией и HAPPI с 1-минутным временем циркуляции ( n ≥ 4 мыши).Все данные являются средними значениями ± SEM; статистику с помощью двустороннего непараметрического критерия Манна-Уитни (* P <0,05 и ** P <0,01) и теста Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна (# P <0,05, ## P <0,01 и ### P <0,01). нс, не имеет значения; Hb, гемоглобин.

Чтобы оценить влияние задержки между временем инъекции и травмой, был разработан эксперимент с тремя руками, в котором HAPPI и физиологический раствор вводили за 20 минут до разрыва хвостовой вены и сравнивали с HAPPI с 1-минутным временем циркуляции.Гемостатическая эффективность наблюдалась в обеих временных группах по сравнению с группами, не получавшими лечения, и группами, получавшими физиологический раствор (фиг. 2, F и G).

Биораспределение, фармакокинетика и системная токсичность HAPPI

Фармакокинетику и биораспределение HAPPI определяли на травмированных мышах. Было обнаружено, что период полувыведения HAPPI из кровообращения почти идентичен периоду полураспада нативной ГК и составляет ~ 1 час (рис. 3A). После инъекции HAPPI в основном концентрировался в печени и селезенке к 6 часам (рис.3B), что снижает риск длительного системного воздействия. Циркуляция и биораспределение конъюгатов согласуются с литературными сообщениями о клиренсе HA, введенного внутривенно ( 27 , 28 ). Печень является основным местом выведения из-за ее большей массы, где специфический рецептор-опосредованный эндоцитоз HA вызывает ее деградацию ( 29 ). Небольшое скопление было обнаружено в мозге, почках и сердце. Хотя некоторое накопление наблюдалось в легких в течение 30 минут после инъекции, оно было очищено относительно быстро, так что через 1 час в легких не наблюдалось обнаруживаемого сигнала.Некоторое скопление также было обнаружено на месте травмы хвоста. Чтобы оценить роль CBP и VBP в наблюдаемом биораспределении конъюгатов, мы измерили биораспределение только HA (рис. S4). В целом различия между ними были скромными. Накопление в печени и селезенке было сопоставимым в обоих случаях. Накопление HAPPI в месте повреждения статистически не отличалось от накопления природного HA.

( A ) Фармакокинетические исследования HAPPI, указывающие на период полувыведения из плазменной циркуляции ( t _1/2 ) ~ 1 час. Данные были подогнаны с использованием однофазной модели экспоненциального распада со значениями периода полураспада, которые извлекаются, как показано. ( B ) Процент введенной дозы, нормализованный на массу органа через 30 минут, 1 час, 6 часов и 24 часа после инъекции ( n = 5 на группу). ( C ) Репрезентативные микрофотографии окрашивания H&E шести жизненно важных органов через 30 мин, 1 день и 7 дней введения лечения (масштабные линейки, 100 мкм).

Гистопатологический анализ окрашенных гематоксилином и эозином (H&E) срезов различных органов, собранных через 30 минут, 1 день и 7 дней лечения, не выявил воспаления или токсичности ни в одной из групп лечения (рис. 3C и рис. S4B) . Ни в одном из жизненно важных органов микротромбов не обнаружено. Небольшое увеличение содержания крови в печени и селезенке было отмечено как у мышей, получавших HA, так и у HAPPI, по сравнению с физиологическим раствором. Мы также подтвердили безопасность HAPPI с помощью гематологического и биохимического анализов.Кровь, собранная через 1 или 7 дней лечения, показала, что на состав крови не повлияло лечение, поскольку ни один из измеренных параметров не показал статистически значимых различий между группами физиологического раствора и HAPPI (рис. S5). Точно так же не наблюдалось значительной разницы в уровнях параметров печени и почек между HAPPI и физиологическим раствором. В частности, было обнаружено, что концентрации ферментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы и азота мочевины крови в группах, получавших HAPPI, были в пределах нормы (рис.S5) ( 30 — 32 ), что указывает на отсутствие поддающейся обнаружению системной токсичности. HAPPI в дозировке, эквивалентной исследованиям эффективности in vivo, не влиял на системную коагулопатию, что подтверждено тестированием ex vivo цельной крови мышей с использованием тромбоэластографии (TEG). Никаких отклонений от нормы в кинетике образования сгустка или прочности сгустка не наблюдалось в присутствии НА или конъюгатов НА-пептид (таблица S1).

Механизм действия

Чтобы понять механизм улучшенной гемостатической эффективности HAPPI, взаимодействие между HAPPI и мышиными тромбоцитами было сначала изучено с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS).Рецепторы CD41 и CD62P использовали в качестве общих маркеров и маркеров активации тромбоцитов соответственно ( 33 ). Ни HA, ни HAPPI не индуцировали значительной активации тромбоцитов, о чем свидетельствует повышающая регуляция CD62P (фиг. 4A). Активацию аденозиндифосфатом (АДФ) использовали в качестве положительного контроля. Отсутствие активации тромбоцитов с помощью HAPPI имеет значительные положительные последствия для системной безопасности, так как предотвращает непреднамеренное образование эмболов, которое может быть потенциально смертельным при отсутствии места повреждения.Однако HAPPI продемонстрировал повышенное связывание с активированными тромбоцитами по сравнению с соответствующими контролями (фиг. 4, B и C). Сам по себе НА не связывается с активированными или неактивированными тромбоцитами. Однако связывание HAPPI с активированными тромбоцитами в 5,4 раза выше, чем у неактивированных тромбоцитов. Возможно, это связано со связыванием vWF на АДФ-активированной поверхности тромбоцитов ( 34 ).

( A ) FACS-анализ HAPPI-опосредованной активации тромбоцитов, измеренной по коэкспрессии CD62P / CD41 после 10 мин инкубации. Данные представлены в виде процента тромбоцитов, положительных для обоих эпитопов. ( B ) FACS-анализ прикрепления AF 647 – HA и HAPPI к тромбоцитам в их неактивированном и активированном состояниях [ n = 3, тест одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и тест множественных сравнений Тьюки, *** * P <0,0001]. ( C ) Репрезентативные точечные диаграммы для экспрессии AF 647-HA и HAPPI для обозначения связывания тромбоцитов с HA и HAPPI после 10 мин инкубации.( D ) Анализ агрегации тромбоцитов человека HAPPI, HA-VBP и HA-CBP с физиологическим раствором в качестве контроля. ( E ) Схема экспериментальной установки для исследования динамического связывания с использованием PPFC для подтверждения предпочтительной связывающей способности HAPPI с раневоспецифическими белками, коллагеном и vWF в потоке. ( F ) Типичные флуоресцентные изображения (увеличение × 20) (F1) DiOC ₆ -окрашенных тромбоцитов (зеленый), (F2) AF 647 – HAPPI (красный) и (F3) наложение F1 и F2 на то же поле зрения, демонстрирующее совместную локализацию тромбоцитов с HAPPI на поверхности коллаген + vWF (масштабные полосы, 100 мкм).нс, не имеет значения; АДФ, аденозиндифосфат; FACS, сортировка клеток с активацией флуоресценции.

Затем мы проверили потенциальную активность HAPPI в анализе агрегометрии тромбоцитов человека. Агрегометрия светопропускания показала, что HAPPI, HA-VBP и HA-CBP не вызывают агрегацию тромбоцитов, но добавление HAPPI и HA-VBP усиливает агрегацию, индуцированную АДФ, о чем свидетельствует увеличение светопропускания по сравнению с HA-CBP. и контрольные растворы солевого раствора (фиг. 4D). Сам по себе HAPPI не вызывает агрегации неактивных тромбоцитов человека, что согласуется с результатами вышеупомянутого исследования активации тромбоцитов на мышах.Тем не менее, прикрепление HAPPI к активированным тромбоцитам, предположительно посредством посредничества vWF, происходящего из гранул тромбоцитов ( 34 ), может быть ответственным за агрегацию тромбоцитов. Обратите внимание, что увеличение светопропускания на ~ 10% после добавления конъюгатов или физиологического раствора, скорее всего, вызвано ~ 16% разбавлением богатой тромбоцитами плазмы (PRP) кровоостанавливающими средствами и / или действием растворителя (физиологического раствора). Мы также подтвердили, что HAPPI не вызывает нежелательной агрегации солюбилизированного vWF, аналогично циркулирующему vWF в плазме.На размер белка vWF в физиологическом растворе, определяемый методом динамического светорассеяния (DLS), добавление HAPPI не влияло в течение как минимум 20 часов (рис. S6, от A до C). При смешивании HAPPI с плазмой в течение как минимум 7 дней преципитации не наблюдалось (рис. S6D).

