Чтобы определить частоту иммунных клеток в более поздние моменты времени, мы инфицировали мышей несколько меньшей дозой паразитов, чтобы облегчить выживание до хронической стадии инфекции (> 28 дней), и измерили уровни моноцитов в крови и головном мозге на 10, 15, и 38 точек на дюйм.Хотя частота моноцитов Ly6C ^hi и Ly6C ^lo в крови была относительно низкой в ​​эти моменты времени (составляя менее 1% клеток CD45 ⁺ ) (рис. 2 A ), оба подмножества моноцитов были значительно увеличены в ЦНС, особенно при 15 dpi (32,8 ± 4,99% Ly6C ^hi и 12,22 ± 1,88% Ly6C ^lo клеток в процентах от общего количества клеток CD45 ⁺ ) по сравнению с контрольными мышами (0,09 ± 0,02%). Ly6C ^привет и 0.31 ± 0,06% Ly6C ^lo ) (рис.2 C ). При 10 и 15 dpi частота Т-клеток увеличивалась в 1,5 и 1,8 раза в крови инфицированных мышей по сравнению с контрольными мышами (Рис.2 B и SI Приложение , Таблица S1), а Т-клетки обнаруживались в гомогенатах головного мозга. на 15 dpi и сохранялась при 38 dpi (Рис. 2 D и SI Приложение , Таблица S2). Эти данные согласуются с предшествующей литературой, демонстрирующей важность привлечения Т-клеток в ЦНС для контроля хронического T.gondii (18). TNF-α и IFN-γ были увеличены в 14- и 1895 раз при 10 dpi, после чего последовало снижение при 15 и 38 dpi (рис. 2 E ). Напротив, уровни CCL2 в сыворотке были сходными у контрольных мышей и мышей, инфицированных T. gondii , в эти моменты времени. Эти данные показали, что обе популяции моноцитов надежно рекрутировались в ЦНС на 15 dpi.

Моноциты надежно рекрутируются в мозг во время перехода от острой инфекции к хронической.Мышей C57BL / 6J инфицировали внутрибрюшинно 200 типом II T. gondii или вводили PBS в качестве контроля и анализировали на наличие иммунных клеток в крови и головном мозге с помощью проточной цитометрии. Использовались стратегии последовательного стробирования, показанные на рис. 1. ( A и C ) Частоты моноцитов Ly6C ^hi или Ly6C ^lo в крови ( A ) или гомогенатах головного мозга ( C ) при 10, 15 и 38 dpi. ( B и D ) Доминирующие субпопуляции иммунных клеток в крови ( B ) или гомогенатах головного мозга ( D ).( E ) Уровни цитокинов CCL2, TNF-α и IFN-γ в сыворотке, измеренные с помощью мультиплексного анализа. Пунктирная линия указывает предел обнаружения. Каждая точка данных представляет собой одну мышь. n = от 4 до 7 мышей в группе от 2 до 3 независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001; Значимость рассчитывалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. Планки погрешностей представляют SEM.

Затем мы определили, совпала ли инфильтрация моноцитов по времени с прибытием T.gondii в головном мозге. Бремя паразитов в ЦНС оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием конститутивного GFP, экспрессируемого паразитом. Путем стробирования событий GFP ⁺ в гомогенатах мозга инфицированных мышей (рис. 3 A ) мы обнаружили низкие, но обнаруживаемые уровни T. gondii в ЦНС, которые достигли пика при 15 dpi (457 ± 85 паразитов). -инфицированных клеток на головной мозг) и сохранялись во время хронической инфекции (211 ± 74 инфицированных паразитами клеток на головной мозг) (рис. 3 B ). Мы также исследовали срезы мозга контрольных мышей и мышей с разрешением 15 и 38 точек на дюйм с помощью конфокальной микроскопии.GFP ⁺ T. gondii присутствовали в головном мозге с разрешением 15 dpi (фиг. 3 C ). Кроме того, в срезах мозга хронически инфицированных мышей с разрешением 38 dpi мы обнаружили брадизоиты GFP ⁺ на хронической стадии внутри кист, что было подтверждено с помощью антител против белка стенки кисты CST-1 (рис. 3 C ). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что T. gondii были обнаружены в ЦНС в течение того же периода времени, что и рекрутирование моноцитов в ЦНС.

T. gondii попадают в мозг и обнаруживаются при хронической инфекции. Мышей C57BL / 6J инфицировали паразитами T. gondii , экспрессирующими GFP II типа, или вводили PBS в качестве контроля. ( A и B ) Гомогенаты головного мозга анализировали с помощью проточной цитометрии и наносили на график общее количество клеток GFP ⁺ ( инфицированных T. gondii- ). n = от 5 до 9 мышей в группе от 2 до 3 независимых экспериментов. * P <0.05, *** P <0,001; Значимость рассчитывалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. Планки погрешностей представляют SEM. ( C ) Репрезентативная конфокальная микроскопия срезов мозга мышей с разрешением 15 и 38 точек на дюйм. Срезы окрашивали Hoechst для выявления ядер и антител против CST-1 для стенки цисты T. gondii . (Шкала, 25 мкм.)

Моноциты накапливаются в ГЭБ перед трансмиграцией в паренхиму у

В дополнение к экспрессии Ly6C субпопуляции моноцитов у мышей можно идентифицировать по их дифференциальной экспрессии хемокиновых рецепторов CX3CR1 и CCR2. Воспалительные моноциты Ly6C ^hi — это CCR2 ^hi CX3CR1 ^lo , тогда как патрулирующие моноциты Ly6C ^lo — CCR2 ^lo CX3CR1 ^hi . Чтобы оценить локализацию иммунных инфильтрирующих клеток в ЦНС, мы проанализировали мышей CCR2 ^{RFP / +} CX3CR1 ^{GFP / +} (25) во время T.gondii инфекция. Инфекция низкими дозами этих репортерных мышей показала, что они имели такую ​​же потерю веса ( SI, приложение , фиг. S1 A ) и выживаемость ( SI, приложение , фиг. S1 B ), как и мыши дикого типа (WT). мышей. Чтобы подтвердить, что репортерные мыши экспрессировали флуоресцентные репортеры в целевых популяциях моноцитов, мы собрали клетки крови у остро инфицированных мышей CCR2 ^{RFP / +} CX3CR1 ^{GFP / +} и оценили их экспрессию RFP и GFP с помощью проточной цитометрии Amnis imaging.Как и ожидалось, клетки CD11b ⁺ Ly6C ^lo экспрессировали цитозольный GFP, что указывает на экспрессию CX3CR1, а клетки CD11b ⁺ Ly6C ^hi экспрессировали цитозольный RFP, указывая на экспрессию CCR2 (фиг. 4 A ). Использование этих мышей также подтвердило, что описанная выше стратегия гейтинга действительно различает 2 сообщенных субнабора моноцитов в мозге мышей. Наконец, мы определили, что как воспалительные, так и патрулирующие субпопуляции моноцитов были задействованы в ЦНС на 15 dpi у репортерных мышей (рис.4 B ), как и у мышей WT (рис.2 C ).

Каскад адгезии лейкоцитов хорошо изучен на периферии, и скоординированная регуляция молекул клеточной адгезии опосредует рекрутирование моноцитов и диапедез в тканях (27).Напротив, меньше известно о динамике рекрутирования миелоидных клеток в закрытой ткани, такой как мозг, и особенно в ответ на инфекцию в ЦНС. Мы исследовали динамику этого процесса с помощью 2-фотонной прижизненной микроскопии на ГЭБ. С этой целью у мышей CCR2 ^{RFP / +} были установлены черепные окна, что позволило многократно визуализировать моноциты внутри и за пределами кровеносных сосудов головного мозга в одном и том же поле зрения в течение нескольких дней после заражения.Мышей инфицировали T. gondii или вводили PBS в качестве контроля носителя, и визуализацию выполняли на 50-100 мкм ниже поверхности менингеальной оболочки каждые 3-4 дня между 0 и 21 днем ​​постинфекции (фиг. 5 A ). Чтобы записать полный спектр подвижности моноцитов в сосудистой сети, мы выполнили покадровую визуализацию с высокой частотой кадров (40 кадров в секунду), чтобы запечатлеть клетки, движущиеся со скоростью кровотока в кровеносных сосудах и с более низкой частотой кадров (4 кадра в секунду). второй) в виде стека размером 25 мкм z для улавливания более медленной подвижности при качении и ползании.Используя эту стратегию, мы наблюдали клетки CCR2-RFP, движущиеся внутри кровеносных сосудов и демонстрирующие классически определенные режимы подвижности, идентифицированные на периферии, включая перекатывание, ползание и свободное движение (рис. 5 B и Movies S1 и S2). Визуализацию каждой мыши проводили в одном и том же поле зрения в течение последовательных дней, и клетки отслеживали кадр за кадром, чтобы оценить среднюю скорость перемещения отдельных клеток в каждый момент времени. Большинство клеток демонстрировали очень быстрое движение (> 200 мкм / с) у контрольных мышей и при 0 и 4 dpi у T.gondii- инфицированных мышей (фиг. 5 C ). При разрешении 8 dpi более медленно движущаяся популяция клеток была обнаружена конкретно у инфицированных мышей со средней скоростью от 30 до 100 мкм / с (рис. 5 C ). Между 8 и 21 dpi моноциты у мышей, инфицированных T. gondii , продолжали снижать общую скорость, чего не наблюдалось у контрольных мышей (фиг. 5 D ).