Предпочтительное связывание HAPPI с vWF и коллагеном было дополнительно подтверждено с использованием проточной камеры с параллельными пластинами (PPFC) с казеином в качестве отрицательного контроля (фиг. 4E). При физиологически значимом напряжении сдвига 25 дин / см ² HAPPI, благодаря VBP и CBP, показал относительно более высокое связывание с коллагеном и поверхностью vWF по сравнению с одним HA (рис.S7). Когда HAPPI перфузировали через PPFC вместе с флуоресцентно меченными покоящимися тромбоцитами, наблюдалось четкое связывание как HAPPI, так и тромбоцитов на поверхности коллагена и vWF (фиг. 4F). Адгезия HAPPI и тромбоцитов на контрольной поверхности казеина была минимальной. Избирательное связывание HAPPI в присутствии тромбоцитов с коллагеном и белками vWF по сравнению с контрольным белком имеет большое физиологическое значение, поскольку адгезия тромбоцитов к коллагену и связанным с коллагеном vWF в месте повреждения и их последующая активация являются начальными еще важные шаги, чтобы остановить кровотечение.Адгезия HAPPI к этой поверхности либо через прямое связывание с коллагеном и vWF, либо через посредничество активированных тромбоцитов (рис. S7, C и D), как подтверждено выше в исследовании FACS, может указывать на их активное участие in vivo во время образования сгустка. процесс формирования на месте повреждения сосудов.

Чтобы оценить взаимодействие между HAPPI и естественными тромбоцитами, гемостатическая эффективность HAPPI была оценена у мышей с тромбоцитопенией. После введения разрушающих тромбоцитов антител естественное количество тромбоцитов у этих мышей было на ~ 95% ниже, чем у нормальных мышей (согласно спецификациям производителя).Когда этим мышам вводили HAPPI, наблюдалось умеренное уменьшение времени кровотечения по сравнению с группой, не получавшей лечения (фиг. 5A). Более тщательный осмотр показал, что кровотечение было почти остановлено на ~ 4 мин после инъекции конъюгатов (рис. 5B). Однако после этого кровотечение возобновилось. Эти результаты показывают, что, хотя сами HAPPI не образуют прочной физической пробки для остановки кровотечения, они очень эффективны в сотрудничестве с естественными тромбоцитами.

Кровопотеря у травмированных мышей с тромбоцитопенией, получавших HAPPI (эквивалентная доза HA 4,6 мг / кг): общая кровопотеря за 20-минутное время наблюдения ( A ) и график, представляющий значительную разницу в кинетике кровотечения ( B ) . Время выживания ( C ) и кровопотеря ( D ) у крыс с повреждением НПВ после лечения HAPPI (12 мг / кг) по сравнению с равным объемом физиологического раствора (*** P <0,001 и **** P <0,0001).

Гемостатическая эффективность в модели с внутренней несжимаемой травмой

На основе понимания гемостатической эффективности HAPPI мы далее оценили его способность улучшать гемостаз и выживаемость в модели летального травматического кровотечения у крысы, вызванного пункцией. нижней полой вены (НПВ) (рис.S8). В этой модели эффективность HAPPI оценивалась как стратегия спасения, при которой инфузия HAPPI выполнялась в начале кровоизлияния в НПВ. Крысы, получавшие HAPPI, испытали значительно более длительное время выживания по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор ( P = 0,0003). Среднее время выживания увеличилось с 25 (± 4,3) до 71 (± 8,1) мин (рис. 5C). Этот результат имеет клиническое значение, поскольку методы лечения, которые могут расширить окно выживания за пределы золотого часа после такого несжимаемого травматического кровотечения, крайне необходимы для предотвращения догоспитальных смертей ( 7 ).Не наблюдалось статистической значимости кровопотери между HAPPI и физиологическим раствором (фиг. 5D). Тем не менее, НПВ, полученная после эвтаназии, показала накопление HAPPI в месте повреждения (рис. S8B).

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования, представленные здесь, устанавливают уникальную гемостатическую конструкцию на полимерной основе, HAPPI, которую можно вводить системно для накопления в местах повреждения, чтобы обеспечить гемостатическое усиление и остановить кровотечение. Этот дизайн имеет клиническое значение, особенно при внутреннем несжимаемом кровотечении.Кровоизлияние из мест травм является причиной 90% выживаемых случаев смерти на догоспитальном этапе на поле боя и 64% смертей, связанных с травмами среди гражданского населения ( 4 , 5 ). Немедленное вмешательство в момент травмы, чтобы остановить кровотечение или увеличить период выживания, необходимо для предотвращения смерти. Таким образом, срочно необходимы методы лечения такого кровотечения на догоспитальном этапе. В отличие от распространенных конструкций кровоостанавливающих средств местного действия для доступного кровотечения, средства, которые можно вводить системно для остановки кровотечения эндоваскулярно (рис.6) чрезвычайно полезны для аварийных процедур.

HAPPI связывается с vWF и коллагеном, экспонированным в месте повреждения сосудов, и vWF, иммобилизованным на активированной поверхности тромбоцитов, облегчая набор и агрегацию тромбоцитов в месте повреждения для дальнейшего усиления процесса свертывания крови.

Успешные внутривенные гемостаты должны одновременно нацеливаться на участки повреждения и проявлять ограниченные нецелевые прокоагулянтные эффекты.Отличная совместимость с кровью и стабильность также являются важными требованиями для синтетического гемостатического средства. Наши результаты, представленные здесь, подтвердили, что этот недавно разработанный HAPPI отвечает всем этим требованиям, подчеркивая их осуществимость в переводе.

Для достижения эффекта связывания повреждений мы выбрали vWF и коллаген в качестве наших молекул-мишеней, которые действительно являются молекулами-триггерами для естественного гемостаза, опосредованного тромбоцитами. Физиологически после повреждения сосуда субэндотелиальный коллаген подвергается воздействию кровотока, а vWF, первичная молекула адгезии для тромбоцитов, связывается с обнаженным коллагеном и изменяет свою конформацию под действием сдвигающих сил потока, тем самым облегчая адгезию тромбоцитов как к vWF, так и к коллагену. (Рисунок.6, слева) ( 35 ). Предыдущие исследовательские усилия определили нацеливание пептидов на коллаген и vWF и достигли избирательного накопления частиц-носителей на участке раны ( 16 , 18 ). Посредством анализа динамического связывания в PPFC мы подтвердили, что HAPPI вместе с тромбоцитами может связываться с этими специфичными для повреждений белками в потоке (рис. 4, E и F). Из исследования FACS мы обнаружили, что HAPPI также может избирательно связываться с активированными тромбоцитами примерно в 5,4 раза больше, чем связывание с неактивированными тромбоцитами (рис.4B), которые потенциально могут происходить из связывания HAPPI с vWF, связанным с рецепторами GPIIb / IIIa на активированной поверхности тромбоцитов ( 34 ). Эта дополнительная селективность в отношении активированных тромбоцитов может дополнительно способствовать привлечению и адгезии активированных тромбоцитов к участкам повреждения, ускоряя процесс образования сгустка (рис. 6, справа).

Исследования также были разработаны для проверки нецелевых эффектов HAPPI на коагуляцию. HAPPI стабилен в плазме в течение нескольких дней без преципитации, и HAPPI не вызывает ненужной агрегации vWF, солюбилизированного в физиологическом растворе.Исследования FACS и агрегометрии тромбоцитов показали, что сами HAPPI не активируют покоящиеся тромбоциты и не вызывают их агрегацию, тем самым создавая естественный запас безопасности против неспецифической агрегации циркулирующих покоящихся тромбоцитов. Исследования ТЭГ также подтверждают, что HAPPI не инициирует реакции коагуляции и не изменяет вязкоупругость цельной крови мыши и последующего сгустка. Эксперименты in vivo показывают схожие фармакокинетические характеристики и профили биораспределения HAPPI и нативного HA, неизменный состав крови и биохимию сыворотки, а также отсутствие воспаления и токсичности в жизненно важных органах, что указывает на то, что HAPPI, несущий два пептида, не вызывает систематической токсичности или образования тромбов.Это важное соображение для внутривенных гемостатов для поддержания тонкого баланса между физиологическим гемостазом и патологическим тромбозом, поскольку нерегулируемая активация или коагуляция тромбоцитов может представлять серьезный риск тромбоэмболии.