Скорость моноцитов при ГЭБ снижается во время инфекции. CCR2 ^{RFP / +} мышей инфицировали T.gondii или PBS в качестве контроля и визуализируется с помощью 2-фотонной микроскопии через окна черепа с разрешением 0, 4, 8, 12, 15, 18 и 21 dpi для отслеживания движения клеток CCR2-RFP. Визуализацию проводили, возвращаясь к одному и тому же полю зрения у каждой мыши каждый день. ( A ) Показан экспериментальный план. ( B ) Репрезентативная покадровая визуализация клеток CCR2-RFP в сосудах и паренхиме головного мозга с разрешением 4 и 15 точек на дюйм. Сигнал RFP в каждом кадре был окрашен в ложный цвет, и объединенное изображение показано справа. Трек 1 моноцита с разрешением 4 dpi показан белой пунктирной линией.(Масштабная шкала, 50 мкм.) ( C ) Распределение скоростей клеток CCR2-RFP из анализа отслеживания клеток мышей, которым инъецировали PBS, или мышей, инфицированных T. gondii-, от 0 до 21 dpi. ( D ) Скорости клеток CCR2-RFP от мышей, инфицированных PBS или T. gondii , от 0 до 21 dpi. Для C и D , n _PBS > 2000 клеток от 2 до 3 мышей на момент времени, от 4 до 5 FOV на мышь. n _{T. gondii} > 2000 клеток от 3 до 5 мышей на момент времени, от 4 до 5 FOV на мышь. Планки погрешностей представляют ± SEM на поле. * P <0,05, **** P <0,0001; Значимость рассчитывалась с помощью двустороннего теста t между группами PBS и T. gondii в каждый момент времени. Значимость во времени рассчитывалась путем сравнения наклона кривых для мышей, инфицированных PBS и T. gondii- , от 0 до 21 dpi, как определено линейной регрессией, и выполнения теста Стьюдента t для сравнения двух групп. .

Мы предположили, что популяция медленно движущихся моноцитов указывает на увеличение частоты вращения и ползания подвижности в популяции.Чтобы изучить эту возможность, мы проанализировали каждый отслеживаемый моноцит, разделив клетки на разные режимы подвижности, аналогично предыдущим исследованиям подвижности нейтрофилов (28–30). Мы обнаружили, что процент клеток, демонстрирующих подвижную подвижность, оставался неизменным между контрольными мышами и мышами, инфицированными T. gondii , вплоть до 8 dpi, после чего мы наблюдали резкое увеличение доли подвижных клеток и соответствующее уменьшение свободно текущих. клетки у инфицированных мышей (фиг. 6 A ).Эти данные согласуются с более медленной популяцией, которую мы наблюдали при анализе средней скорости, и которая была очевидна, начиная с 8 dpi (Рис. 5 C ). Увеличенная популяция катящихся клеток сохранялась с 8 до 18 точек на дюйм у инфицированных мышей (фиг. 6 A ). Мы также наблюдали заметное накопление неподвижных или очень медленно движущихся моноцитов в некоторых сосудах с течением времени у инфицированных T. gondii- мышей. В результате плотно упакованных клеток CCR2-RFP внутри этих сосудов, отдельные ползучие или неподвижные клетки было трудно отличить друг от друга и количественно оценить.Чтобы исследовать степень накопления моноцитов, вместо этого количественно оценивали площадь кровеносных сосудов, покрытых клетками CCR2-RFP. Как эндогенная аутофлуоресценция, так и внутривенная инъекция альбумина-AF-488 использовались для выделения кровеносных сосудов от паренхимы головного мозга (рис. 6 B ), и был рассчитан процент площади сосуда или паренхимы, покрытой сигналом RFP. Этот анализ выявил резкое накопление клеток CCR2-RFP в сосудах инфицированных мышей, начиная с 15 dpi и заканчивая 21 dpi (рис.6 C ), что согласуется с предыдущим анализом фиксированных срезов ткани (рис. 4 C ). Напротив, накопление моноцитов в паренхиме мозга инфицированных мышей не достигло статистического обнаружения по сравнению с контрольными мышами до 21 dpi, что свидетельствует о задержке между клеточной адгезией в BBB и экстравазацией в мозг. Интересно, что мы не наблюдали GFP ⁺ T. gondii в пределах нашего поля зрения визуализации, вероятно, из-за относительно низкой нагрузки паразитов в мозге мышей, инфицированных внутрибрюшинно только 200 T.gondii . Мы подтвердили, что действительно можем обнаружить паразитов GFP ⁺ с помощью 2-фотонной микроскопии, используя наши настройки визуализации, путем визуализации мышей сразу после внутривенного заражения высокой дозой паразитов GFP ⁺ ( SI, приложение , рис. S5). В совокупности эти данные демонстрируют значительное рекрутирование моноцитов в ЦНС в течение 2 недель после заражения T. gondii и даже в регионах, где паразиты не были обнаружены сразу.

Инфекция увеличивает скручивание, ползание и адгезию моноцитов в ГЭБ.( A ) Подвижность отдельных отслеживаемых моноцитов классифицировали на основе скорости и представляли как долю всех моноцитов. n _PBS > 2000 клеток от 2 до 3 мышей на момент времени, от 4 до 5 FOV на мышь. n _{T. gondii} > 2000 клеток от 3 до 5 мышей на момент времени, от 4 до 5 FOV на мышь. ( B ) Типичное накопление клеток CCR2-RFP с наложенными следами сосудов (пунктирные линии) на основании аутофлуоресценции ткани или внутривенной инъекции Alexa Fluor (AF) 488-альбумина.(Масштабные линейки, 100 мкм.) ( C ) Накопление в сосуде количественно определялось как площадь, покрытая сигналом флуоресценции CCR2-RFP по всей площади, внутри и за пределами границ сосуда ( n = от 3 до 4 мышей на условие на момент времени с 3 FOV на мышь). * P <0,05, **** P <0,0001; Значимость рассчитывалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Сидека.

Инфильтрация моноцитов пространственно коррелирована с участками заражения

Одним из ограничений 2-фотонной визуализации является ограничение размера окна визуализации, которое позволяет визуализировать только небольшую часть коры головного мозга и может не отражать плотность паразитов или иммунную инфильтрацию в мозг в целом. Чтобы снизить уровень паразитарной инфекции и инфильтрации моноцитов по всему мозгу, мы заразили мышей CCR2 ^{RFP / +} GFP-экспрессирующими T. gondii и подготовили мозг для объемной световой визуализации, которая позволяет визуализировать весь мозг в 3D. локализации моноцитов.Интактный мозг собирали с разрешением 15 dpi и окрашивали антителами против RFP и GFP для мечения моноцитов CCR2-RFP или GFP ⁺ T. gondii соответственно. Мозг мышей, которым вводили PBS, использовали для контроля неспецифического окрашивания анти-RFP или анти-GFP антител во время обработки ткани. Инъекция ЛПС отдельной когорте мышей использовалась в качестве дополнительного контроля, как подробно описано ниже.

Мозг визуализировали оптически прозрачным с помощью iDISCO ⁺ и отображали с субмикронным разрешением с помощью LSFM (31).Автофлуоресценция ткани в канале GFP была использована для определения структуры ткани головного мозга (рис. 7 A , Top ). Сигнал RFP, соответствующий морфологии моноцитов, наблюдался у всех инфицированных T. gondii- мышей, тогда как у контрольных мышей PBS не было специфического сигнала RFP (фиг. 7 A , Middle ). Был разработан и утвержден автоматизированный конвейер машинного обучения ( SI, приложение , рис. S6) для сегментации и количественной оценки отдельных моноцитов, каждый из которых обозначен уникальным цветом (нижний ряд на рис.7 A и B и рис.7 C ). У мышей, инфицированных T. gondii-, мы обнаружили скопления горячих точек моноцитов, распределенных по всему мозгу, по сравнению с более диффузным общим набором моноцитов в мозге мышей, получавших LPS (Рис. 7 A , Middle и SI Приложение , рис. S7).

моноцитов пространственно коррелируют с кластерами T. gondii . Мозг мышей CCR2 ^{RFP / +} , которым вводили PBS, T.gondii или LPS были оптически очищены с использованием iDISCO ⁺ и визуализированы с помощью световой микроскопии. ( A ) Показаны репрезентативные оптические срезы автофлуоресценции GFP, GFP ⁺ T. gondii , моноциты CCR2-RFP и сегментированные (индивидуально помеченные) клетки CCR2-RFP. Регулировка контрастности была согласована между мозгами. ( B ) GFP ⁺ Сегментация клеток T. gondii и CCR2-RFP показывает скопления паразитов и отдельные моноциты (каждый из которых обозначен другим цветом).(Масштабные полосы, 100 мкм.) ( C ) Увеличенное изображение панели CCR2-RFP в B , с белыми стрелками, указывающими индивидуальные ячейки, определенные алгоритмом сегментации. (Масштабные полосы, 50 мкм. ) ( D ) Расстояние моноцитов от каждого кластера T. gondii измеряли в трехмерном пространстве, как показано. ( E ) Общемозговой анализ расстояния моноцитов от кластеров T. gondii (красный). Моноциты, обнаруженные в кластере T. gondii , находятся на расстоянии 0.Моноциты перемешивали случайным образом и определяли расстояния от случайно распределенных моноцитов до кластеров T. gondii (серый цвет). P <10 ⁻⁷ , критерий Колмогорова-Смирнова. ( F ) Показан процент моноцитов на определенных расстояниях от кластеров T. gondii . Планки погрешностей представляют SEM. n _PBS = 5 мышей, n _{T. gondii} = 5 мышей.