Использование биомакромолекулы HA для переноса пептидов обеспечивает совместимость HAPPI с кровью. ГК является одним из ключевых компонентов эндотелиального гликокаликса, регулирующего целостность сосудов ( 21 ). ГК также является ключевой молекулой в регуляции многих клеточных и биологических процессов и, в частности, он является основным макромолекулярным регулятором заживления ран после сосудистого повреждения ( 22 ).Учитывая его специфические биологические и биоактивные свойства, терапевтические составы на основе ГК одобрены и используются в клинической практике для лечения артритов и кожных заболеваний ( 23 ). Степень модификации HA находится в пределах 15%, что меньше пороговых значений для воздействия на биологические функции, такие как взаимодействие с рецепторами CD44 ( 36 ). Учитывая, что биологические свойства HA очень чувствительны к его молекулярной массе ( 37 ), мы исследовали размер молекулы HAPPI и обнаружили, что остов HA остается неповрежденным после процесса конъюгации и очистки (рис.1С). Гистологический, гематологический и химический анализы сыворотки крови дополнительно подтверждают безопасность HAPPI в краткосрочной (1 день) и долгосрочной перспективе (7 дней).

В совокупности HAPPI демонстрирует отличные перспективы в качестве быстродействующих внутривенных гемостатов. Мы подтвердили его гемостатическую эффективность на двух моделях животных: модели разрыва хвостовой вены мыши и травматическом повреждении нижней полой вены крысы (рис. 2 и 5, C и D). В модели разрыва хвостовой вены мыши значительное снижение (> 97%) кровопотери при инъекции HAPPI по сравнению с группами, не получавшими лечения или получавшими HA и свободные пептиды, подчеркивает превосходную гемостатическую эффективность поливалентной презентации пептидов на полимере HA. .Выраженный эффект конъюгатов, содержащих VBP (например, HAPPI и HA-VBP), можно объяснить присутствием vWF на активированных тромбоцитах ( 34 ). Временный гемостаз, достигнутый на модели тромбоцитопении у мышей с низким уровнем тромбоцитов (рис. 5, A и B), также согласуется с этой гипотезой. Эти результаты показывают, что HAPPI сам по себе не образует физической пробки в местах повреждения, а скорее избирательно ускоряет гемостатическую способность естественных тромбоцитов вызывать гемостаз.В модели летального травматического кровоизлияния у крысы, вызванного разрывом НПВ, HAPPI вводили после травмы как таковой, чтобы имитировать его фактическое применение в качестве спасательной терапии. HAPPI позволяет значительно увеличить время выживания до 71 мин. Это примечательно, учитывая, что при таком внутреннем, несжимаемом травматическом кровотечении критически важно расширить окно выживания за пределы золотого часа, чтобы облегчить травматологическим пациентам получение окончательной хирургической помощи и предотвратить догоспитальную смерть ( 7 , 38 ).Обратите внимание, что в модели на мышах до 50% введенной дозы остается циркулирующей в плазме в течение примерно часа. Длительное время циркуляции в сочетании с быстрой гемостатической активностью является преимуществом для устранения проблем с кровотечением во время транспортировки пациентов с травмами в клиники. Легкий синтез и стабильность при длительном хранении в окружающей среде этих полимерных агентов добавляют преимущества по сравнению с кровью или другими кровоостанавливающими средствами на биологической основе для применения в месте оказания медицинской помощи.

Хотя HAPPI продемонстрировал гемостатическую эффективность на двух различных моделях кровотечений, некоторые аспекты исследования нуждаются в дальнейшем изучении.Связывание HAPPI с активированными тромбоцитами предположительно связано со сродством VBP к vWF, который должен активировать поверхность тромбоцитов после секреции из α-гранул ( 34 ), но точный механизм молекулярного связывания остается неясным. В модели кровотечения из разрыва хвостовой вены мыши сокращение времени кровотечения и кровопотери наблюдались в группах, получавших физиологический раствор, по сравнению с группой, не получавшей лечения, что отличается от предыдущих наблюдений в модели пересечения хвоста мыши ( 16 ).Причина этого явления требует дальнейшего изучения. В модели травмы НПВ крысы HAPPI увеличил время выживания, но не уменьшил кровопотерю, как ожидалось, что могло быть связано с быстрым кровотечением и геморрагическим шоком сразу после травмы, а также с проблемами обнаружения тонких изменений кинетики. образования сгустка в наших экспериментальных условиях. Подробный гемодинамический мониторинг в реальном времени должен быть включен в будущем, чтобы отслеживать незначительные гемодинамические изменения во время процесса гемостаза.Более того, гемостатическая эффективность HAPPI должна быть проверена на модели травматического кровотечения у крупных животных, таких как свиньи, с полным контролем жизненно важных функций / диуреза и мониторингом газов артериальной крови. Хотя HAPPI был продемонстрирован как высокоэффективный гемостатический агент, зависимость от природных тромбоцитов потенциально ограничивает его применение для пациентов с тромбоцитопенией или дисфункцией тромбоцитов или пациентов, принимающих антиагрегантные препараты. Тем не менее, HAPPI может быть дополнительно применен для остановки эпизодов кровотечения в сочетании с другими методами лечения в силу его синтетической простоты присоединения нескольких фрагментов для дополнительной функциональности.В качестве универсальной платформы доставки лекарств полимерные конъюгаты обеспечивают многочисленные степени свободы для включения дополнительных молекул лекарств для диагностического или терапевтического действия при других сосудистых заболеваниях, таких как инсульт и атеросклероз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез конъюгатов HA-пептид

HA (250 кДа), приобретенный в Creative PEGWorks (Чапел-Хилл, Северная Каролина), флуоресцентно метили гидразидом AF 647 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) для всех исследований. облегчить обнаружение в последующих анализах.Сшивающие реагенты EDC гидрохлорид (EDC · HCl) и N -гидроксисульфосукцинимидная натриевая соль (сульфо-NHS), а также растворитель диметилсульфоксид (DMSO) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Пептиды, включая CBP ([GPO] ₇ H) и VBP (TRYLRIHPQSQVHQI), были коммерчески получены от GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ). Все материалы были использованы из указанных коммерческих источников без дополнительной очистки. Если не указано иное, для всех экспериментов использовали деионизированную (DI) воду из системы Milli-Q Plus (Millipore, Schwalbach, Германия).

Для флуоресцентного мечения НА полимер растворяли в деионизированной воде с концентрацией 10 мг / мл при постоянном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. EDC · HCl (2 × молярный избыток флуоресцентного красителя) растворяли в 1: 1 ДМСО: вода при концентрации 50 мг / мл и сразу же добавляли к раствору HA. AF 647 (0,3 мол.%) Относительно дисахаридных единиц НА растворяли в деионизированной воде (5 мг / мл) и добавляли к реакционной смеси. После реакции в течение ночи, как показано на фиг. 1А, флуоресцентную НА очищали осаждением в этаноле.После повторного растворения осажденного полимера в деионизированной воде раствор переносили в трубку с диализной мембраной из регенерированной целлюлозы (RC) Spectrum Spectra / Por 3 [отсечка молекулярной массы (MWCO), 10 кДа; Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания] и диализовали против большого избыточного количества деионизированной воды в течение 24 часов (трехкратная подмена воды) с последующей лиофилизацией.