Чтобы оценить, было ли накопление моноцитов пространственно коррелированным с T.gondii , мы идентифицировали кластеры сигнала GFP ⁺ , совместно локализующегося с сигналом антитела против GFP, которое использовали для окрашивания интактного мозга. Эти кластеры также были сегментированы с помощью специального конвейера анализа (Рис.7 B , Top ), и расстояние от каждого моноцита до ближайшего кластера T. gondii было измерено в 3D (Рис.7 D ) . Интересно, что инфильтрация моноцитов была значительно увеличена около кластеров T. gondii , причем> 50% моноцитов было обнаружено в пределах 300 мкм кластеров GFP ⁺ (рис.7 E и F , красные линии) и> 20% моноцитов в пределах 75 мкм кластеров T. gondii . Чтобы оценить, было ли это пространственное соотношение неслучайным, все моноциты в каждом мозге были случайным образом перемешаны и перераспределены по мозгу, а анализ расстояния был повторен (рис. 7 E и F , серые линии). На основании этого перемешивающего анализа моноциты, случайно распределенные в головном мозге, были расположены значительно дальше от кластеров GFP ⁺ , причем <30% моноцитов находились в пределах 300 мкм от T. gondii и <7,5% моноцитов в пределах 75 мкм. Эти данные показывают, что существует очень значимая пространственная взаимосвязь между моноцитами и участками инфекции T. gondii в головном мозге, что, вероятно, не является случайным событием.

Анализ всего мозга выявляет региональную специфику локализации моноцитов.

Учитывая фокальную природу инфильтрации моноцитов CCR2-RFP в головной мозг, вызванной T. gondii-, мы затем спросили, рекрутируются ли моноциты в определенные области мозга во время T.gondii инфекция. Для этого данные сегментации моноцитов из мозга контрольных мышей PBS или мышей, инфицированных T. gondii , были согласованы с помощью вычислений с аннотированным справочным атласом мозга Института Аллена (32). Картина инфильтрации моноцитов в масштабах всего мозга оценивалась с использованием обновленной версии ClearMap (31) для количественной оценки распределения клеток в регионах, обозначенных справочным атласом Аллена (32). Затем были созданы трехмерные тепловые карты плотности моноцитов для каждых T.gondii- инфицированный мозг мыши ( SI, приложение , рис. S7 и фильм S3). Средняя тепловая карта плотности моноцитов показана вместе с контрольной аннотацией в 2 различных сагиттальных срезах головного мозга (рис. 8, A, и Movie S3) (31).

Локализация моноцитов в головном мозге во время инфекции T. gondii и воспаления, вызванного ЛПС. Сигнал моноцитов от мозга мышей CCR2 ^{RFP / +} регионализировали путем сопоставления с эталонным атласом мыши (Allen Brain Institute).( A ) Ссылочная аннотация Allen показана с выделенными CA (рог Аммона) и OT (обонятельный бугорок) ( Left ). Тепловые карты средней плотности распределения моноцитов на 2 различных сагиттальных срезах были построены с использованием всего мозга мышей, инфицированных T. gondii-, и мышей, которым инъецировали ЛПС ( справа, ). Тепловые карты нормализованы до максимальной плотности в каждом мозге. ( B ) Плотность моноцитов CCR2-RFP по областям мозга в аннотированном справочном атласе Аллена.Черная линия указывает среднее значение в случайном порядке, а соответствующее SD — бледно-голубое. Показаны области со значительно уменьшенной (синие полосы) или повышенной (коричневая полоса) инфильтрацией моноцитов по сравнению с перетасовкой. Планки погрешностей отражают SD. ( C ) Общую плотность моноцитов на 25 мкм площади ³ рассчитывали для мышей, инфицированных T. gondii и которым инъецировали ЛПС. ( D ) Сравнивали регионализированную плотность моноцитов между мышами, инфицированными T. gondii и инъецированными LPS, без (, ) и с (, ) нормализации общей плотности моноцитов в головном мозге.( E ) Показаны области мозга, обогащенные моноцитами у мышей с инъекцией LPS или T. gondii (после коррекции общей плотности мозга моноцитов) и их значения P . Использовалась параметрическая статистика с последующей поправкой Бенджамини – Хохберга на частоту ложных открытий (0,1) ( B , D и E ). Тест Уэлча t был использован для ( C ). ** P <0,005. n _{T. gondii} = 5 мышей и n _LPS = 4 мыши.

Чтобы определить, локализованы ли инфильтрирующие моноциты в определенных областях мозга, мы сравнили плотность моноцитов в каждой области мозга мышей, инфицированных T. gondii-, с оценкой ожидаемой дисперсии по регионам. Средняя плотность моноцитов в каждой области после анализа перетасовки показана черной линией на фиг. 8 B . Анализируя всего 692 области мозга из аннотированного справочного атласа Аллена (32), было обнаружено, что 68 областей недостаточно представлены моноцитами по сравнению с анализом случайного перемешивания ( SI Приложение , Таблица S4).Поскольку многие из этих областей представляют собой корковые слои и подразделения более крупных функциональных областей, отдельные корковые слои и области, дифференцированные по анатомическому расположению (например, передний / задний), были свернуты для визуализации (рис.8 B , синие полосы). Обонятельный бугорок был единственной областью, в которой наблюдалось значительное увеличение обнаружения моноцитов CCR2-RFP у мышей, инфицированных T. gondii (фиг. 8 B , коричневая полоса), по сравнению с анализом перемешивания.

Затем мы исследовали, было ли обогащение моноцитов в обонятельном бугорке специфическим для инфекции T. gondii или также наблюдалось в ответ на общий воспалительный стимул. Чтобы ответить на этот вопрос, мы вводили LPS, компонент грамотрицательных бактерий и мощный индуктор активации Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), мышам и исследовали инфильтрацию моноцитов в мозг. ЛПС вводили внутрибрюшинно мышам CCR2 ^{RFP / +} при t = 0, 24 и 48 часов.Мозг собирали при t = 72 часа, иммуноокрашивали и оптически очищали так же, как мозг контрольных мышей PBS и мышей, инфицированных T. gondii . Затем алгоритм сегментации клеток был использован для идентификации отдельных моноцитов в головном мозге мышей, которым вводили LPS (рис. 7 A , снизу ), и показана средняя тепловая карта плотности моноцитов (рис. 8 A ). Примечательно, что степень инфильтрации моноцитов в мозге T. gondii -инфицированных по сравнению с мозгом, которому инъецировали LPS, значительно различалась: T.gondii , индуцируя более чем в 5 раз большее рекрутирование моноцитов в мозг, чем лечение LPS (фиг. 8 B ).

Интересно, что в мозге мышей, получавших ЛПС, не было выявлено областей, в которых наблюдалось бы избыток или недостаток моноцитов по сравнению с анализом перетасовки, что указывает на то, что ЛПС не индуцировал регионально-специфическую инфильтрацию моноцитов в мозг. При сравнении распределения моноцитов в головном мозге мышей, инфицированных T. gondii-, и мышей, которым вводили ЛПС, мы обнаружили, что в 304 областях мозга не было статистически значимой разницы в количестве моноцитов, рекрутированных в ответ на каждый стимул (рис. .8 D , верхний ). Было 388 областей, в которых T. gondii индуцировал статистически большую инфильтрацию моноцитов, чем LPS, и 0 областей, в которых обработка LPS индуцировала статистически больше моноцитов, чем T. gondii (фиг. 8 D , Upper ). Эти данные могут отражать большую разницу в количестве моноцитов в головном мозге между двумя видами лечения (рис. 8 C ). Чтобы учесть эту возможность, мы нормализовали плотность моноцитов в каждой области мозга к общей плотности на мозг в каждом состоянии.После выполнения этой коррекции было 6 регионов, в которых T. gondii индуцировал преимущественное накопление моноцитов по сравнению с мышами, получавшими LPS, тогда как 159 регионов были уникальными для лечения LPS (Рис.8 D и E и SI Приложение , таблица S5).

Эти данные показывают, что ЛПС индуцировал диффузное рекрутирование моноцитов в головном мозге, тогда как инфекция T. gondii приводила к высоко региональной инфильтрации моноцитов. В частности, обонятельный бугорок возник не только как область, в которой моноциты были чрезмерно представлены в T.gondii -инфицированных мышей по сравнению с анализом перетасовки (фиг. 8 B ), но также как область, специфичная для инфекции T. gondii , по сравнению с обработкой LPS (фиг. 8 E ). Другие области мозга, участвующие в разнообразном наборе функций, также были чрезмерно представлены в распределении моноцитов у инфицированных T. gondii- мышей по сравнению с инъекцией LPS (рис. 8, E и SI, приложение , таблица S5). Взятые вместе, эти данные показывают ранее недооцененную и высокоспецифичную региональную локализацию моноцитов во время первоначального рекрутирования этих клеток в ЦНС в ответ на паразитарную инфекцию и не распространяются на воспаление ЦНС.

Обсуждение

Инфекция T. gondii представляет собой убедительную модель для исследования рекрутирования воспалительных иммунных клеток в ЦНС, как во время начального нейроинвазии патогенов, так и во время хронической стадии заболевания, когда паразиты инкапсулируются в нейронах головного мозга. . Мыши являются естественным хозяином для T. gondii , и выживание после острой стадии инфекции зависит от интактного врожденного иммунного ответа с участием миелоидных клеток, а также от устойчивого адаптивного иммунитета (33).Предыдущая работа показала существенную роль CCR2 ⁺ Ly6C ^hi моноцитов в защите хозяина во время острой инфекции в периферических участках (20–22, 34) и в ЦНС во время хронической стадии инфекции (23). Здесь мы представляем подробный анализ динамического набора моноцитов в ЦНС во время инфекции T. gondii , уделяя особое внимание кинетике и локализации клеток во время этого процесса.