Полученный AF 647 – HA использовали для дальнейшей конъюгации с CBP и VBP с использованием химии EDC / сульфо-NHS. Полимер растворяли в смеси деионизированной воды и ДМСО 1: 1 при 7.5 мг / мл при постоянном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Сульфо-NHS ​​(2-кратный молярный избыток пептидов) растворяли в деионизированной воде при 150 мг / мл, а EDC · HCl (2-кратный молярный избыток пептидов) растворяли в ДМСО при 50 мг / мл. Оба раствора были свежеприготовлены, добавлены к раствору НА и перемешаны в течение 1 часа при комнатной температуре для активации карбоксильных групп. На основе желаемых конъюгатов к раствору активированного полимера добавляли 10 мол.% CBP (2026 Да, 50 мг / мл) и / или 10 мол.% VBP (1876,2 Да, 50 мг / мл) в растворе ДМСО.Реакции позволяли протекать в течение ночи при комнатной температуре. Продукты очищали осаждением в этаноле и подвергали диализу (диализная мембранная трубка Spectrum Spectra / Por 3 RC; MWCO, 10 кДа; Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания) против большого избыточного количества водного раствора ДМСО / ДИ в течение 3 дней (50, 30 и 10% раствор ДМСО, каждый на 1 день) и чистую деионизированную воду еще на 4 дня (обновление растворителя: дважды в день). Процедуры очистки для отделения неконъюгированных полимеров от конъюгатов полимер-пептид не проводили.Затем флуоресцентные конъюгаты НА-пептид сушили вымораживанием и хранили при -20 ° C до дальнейшего использования. Та же процедура была принята для синтеза нефлуоресцентных конъюгатов НА-пептид для анализа молекулярной массы с помощью GPC.

Химическая характеристика с использованием ЯМР и GPC

Конъюгаты НА-пептид характеризовали с помощью протонного ЯМР ( ¹ H ЯМР). Полимерные конъюгаты растворяли в дейтерированной воде (D ₂ O), и спектры ЯМР ¹ H получали на спектрометре ЯМР Agilent DD2 600 МГц (Санта-Клара, Калифорния) с MNova 10.0.1 (Mestrelab Research, Испания). Химические сдвиги были представлены в миллионных долях со ссылкой на сигнал для D ₂ O при 4,79 м.д. Количество конъюгированных пептидов в продуктах реакции определяли количественно с помощью ¹ H ЯМР путем сравнения характеристических пиков пептидов и НА.

ГПХ-анализ выполняли на системе Viscotek 270max GPC (Malvern Instruments Ltd., Великобритания), оснащенной модулем подачи растворителя и образца GPCmax, тройным детектором TDA 305, УФ-детектором 2600 и программным обеспечением OmniSEC.Набор из двух колонок для ГПХ (TSKgel G5000SWXL или G4000SWXL и TSKgel G3000SWXL) элюировали тройным фильтрованием 0,2 M водным раствором NaNO ₃ и 0,01 M водным раствором мононатрийфосфата (pH 6,8) при скорости потока 0,6 мл / мин при 35 ° C. . Полимерные конъюгаты растворяли в воде или физиологическом растворе и фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Растворы полимеров (100 мкл) вводили каждый раз. Детектор светорассеяния с лазером 670 нм использовали для подтверждения конъюгации AF 647 с HA после разделения. УФ-поглощение при 280 нм использовали для подтверждения конъюгации пептидов с отделенными полимерами.Пуллулан с M _w 200 кДа и индексом полидисперсности 1,09 (Sigma-Aldrich, 01615) использовали для калибровки тройного обнаружения.

Структурная характеристика с использованием AFM

Полимерные конъюгаты растворяли в физиологическом растворе при концентрации 1 мг / мл в течение ночи и разбавляли деионизированной водой до 100 мкг / мл при вращении в течение ночи, а затем разбавляли до 5 мкг / мл. Разбавленные растворы перемешивали с использованием револьвера для трубок в течение ночи при комнатной температуре с периодическим встряхиванием для обеспечения перемешивания в молекулярном масштабе.Для получения изображений в воздухе подготовка образцов основана на предыдущей процедуре, описанной в Spagnoli et al. ( 24 ) с небольшими изменениями. Вкратце, 10 мкл раствора по каплям наносили на только что расщепленный ВОПГ, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и контролируемой влажности, дважды промывали 100 мкл деионизированной воды и сушили в атмосфере азота. Морфологию полимерных конъюгатов сканировали на воздухе с помощью микроскопа Cypher (Asylum Research, Санта-Барбара, Калифорния), работающего в режиме постукивания. Кремниевые кантилеверы с покрытием из хрома / золота (Cr / Au) с резонансными частотами от 44 до 95 кГц и жесткостью пружины в диапазоне 0.Применяли от 3 до 4,8 Н / м и силиконовый наконечник 9 ± 2 мм без покрытия (AC240TSA-R3, Asylum Research, Санта-Барбара, Калифорния). Для визуализации в жидкости свежерасщепленную слюду сначала инкубировали с 20 мкл водного раствора полилизина (1 мг / мл) в течение 30 с, промывали 4 мл деионизированной воды и сушили в потоке азота. Сразу после этого 20 мкл конъюгатов / физиологического раствора (5 мкг / мл) были нанесены по каплям на поверхность, инкубированы в течение 2 минут, промыты 400 мкл физиологического раствора и покрыты ~ 100 мкл физиологического раствора. Впоследствии кантилевер AC240TSA-R3 (Asylum Research) был установлен на держателе капель, смочен ~ 50 мкл физиологического раствора и помещен в инструмент.В зависимости от размера кадра частота развертки устанавливалась в диапазоне от 0,7 до 2,4 Гц. Изображения обрабатывались и анализировались с помощью программы Gwyddion 2.47.

Исследования гемостаза in vivo

Все эксперименты in vivo проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в учреждениях Гарвардского университета. Мышей BALB / c (от 9 до 10 недель, самки) и крыс Sprague-Dawley (от 8 до 10 недель, самцы) приобретали в Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Животных содержали в стандартных условиях 12 часов света / 12 часов темноты с неограниченным доступом как к пище, так и к воде до времени процедуры.

Для модели кровотечения из разрыва хвостовой вены мыши следовали процедуре, показанной на фиг. 2A, для оценки эффективности гемостаза. Чтобы имитировать фактическое применение, было бы идеально сначала вызвать повреждение, а затем лечить внутривенным введением гемостатических агентов. Однако здесь из-за трудностей в обращении была применена обратная процедура ( 16 ). Вкратце, здоровые самки мышей BALB / c были рандомизированы в различные контрольные и лечебные группы, включая необработанные, физиологический раствор, HA, CBP, VBP, HA-CBP, HA-VBP, HA-VBP / HA-CBP и HAPPI.Контрольные или экспериментальные составы вводили внутривенно через инъекцию в хвостовую вену с использованием одноразовых игл 27-го размера. Как подробно описано в подписи к фиг. 2, дозировка экспериментальных составов (HA-CBP, HA-VBP и HAPPI) сначала была нормализована до HA (4,6 мг / кг; определено в пилотном исследовании; рис. S9) с эквивалентным и количества пептидов для пептидных контролей, а затем нормализованные до пептидов (0,68 мкмоль / кг) на основе степени конъюгации пептидов, как было предложено одним из составителей обзора.Для группы, получавшей HA-VBP / HA-CBP, равные объемы растворов HA-VBP и HA-CBP были смешаны для получения конечных концентраций, которые были такими же, как те, которые использовались в группе HA-VBP и группе HA-CBP, соответственно. . Через 1 или 20 мин (как указано на рис. 2) время циркуляции стерильным скальпелем № 10 на противоположной боковой вене был сделан разрез диаметром 0,5–1 мм с диаметром хвоста ~ 2,5 мм. и ранее описанный шаблон разрыва ( 25 ). Разорванный хвост немедленно погружали в 14 мл стерильного физиологического раствора при 37 ° C, и время кровотечения регистрировали с помощью секундомера.Даже после остановки кровотечения хвост оставался погруженным в теплый физиологический раствор в течение 4 минут после травмы для наблюдения за любыми дальнейшими эпизодами кровотечения. Следили за тем, чтобы не потревожить и не коснуться поврежденного сосуда в течение всего периода наблюдения. Учитывая, что большинство точек данных о времени кровотечения находились в пределах 2 минут и повторного кровотечения не наблюдалось, животных умерщвляли через 5 минут после инъекции. Объем крови из места кровотечения определяли количественно с помощью реактива Драбкина ( 39 ). Кровь, собранную в теплом физиологическом растворе, центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин при 4 ° C.После удаления супернатанта осажденные эритроциты лизировали путем ресуспендирования в 10 мл реактива Драбкина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) для количественного определения высвобожденного гемоглобина (Hb) путем измерения оптической плотности в 96-луночном прозрачном УФ-луче Corning. микропланшет при 540 нм с использованием ридера для микропланшетов SpectraMax i3 (Molecular Devices LLC., Сан-Хосе, Калифорния). Объем кровотечения рассчитывали по количеству Hb (наномоль) с использованием уравнения. 1Hb (нмоль) = абсорбция (AU) × калибровочная константа (нгмл.AU) × объем реагента Драбкина (мл) Молекулярная масса Hb (гмоль) (1)

Для индукции тромбоцитопении антитела против рецепторов тромбоцитов GPIbα мыши (R300, Emfret Analytics, Германия) вводили внутривенно в дозе 2 мкг / г веса тела, чтобы вызвать истощение тромбоцитов ( 40 ).Спустя 12 часов после введения антитела, у мышей с тромбоцитопенией проводили анализы кровотечения из хвостовой вены, как описано ранее. Явление кровотечения наблюдалось до конечной точки эксперимента через 20 минут после достижения травмы.