Моноциты проникают в ЦНС во время многих нейровоспалительных состояний, включая вирусные инфекции и аутоиммунные заболевания, и их роль в защите или патологии варьируется в зависимости от заболевания.Во время инфицирования вирусом Западного Нила истощение периферийных моноцитов препятствует их проникновению в ЦНС и увеличивает выживаемость мышей (35). В модели экспериментальной церебральной малярии (ЕСМ) на мышах моноциты прилипают и накапливаются в больших количествах в сосудах головного мозга и участвуют в удалении паразитированных эритроцитов (pRBC) (36). Также было показано, что в модели ЕСМ мыши с наибольшим накоплением стационарных моноцитов в сосудах головного мозга страдают наиболее тяжелыми неврологическими симптомами заболевания (37).Моноциты также могут способствовать перекрестному взаимодействию с Т-клетками CD8 ⁺ на ГЭБ и усиливать инфильтрацию Т-лимфоцитами ЦНС (37). В ECM накопленные CD8 ⁺ T-клетки совместно локализуются с pRBC, что приводит к утечке из сосудов (38). Во время заражения T. gondii наши данные 2-фотонной и световой микроскопии выявили сосуды со значительной адгезией моноцитов у мышей без явных клинических признаков заболевания. Одна интересная возможность заключается в том, что накопленные моноциты наблюдаются у T.gondii -инфицированные мыши могут аналогичным образом связываться с Т-клетками или способствовать проникновению Т-клеток в ЦНС, потенциально способствуя нейрозащитному эффекту моноцитов во время инфекции T. gondii .

Хотя инфекция T. gondii в основном протекает бессимптомно, интригует тот факт, что в области мозга было обнаружено обогащение моноцитов, связанное с поведенческими изменениями, наблюдаемыми у мышей во время заражения T. gondii , что не было обнаружено в LPS- индуцированное воспаление.Обонятельный бугорок получает прямой сигнал от обонятельной луковицы и играет ключевую роль в поведении, определяемом запахом. Грызуны, хронически инфицированные T. gondii , теряют врожденное отвращение к кошачьему запаху и вместо этого их привлекает запах (39). Этот эффект может быть усилен некоторыми штаммами паразита (40). Хотя T. gondii бесполым образом реплицируется у большинства организмов, кошки служат окончательным хозяином для T. gondii , поддерживая генетическую рекомбинацию паразита.Уменьшение страха перед кошачьей мочой у грызунов, инфицированных T. gondii , было предложено в качестве доказательства в поддержку гипотезы поведенческой манипуляции (39). Способствует ли инфильтрация моноцитов или других иммунных клеток обонятельному бугорку потере реакции страха у кошек, еще предстоит определить, и это будет интересным направлением будущих исследований. Примечательно, однако, что потеря врожденного отвращения к запахам кошачьей мочи сохраняется даже после того, как размножение паразитов и воспаление в головном мозге стихают (41).

T. gondii проникает в мозг путем нарушения ГЭБ (42), и для длительного выживания мышей с хронической инфекцией T. gondii требуется устойчивый адаптивный иммунный ответ, в значительной степени опосредованный CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток в ЦНС (18). Реактивация спящих паразитов в отсутствие Т-клеток может привести к повреждению ткани ЦНС, поскольку паразиты быстро размножаются внутри и лизируются из чувствительных клеток. Продукция IFN-γ, перфорина и прямой цитотоксический лизис клеток, несущих паразитов, могут вносить вклад в опосредованную Т-клетками защиту (43–45).Раннее привлечение Т-клеток, по-видимому, опосредуется, по крайней мере частично, хемокинами, такими как CXCL9, в дополнение к экспрессии VCAM-1 активированными эндотелиальными клетками (46–48). Сигналы CXCL10 в мозге хронически инфицированных мышей также необходимы для поддержания антиген-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток в головном мозге (49). Интересно, что прижизненная визуализация Т-клеток в головном мозге во время хронической инфекции показывает, что Т-клетки приближаются к очагам размножающихся паразитов, но не обнаруживают явного контакта с кистами или несущими цисты клетками (50).Мы наблюдали большинство моноцитов в пределах 300 мкм кластеров T. gondii в головном мозге, предполагая, что моноциты могут быть рекрутированы посредством процесса, индуцированного паразитами, такого как клеточное повреждение или высвобождение цитокинов из инфицированных клеток.

Примечательно, что моноциты также были обнаружены в регионах, удаленных от паразитов. Эти регионы могут отражать районы, в которых в какой-то момент во время инфекции существовало T. gondii , но они были либо очищены антимикробными механизмами, либо мигрировали.Действительно, хорошо задокументировано, что паразиты взаимодействуют со значительно большим процентом резидентных клеток мозга, чем те, которые они заражают (51). Из-за относительно небольшого количества кластеров T. gondii мы не смогли точно определить региональные тенденции для локализации паразитов. Однако этот региональный анализ всего мозга может быть более целесообразным для изучения клеток мозга, с которыми паразиты взаимодействовали, но не обязательно вторгались, поскольку этих взаимодействующих с паразитами клеток гораздо больше, чем одних паразитов (52).Действительно, нейроны, с которыми взаимодействовали паразиты, по-видимому, обогащены изокортексом и полосатым телом (53). Наконец, могут быть и другие, пока еще не определенные сигналы, которые вызывают инфильтрацию моноцитов в мозг как следствие инфекции T. gondii , но не как прямой ответ на вторжение паразитов.