Для модели травмы IVC у крыс 18 крыс были рандомизированы в две разные группы (по девять крыс в каждой): физиологический раствор и HAPPI. Дозировка HAPPI была установлена ​​на уровне 12 мг / кг, как определено в исследовании на мышах. Такой же объем физиологического раствора использовали для контрольной группы.После анестезии путем ингаляции комбинации кислорода и изофлурана (от 2 до 3%) левая паховая вена была рассечена и идентифицирована левая бедренная вена, отделена от соединенной ткани и канюлирована с использованием предварительно заполненного физиологическим раствором катетера 22 размера. Затем во избежание свертывания внутри катетера промыли 0,05 мл. Впоследствии был выполнен длинный разрез по средней линии, кишечник осторожно вынули из брюшной полости и увлажняли теплой физиологическим раствором и влажной марлей. НПВ обнажали через четырехплечий ретрактор и отделяли от аорты и соединяющих жировых тканей ниже почечных вен.Нить размера 3 использовалась для аккуратной изоляции НПВ. Если во время рассечения НПВ была разорвана, то крыс в дальнейшем не использовали. Катетер 18 калибра использовался для полного прокола НПВ. Сразу после удаления катетера (начало кровотечения, время 0) через катетер бедренной вены внутривенно вводили физиологический раствор (1,25 мл / кг) или HAPPI (1,25 мл / кг). За животным наблюдали в течение 2 часов или до смерти, определяемой по прекращению легочной функции. Регистрировали время выживания и количественно оценивали кровопотерю, используя предварительно взвешенные 4-дюймовые марли.IVC собирали и отображали с помощью системы визуализации In Vivo (PerkinElmer, Waltham, MA).

Исследования биораспределения, фармакокинетики и системной токсичности на мышах

Флуоресцентные конъюгаты HA (эквивалентные дозе HA 4,6 мг / кг) с CBP и VBP или без них были восстановлены в физиологическом растворе для внутривенной инъекции с последующим разрезом хвостовой вены у здоровой самки BALB / c массой от 18 до 21 г ( n = 3 на группу). В указанные моменты времени (5 мин, 30 мин, 1 час, 6 часов и 24 часа) после инъекции мышей умерщвляли передозировкой анестетика путем ингаляции диоксида углерода.Кровь извлекали сердечной пункцией, и органы перфузировали фосфатно-солевым буфером (PBS). Для исследований фармакокинетики и биораспределения плазму получали центрифугированием клеток крови при 1250 g в течение 10 мин при 4 ° C. Представляющие интерес органы (мозг, сердце, почки, печень, легкие, селезенка и поврежденный участок хвоста) собирали, взвешивали и переваривали в 1-2 мл буфера для лизиса и экстракции радиоиммунопреципитации Thermo Scientific с использованием основного гомогенизатора T10 ULTRA TURRAX ( IKA Works, Wilmington, NC) для получения лизатов тканей.Затем гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут, и супернатант использовали для количественного определения количества конъюгатов HA в каждом органе с помощью флуоресцентной спектроскопии ( _ex / λ _em : 640/665). Подобная подготовка образцов использовалась для измерения флуоресценции стандартных растворов для расчета процента введенной дозы на грамм ткани (% ID / г).

Для определения системной токсичности мышам ( n = 3) вводили физиологический раствор, HA или HAPPI и подвергали эвтаназии через 30 минут, 1 день и 7 дней после нанесения травмы.Жизненно важные органы, включая мозг, сердце, почки, печень, легкие и селезенку, собирали, фиксировали формалином и заливали парафином для дальнейшего гистологического анализа. Срезы органов окрашивали H&E. Для гематологического и биохимического анализов образцы крови собирали на 1-й и 7-й дни после травмы, отправляли в лабораторию IDEXX (North Grafton, MA) и анализировали в течение 4 часов после забора. Образцы крови собирали в пробирку с антикоагулянтом EDTA на 0,5 мл (верхняя пробирка LTT-MINI) и в пробирку 0.Пробирка с гелем для сыворотки на 8 мл (SST-MINI Gold Top Tube), обе предоставлены IDEXX Laboratories, для гематологического и биохимического анализов соответственно. Цельную кровь перемешивали, осторожно переворачивая пробирку для предотвращения свертывания и гемолиза, и хранили на льду. Сыворотку отделяли центрифугированием при 2000 г в течение 10 мин после 20 мин свертывания при комнатной температуре.

TEG, агрегометрия тромбоцитов и тест стабильности плазмы HAPPI

TEG с использованием системы анализатора гемостаза TEG 5000 Thrombelastograph (Haemonetics Corporation, Braintree, MA) проводили на цитратной цельной крови мыши BALB / c, коммерчески полученной от BioIVT.Вкратце, кровь смешивали с физиологическим раствором или конъюгатами НА в дозах, эквивалентных исследованиям эффективности in vivo, и кинетику образования сгустка изучали в прозрачных одноразовых стаканчиках и булавках.

Тест агрегометрии тромбоцитов с использованием четырехканального агрегометра с ионизированным тромбоцитами кальция (модель 660, Chrono-log Corp, Пенсильвания) проводили на PRP человека. Вкратце, у здоровых доноров брали образцы цельной крови в присутствии 10% цитрата натрия и центрифугировали при ~ 200 г в течение 20 минут. Верхний слой PRP собирали и выдерживали на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут.Концентрацию тромбоцитов определяли и доводили до ~ 2 × 10 ⁵ / мкл с помощью предварительно нагретого буфера Hepes-Tyrode-глюкоза с использованием Hemavet 850FS (Drew Scientific, FL). В условиях перемешивания при 37 ° C 39 мкл HAPPI, HA-VBP, HA-CBP или контрольного раствора добавляли в кювету, содержащую 211 мкл PRP в дозах, эквивалентных исследованию in vivo. Шесть минут спустя в качестве агониста добавляли 3 мкл АДФ (2,5 мМ), что приводило к агрегации тромбоцитов и, таким образом, к увеличению светопропускания. Данные были проанализированы с использованием программного пакета AGGRO / LINK версии 5.2.5 и Microsoft Office Professional Plus 2013.

Для проверки стабильности HAPPI в плазме и PBS 100 мкл HAPPI смешивали с 566,7 мкл плазмы мышей BALB / c (3,2% NaCit, объединенные самки, BioIVT) и инкубировали при 37 °. C для проверки образования осадков в течение 1 недели. Кроме того, размер белка vWF (Sigma-Aldrich, 681300-100UG) измеряли с помощью DLS (Zetasizer Zen 3600, Malvern Instruments) до и после добавления равного количества HAPPI (40 мкг / мл). Для каждой временной точки были измерены три повтора.

Анализы динамического связывания

Обычные стеклянные предметные стекла Fisherbrand (2 дюйма на 3 дюйма) обезжиривали 2 М HCl в 50% этаноле и промывали деионизированной водой. Очищенные слайды были помечены двумя отчетливыми круглыми пятнами и покрыты 10 мкл казеинового блокирующего буфера (B6429, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и смесью коллагена и vWF соответственно. Равные объемы коллагена типа 1 (100 мкг / мл; CC050, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и vWF (50 мкг / мл; RP-43132, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9.6) были смешаны вместе для получения смеси коллагена и vWF. Стеклянные предметные стекла, покрытые микропятнами, инкубировали во влажной камере в течение 2 часов при 37 ° C и промывали PBS, содержащим 0,1% Tween 20. Тромбоциты мыши получали из PRP (BioIVT), промывали трижды PBS и окрашивали 3,3 ‘. -дигексилоксакарбоцианина иодид (DiOC ₆ ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) для детектирования флуоресценции (λ _ex : 485 нм; λ _em : 501 нм). Для анализов динамического связывания устройство PPFC с прямоугольным проточным каналом (ширина потока: 0.25 см; высота: 0,0254 см) был получен от GlycoTech (Гейтерсбург, Мэриленд, США). Стеклянные слайды с покрытием герметизировали под вакуумом на прозрачном PPFC, и поток жидкости поддерживали через силиконовые трубки и приспособления с помощью программируемого насоса (VWR Variable-Speed ​​Peristaltic Pumps 70730-062, VWR International). Конъюгаты HA, меченные AF 647, нормализованные по количеству HA и, таким образом, флуоресценции, с или без окрашенных DiOC ₆ тромбоцитов мыши перфузировали через камеру со скоростью 25 дин / см ² в течение 5 минут в рециркуляционной петле.После промывки PBS стеклянные предметные стекла визуализировали под эпифлуоресцентным микроскопом для наблюдения за связыванием тромбоцитов и / или конъюгатов с неспецифическим казеином, а также с целевым коллагеном и микропятнами, покрытыми vWF. Изображения обрабатывали и анализировали с помощью ImageJ (Национальные институты здравоохранения) для количественной оценки интенсивности флуоресценции связанных конъюгатов и тромбоцитов.

Исследования FACS

Антимышиный CD62P (каталожный номер 148303, клон: RMP-1) и антимышиный CD41 (каталожный номер.133917, клон: MWReg30) антитела были приобретены у BioLegend (Сан-Диего, Калифорния). Перед использованием их разводили соответствующим образом в буфере для проточной цитометрии eBioscience от Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс). Тромбоциты мышей идентифицировали с помощью поверхностного антигена CD41, и CD62P (P-селектин) использовали в качестве эксклюзивного маркера для определения их активации ( 33 ) при инкубации с AF 647 – HA и AF 647 – HA-CBP-VBP. Для изучения влияния на активацию плазму мышей инкубировали в течение 10 мин с эквивалентными концентрациями НА и его конъюгатов соответственно.Раствор АДФ использовали в качестве положительного контроля для активации. Вкратце, тромбоциты в мышином PRP, полученном от BioIVT (Westbury, NY), активировали с использованием 2 × 10 ^-5 M АДФ в PBS в течение 10 мин. Для исследований активации и связывания с конъюгатами активированные тромбоциты инкубировали с соответствующими концентрациями конъюгата в течение еще 10 мин. После промывки на центрифуге окрашивающим буфером при 1250 г в течение 10 минут при 22 ° C образцы тромбоцитов окрашивали антителами в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте, а анализ проточной цитометрии проводили с использованием анализатора BD LSR II (Franklin Lakes , Нью-Джерси).Экспериментальные данные анализировали с помощью FCS Express 6 (De Novo Software, Глендейл, Калифорния).

Статистический анализ

Статистический анализ всех исследований выполняли с использованием Prism 8.2.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния) для расчета среднего и SEM для каждой экспериментальной и контрольной группы. Статистическую значимость данных проточной цитометрии с нормальным распределением определяли с использованием теста однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и теста множественных сравнений Тьюки. Для исследований in vivo время кровотечения и кровопотеря (наномоль Hb) анализировались с помощью двустороннего непараметрического теста Манна-Уитни (* P <0.05 и ** P <0,01) и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с последующими апостериорными сравнениями с использованием критерия Данна с доверительным интервалом 95% ( P <0,05).

достижений в терапии топических гемостатических агентов: всестороннее обновление

Когда использовать кровоостанавливающие средства в EMS

Кровоизлияние является причиной около 40 процентов смертей в результате травм, от 33 до 56 процентов этих смертей приходится на догоспитальный период (Kauvar, Lefering, & Wade, 2006).Ранняя помощь при травмах подчеркивает важность минимизации кровопотери на догоспитальном этапе. Нет споров о важности контроля кровотечения как первого шага в снижении смертности от травм.

Кровоостанавливающие средства и EMS

Системы неотложной помощи по всей стране все чаще добавляют местные гемостатические средства к их догоспитальному лечению кровотечений (Kerby & Cusick, 2012).Местные гемостатические агенты доступны в виде порошков, гранул или повязок, состоящих из традиционной марли или повязок, пропитанных активным агентом. Идеальным кровоостанавливающим средством (Granville-Chapman, Jacobs, & Midwinter, 2011) должно быть:

• Способен остановить кровотечение из крупных артерий и вен в течение двух минут после нанесения
• Возможность эффективного применения через пулы крови, упакована как готовый к использованию агент
• Простота использования даже лицами, не имеющими медицинского образования
• Легкий и прочный
• Возможность длительного хранения в широком диапазоне температур
• Недорого
• Без бактериального или вирусного риска

На сегодняшний день ни один местный гемостатический агент не отвечает всем этим критериям.Однако на рынке доступен ряд агентов. Врачи делят эти кровоостанавливающие средства на одну из трех групп в зависимости от механизма действия (Granville-Chapman, Jacobs, & Midwinter, 2011):

1. Мукоадгезивные агенты
2. Концентраторы факторов
3. Прокоагулянтные добавки

Мукоадгезивные агенты: использование соли для улучшения свертывания крови

Мукоадгезивные агенты вступают в реакцию с кровью, образуя герметизирующую оболочку над раной, которая останавливает кровоток.И HemCon®, и Celox ™ используют гранулированную соль хитозана, полученную из панцирей морских членистоногих (Granville-Chapman, Jacobs, & Midwinter, 2011). Эти положительно заряженные соли реагируют и связываются с отрицательно заряженными эритроцитами, быстро образуя поперечно-сшитый барьерный сгусток, который закрывает поврежденный сосуд (Буркатовская и др., 2006; Kozen, Kircher, Henao, Godinez, & Johnson, 2008 г.).

Исследователи обнаружили, что HemCon® клинически превосходит стандартную марлю в модели венозного кровотечения с низким давлением и высоким потоком (Pusateri et al., 2003), хотя этот тип травмы может не отражать характер травм, встречающихся на догоспитальном этапе (Lawton, Granville-Chapman, & Parker, 2009). В модели неконтролируемого артериального кровотечения под высоким давлением HemCon® изначально был эффективен для контроля, но не мог поддерживать гемостаз (Kheirabadi, Acheson, Sondeen, Ryan, & Holcomb, 2004).

Несмотря на эту неудачу, ретроспективный обзор 34 случаев кровотечения, леченных HemCon®, Портленд, штат Орегон.пожарные обнаружили контроль кровотечения в 79% случаев (Brown, Daya, & Worley, 2009). С другой стороны, при параллельном сравнении обычно используемых топических гемостатических агентов на модели неконтролируемого кровотечения у свиней Celox ™ был единственным агентом, улучшающим краткосрочную выживаемость (Kozen, Kircher, Henao, Godinez, & Johnson, 2008) .

Концентраторы факторов: супердегидратор

, такие как QuikClot®, быстро поглощают воду из крови в месте повреждения, которая концентрирует тромбоциты и другие внутренние факторы свертывания, что приводит к более быстрому образованию сгустка.Активным ингредиентом QuikClot® является цеолит, инертный вулканический минерал, который быстро поглощает воду в экзотермической (выделяющей тепло) реакции.

Помимо водопоглощающих свойств, исследование in vitro показало, что цеолит также быстро увеличивает концентрацию ионов кальция в крови, что способствует быстрому образованию сгустков (Li et al., 2013). В первом поколении QuikClot® медицинские работники заливали гранулы цеолита прямо в рану.Однако врачи вскоре обнаружили, что экзотермическая реакция была достаточно значительной, чтобы вызвать ожоги и некроз тканей (McManus, Hurtado, Pusateri, & Knoop, 2007; Rhee, et al., 2008; Wright et al., 2004). В результате гранулированная форма QuikClot® больше не доступна.

QuikClot® второго поколения заменил гранулы на более крупные цеолитные шарики и упаковал их в небольшой сетчатый мешок (QuikClot® ACS + ™), который вставляли в кровоточащую рану.Сумка облегчает удаление продукта во время операции. Изменения во втором поколении продукта снизили температуру, создаваемую реакцией, и дали более безопасное средство для местного применения (Ahuja et al., 2006).

Одним из концентраторов факторов, не вызывающих экзотермической реакции, является WoundStat ™, который представляет собой биоразлагаемый порошок, состоящий из минерала смектитовой глины и сшитой полиакриловой кислоты (Lawton, Granville-Chapman, & Parker, 2009).Частицы смектита имеют отрицательный заряд, который активирует пути коагуляции и способствует свертыванию (Kheirabadi et al., 2010).

Хотя ранние исследования на животных продемонстрировали эффективность WoundStat ™ в борьбе с кровотечением и улучшении выживаемости (Clay, Grayson, & Zierold, 2010; Kheirabadi et al., 2009; Ward et al., 2007), последующее исследование продемонстрировало наличие активных частиц в WoundStat ™ повредил облицовку кровеносных сосудов, вызвал окклюзионный тромб в поврежденных сосудах и мигрировал в легочную сосудистую сеть (Kheirabadi et al., 2010). В результате этот продукт был удален с рынка (Kerby & Cusick, 2012).

В других концентраторах факторов, таких как TraumaDex ™, используются микропористые полисахаридные атмосферы, полученные из картофельного крахмала. По сравнению с QuikClot® на модели раны в паху свиньи этот продукт оказался менее эффективным и, по сути, был не лучше стандартных марлевых повязок (Alam et al., 2003).

Прокоагулянтные добавки: более быстрое свертывание

Добавки прокоагулянта доставляют в рану дополнительные факторы свертывания, которые затем объединяются с уже имеющимися факторами свертывания.Вместе эти факторы свертывания увеличивают скорость образования сгустков крови. Некоторые продукты содержат факторы свертывания крови человека, а другие — факторы, полученные из бычьей крови (Granville-Chapman, Jacobs, & Midwinter, 2011).

Единственной прокоагулянтной добавкой, одобренной Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, является Combat Gauze ™ (Littlejohn, Bennett, & Drew, 2015). Этот продукт на самом деле является третьим поколением продуктов QuikClot®, в которых производитель заменил цеолит на каолин, глину, содержащую активный ингредиент силикат алюминия.Combat Gauze ™ использует марлевые повязки, пропитанные каолином. Модель на животных определила, что Combat Gauze ™ так же эффективна, как и QuikClot® второго поколения, в борьбе с кровотечением без чрезмерного нагрева (Baker, Sawvel, Zheng, & Stucky, 2007).

Исследователи, проводившие научно-обоснованный обзор в попытке определить, безопасна ли Combat Gauze ™ для контроля кровотечения на догоспитальном этапе, определили, что, хотя и не окончательно, результаты в поддержку продукта были многообещающими (Gegel, Austin, & Johnson, 2013 ).

Параллельное сравнение четырех гемостатических повязок на животной модели артериального кровотечения продемонстрировало превосходство выживаемости, связанное с использованием Combat Gauze ™ (Kheirabadi, Scherer, Estep, Dubick, & Holcomb, 2009). В этом исследовании ученые планировали протестировать каждый из продуктов на 10 животных. Однако два продукта на основе хитозана (HemCon® и Celox ™ -D) не смогли достичь гемостаза в первых шести тестах, и все животные погибли.В результате исследователи не тестировали эти продукты на последних четырех животных.

В аналогичном исследовании исследователи обнаружили повторное кровотечение после первоначального гемостаза у 33 процентов животных, получавших марлю Celox ™, по сравнению с отсутствием повторного кровотечения у животных, получавших Combat Gauze ™ (Rall et al., 2012).

На животной модели неконтролируемого кровотечения исследователи проверили, производит ли Combat Gauze ™ более стабильный сгусток по сравнению со стандартной практикой тампонирования ран (Gegel et al., 2012). После достижения гемостаза исследователи переместили пораженную ногу животных, чтобы имитировать движение, которое могло произойти во время эвакуации и транспортировки в учреждение более строгого ухода. Количество движений, необходимых для повторного кровотечения после использования Combat Gauze ™, было значительно выше по сравнению со стандартной терапией тампонажа раны.

Клиницисты даже сообщили об успехе в использовании Combat Gauze ™ для контроля кровотечения, связанного с местами введения чрескожного катетера, у пациентов, подвергающихся экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) (Lamb, Pitcher, Cavarocchi, & Hirose, 2012).Использование безопасных и эффективных гемостатических повязок для пациентов, перенесших ЭКМО, может снизить потребность в переливании крови, хирургическом вмешательстве, общих расходах на здравоохранение и способствовать более быстрому выздоровлению пациента.

Руководство по тактическому уходу за ранеными во время боевых действий, разработанное Командованием специальных операций США, рекомендует Combat Gauze ™ в качестве гемостатической повязки выбора (Bennett et al., 2014). Тем не менее, руководство допускает альтернативное использование марли Celox ™ и ChitoGauze® в случае, если Combat Gauze ™ недоступен.

Гемостатические средства: Текущая рекомендация

Группа экспертов по догоспитальной помощи при травмах, созванная Американским колледжем хирургов, недавно рекомендовала догоспитальное использование местных гемостатических средств в сочетании с прямым давлением для остановки кровотечения при травмах, когда одно прямое давление неэффективно или непрактично, и в случаях, когда наложение жгута невозможно из-за анатомических ограничений (Bulger et al., 2014). Не одобряя использование конкретного продукта, комиссия рекомендовала, чтобы системы EMS выбирали продукт с продемонстрированной эффективностью, доступный в формате марли, что позволяет упаковывать рану.

Список литературы

Ахуджа, Н., Остомель, Т. А., Ри, П., Стаки, Г. Д., Конран, Р., Чен, З., Аль-Мубарак, Г. А., Велмахос, Г., Демоя, М., И Алам, Х. Б. (2006). Тестирование гемостатической повязки с модифицированным цеолитом на большой животной модели с летальной травмой паха. Журнал травм-травм, инфекций и интенсивной терапии, 57 (2), 61 (6), 1312–1320. DOI: 10.1097 / 01.ta.0000240597.42420.8f

Алам, Х. Б., Уй, Г. Б., Миллер, Д., Кустова, Э. Хэнкок, Т., Иносенсио, Р., Андерсон, Д., Льоренте, О., и Ри, П. (2003). Сравнительный анализ кровоостанавливающих средств на модели смертельной травмы паха у свиней.Журнал Trauma-Injury Infection & Critical Care, 54 (6), 1077-1082. DOI: 10.1097 / 01.TA.0000068258.99048.70

Бейкер С. Е., Савел А. М., Чжэн Н. и Стаки Г. Д. (2007). Контроль биопроцессов с неорганической поверхностью: кровоостанавливающие средства из слоистой глины. Химия материалов, 19 (18), 4390-4392. DOI: 10,1021 / см071457b

Беннет, Б. Л., Литтлджон, Л.Ф., Хейрабади, Б. С., Батлер, Ф. К., Котвал, Р. С., Дубик, М. А., и Бейли, Дж. А. (2014). Лечение наружного кровотечения при оказании тактической помощи раненым в боевых условиях: гемостатические марлевые повязки на основе хитозана — TCCC Guidelines-Change 13-05. Журнал медицины специальных операций, 14 (3), 40-57.

Браун, М. А., Дайя, М. Р., и Уорли, Дж. А. (2009). Опыт применения хитозановых повязок в гражданской системе скорой медицинской помощи. Журнал неотложной медицины, 37 (1), 1-7.DOI: 10.1016 / j.jemermed.2007.05.043

Балджер, Э.М., Снайдер, Д., Шоллес, К., Готшал, К., Доусон, Д., Лэнг, Э., Санддал, Н.Д., Батлер, Ф.К., Фаллат, М., Тайлак, П., Уайт, Л., Саломоне, Дж. П., Зайфарт, В., Бецнер, М. Дж., Йоханнигман, Дж., И МакСвейн, Н. мл. (2014). Основанное на фактических данных догоспитальное руководство по контролю внешнего кровотечения: Комитет Американского колледжа хирургов по травмам. Неотложная догоспитальная помощь, 18 (2), 163-173.DOI: 10.3109 / 10

Буркатовская М., Тегос, Г. П., Свитлик, Э., Демидова, Т. Н., П. Кастано, А., и Хамблин, М. Р. (2006). Использование хитозановой повязки для предотвращения смертельных инфекций от сильно загрязненных ран у мышей. Биоматериалы, 27 (22), 4157–4164. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2006.03.028

Клэй, Дж. Г., Грейсон, Дж. К., & Зиерольд, Д. (2010). Сравнительное тестирование новых гемостатических средств на модели артериального и венозного кровоизлияния в конечности у свиней. Военная медицина, 175 (4), 280–284.

Гегель Б. Т., Остин П. Н. и Джонсон А. Д. (2013). Основанный на фактах обзор использования боевой марли (QuikClot) для остановки кровотечения. Журнал AANA, 81 (6), 453-458.

Гегель, Б., Бургерт, Дж., Гаско, Дж., Кэмпбелл, К., Мартенс, М., Кек, Дж., Рейнольдс, Х., Лоурен, М., и Джонсон, Д. (2012). Влияние QuikClot Combat Gauze и движения на контроль кровотечения у модели свиньи. Военная медицина, 177 (12), 1543-1547.

Грэнвилл-Чепмен, Дж., Джейкобс, Н., и Мидвинтер, М. Дж. (2011). Гемостатические повязки на догоспитальном этапе: систематический обзор. Травма, 42 (5), 447–459. DOI: 10.1016 / j.injury.2010.09.037

Керби, Дж. Д., & Кьюсик, М. В. (2012). Догоспитальная неотложная помощь и лечение травм. Хирургические клиники Северной Америки, 92 (4), 823–841 doi: 10.1016 / j.suc.2012.04.009

Хейрабади, Б.С., Ачесон, Э.М., Сондин, Дж. Л., Райан, К. Л., и Холкомб, Дж. Б. (2004). Гемостатический эффект двух усовершенствованных повязок на модели кровотечения из аорты у свиней [аннотация].Журнал травм, травм, инфекций и интенсивной терапии, 57 (2), 439.

Хейрабади Б. С., Шерер М. Р., Эстеп Дж. С., Дубик М. А. и Холкомб Дж. Б. (2009). Определение эффективности новых гемостатических повязок на модели артериального кровотечения конечности у свиней. Журнал Trauma-Injury Infection & Critical Care, 67 (3), 450-459. DOI: 10.1097 / TA.0b013e3181ac0c99

Хейрабади, Б.С., Эденс, Дж. У., Терразас, И. Б., Эстеп, Дж. С., Клемке, Х. Г., Дубик, М. А., и Холкомб, Дж. Б. (2009). Сравнение новых гемостатических гранул / порошков с применяемыми в настоящее время гемостатическими продуктами на летальной модели артериального кровотечения в конечности у свиней. Журнал травм-травм, инфекций и интенсивной терапии, 66 (2), 316-328. DOI: 10.1097 / TA.0b013e31819634a1

Хейрабади, Б.С., Мейс, Дж. Э., Терразас, И. Б., Федык, К.Г., Эстеп, Дж. С., Дубик, М. А., и Блэкборн, Л. Х. (2010). Оценка безопасности новых гемостатических агентов, гранул смектита и марли, покрытой каолином, на модели сосудистой раны у свиньи. Журнал травм-травм, инфекций и интенсивной терапии, 68 (2), 269–278. DOI: 10.1097 / TA.0b013e3181c97ef1

Козен, Б.Г., Кирчер, С.Дж., Энао, Дж., Годинез, Ф.С., и Джонсон, А.С. (2008). Альтернативная гемостатическая повязка: сравнение CELOX, HemCon и QuikClot.Академическая неотложная медицина, 15 (1), 74-81. DOI: 10.1111 / j.1553-2712.2007.00009.x

Каувар, Д. С., Леферинг, Р., и Уэйд, К. Э. (2006). Влияние кровотечения на исход травмы: обзор эпидемиологии, клинических проявлений и терапевтических соображений. Журнал травм-травм, инфекций и интенсивной терапии, 60 (6 Suppl), S3-S11. DOI: 10.1097 / 01.ta.0000199961.02677.19

Лэмб, К.М., Питчер, Х.Т., Каварокки, Н.С., и Хиросе, Х. (2012). Гемостаз сосудистой системы при чрескожной экстракорпоральной мембранной оксигенации. Открытый журнал сердечно-сосудистой и торакальной хирургии, 5, 8-10. DOI: 10.2174 / 1876533501205010008

Лоутон, Дж., Грэнвилл-Чепмен, Дж., И Паркер, П. (2009). Новые кровоостанавливающие повязки. Журнал медицинского корпуса Королевской армии, 155 (4), 309-314 DOI: 10.1136 / jramc-155-04-13

Ли, Дж., Цао, W., Lv, X. X., Jiang, L., Li, Y. J., Li, W. Z., Chen, S. Z., & Li, X. Y. (2013). Гемостат QuikClot на основе цеолита выделяет кальций в кровь и способствует свертыванию крови in vitro. Acta Pharmacologica Sinica, 34 (3), 367-372. DOI: 10.1038 / aps.2012.159

Литтлджон, Л., Беннет, Б. Л., и Дрю, Б. (2015). Применение современных методов борьбы с кровотечением в уходе за деревней: Часть вторая, гемостатические повязки и другие дополнения [статья в прессе].Дикая природа и экологическая медицина. DOI: 10.1016 / j.wem.2014.08.018

Макманус, Дж., Уртадо, Т., Пусатери, А., и Кнуп, К. Дж. (2007). Серия случаев, описывающих термическую травму в результате использования цеолита для остановки кровотечения в боевых действиях. Неотложная догоспитальная помощь, 11 (1), 67–71. DOI: 10.1080 / 10

Пусатери, А. Э., Маккарти, С.Дж., Грегори, К. В., Харрис, Р. А., Карденас, Л., Макманус, А. Т., и Гудвин, К. У. мл. (2003). Влияние гемостатической повязки на основе хитозана на кровопотерю и выживаемость на модели тяжелого венозного кровотечения и повреждения печени у свиней. Журнал травм, 54 (1), 177-182.

Ралл, Дж. М., Кокс, Дж. М., Сонгер, А. Г., Комо, Дж. А., Эстеп, С., Сестеро, Р. Ф. и Росс, Дж. Д. (2012). Сравнение новых гемостатических марлей и Quickclot Combat Gauze в стандартизированной модели неконтролируемого кровотечения у свиней (технический отчет No.TR-2012-22). Сан-Антонио, Техас: Военно-морское медицинское исследовательское подразделение

Ри, П., Браун, К., Мартин, М., Салим, А., Плюрад, Д., Грин, Д., Чемберс, Л., Деметриадес, Д., Велмахос, Г., и Алам, Х. . (2008). Использование QuikClot при травмах для остановки кровотечения: серия случаев из 103 задокументированных случаев использования. Журнал травм-травм, инфекций и интенсивной терапии, 64 (4), 1093–1099. DOI: 10.1097 / TA.0b013e31812f6dbc

Уорд, К.Р., Тиба, Х., Холберт, В. Х., Блохер, К. Р., Драукер, Г. Т., Проффит, Э. К., Боулин, Г. Л., Иватери, Р. Р., и Дигельманн, Р. Ф. (2007). Сравнение нового кровоостанавливающего средства с существующими боевыми кровоостанавливающими средствами на модели летального артериального кровоизлияния в конечность у свиней. Журнал Trauma-Injury Infection & Critical Care, 2007; 63 (2), 276-284. DOI: 10.1097 / TA.0b013e3180eea8a5

Райт, Дж. К., Калнс, Дж., Вольф, Э. А., Трэвик, Ф., Шварц, С., Леффлер, К. К., Снайдер, В., Янтис, Л. Д. мл., И Эггерс, Дж. (2004). Термическое повреждение в результате применения гранулированного минерального кровоостанавливающего средства. Журнал травм, травм, инфекций и интенсивной терапии, 57 (2), 224–230. DOI: 10.1097 / 01.TA.0000105916.30158.06