В хронических моделях T. gondii , моноциты Ly6C ^hi , инфильтрирующие ЦНС, не экспрессируют классические маркеры фагоцитарных клеток, такие как TREM2 и F4 / 80 (23, 54), хотя было показано, что Ly6C ^{hi Клетки} могут дифференцироваться в более фагоцитарные клетки Ly6C ^lo с потенциалом вносить непосредственный вклад в очищение от паразитов (23, 55).Клетки Ly6C ^hi были обнаружены как в гиппокампе, так и в коре при хронической инфекции (23, 55). Кроме того, на мышиной модели болезни Альцгеймера хроническая инфекция T. gondii приводила к увеличению клиренса бляшкообразующего Aβ, результат, приписываемый фагоцитарному вкладу моноцитов Ly6C ^hi (54). Хроническая инфекция T. gondii также коррелировала со снижением потери памяти и увеличением выживаемости нейронов в отдельной модели болезни Альцгеймера (56).В моделях рассеянного склероза на мышах предполагается, что Т-клетки играют доминирующую роль в демиелинизации нейронов и обостряют клинические симптомы; однако также было показано, что моноциты инфильтрируют ЦНС и способствуют демиелинизации, поскольку дефицит CCR2 снижает рекрутирование моноцитов в ЦНС и приводит к умеренным улучшениям как в покрытии миелином, так и в клинической оценке (57).

В совокупности представленные здесь данные представляют собой исчерпывающий количественный анализ мобилизации моноцитов в кровь и в ЦНС во время инфекции.Эти данные демонстрируют накопление моноцитов на BBB и выявляют динамику подвижности моноцитов на BBB у мышей, проанализированных в продольном разрезе от острой до хронической инфекции T. gondii . Кроме того, мы сообщаем о глобальном трехмерном анализе локализации моноцитов в интактном мозге во время инфекции и воспаления, вызванного ЛПС. Этот анализ дает представление об активности моноцитов в ЦНС и открывает интересные возможности о региональной специфичности инфильтрации иммунными клетками ЦНС и функциональных поведенческих или патологических исходах во время инфекции.

Материалы и методы

Эксперименты на мышах.

Все процедуры и протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Калифорнийском университете в Ирвине. На протяжении всего исследования использовали самцов и самок мышей в возрасте от 2 до 4 месяцев. Подробная информация о линиях мышей и их разведении включена в SI Приложение . Мышей инфицировали T. gondii внутрибрюшинной инъекцией 200 или 1000 GFP-экспрессирующих тахизоитов типа II Prugniaud или ME49 в 200 мкл PBS.Тахизоиты были последовательно пассированы и сохранены в фибробластах крайней плоти человека, как описано ранее (58). Контрольным мышам PBS вводили равный объем внутрибрюшинной инъекции стерильного PBS (Corning). Мышам, получавшим LPS, внутрибрюшинно вводили 1 мг / кг LPS из Salmonella enterica Typhimurium (Sigma) ежедневно в течение 3 дней и умерщвляли через 24 часа после последней инъекции. При вскрытии мышей седативно вводили 2,5% трибромэтанола (Avertin; Sigma-Aldrich) и транскардиально перфузировали 30 мл 1 × PBS (Corning) для удаления циркулирующих клеток крови, что подтверждено очень низким уровнем обнаружения CD45 ^hi клеток крови в головном мозге. ложно инфицированных мышей (рис.1).

Проточная цитометрия.

Мозг обрабатывали до суспензий единичных клеток с использованием ферментативного расщепления с использованием Dispase II (Roche Applied Science), разведенного в физиологическом растворе, забуференном Hepes, с последующим удалением миелина с использованием градиента Percoll (GE Healthcare). Кровь удаляли посредством сердечной пункции в пробирки с антикоагулянтом с ЭДТА (Greiner Bio-one). Эритроциты лизировали с использованием буфера для лизиса ACK (Life Technologies). Клетки крови и мозга ресуспендировали в буфере для окрашивания (1 × PBS + 3% FBS) с 10% TrueStain FcX (Biolegend) для блокирования неспецифического связывания антител с рецепторами Fc.Поверхность клеток окрашивали непосредственно конъюгированными антителами ( SI Приложение , таблица S3) с последующей фиксацией в течение 15–30 минут в 2% параформальдегиде. Образцы анализировали на проточном цитометре NovoCyte (Acea), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar). Для визуализации проточной цитометрии клетки получали, как указано выше, но обрабатывали на проточном цитометре Amnis ImageStream X Mark II (EMD Millipore) и анализировали с использованием программного обеспечения IDEAS (EMD Millipore).

Иммунофлуоресцентная визуализация.

Мозги удаляли и помещали в 4% параформальдегид на 6-16 часов, замораживали в 30% сахарозе в PBS до тех пор, пока ткань не оседала, и помещали в среду для замораживания OCT (Thermo Fisher Scientific). Срезы толщиной 25 мкм хранили в криозащитной среде (30% сахарозы, 30% этиленгликоля, 0,1 М фосфатного буфера, 1% ПВП-40) при -20 ° C или -80 ° C. Подробности окрашивания антител можно найти в приложении SI . Конфокальную микроскопию выполняли на микроскопе Leica SP8 (Leica Microsystems).Изображения анализировали с помощью FIJI (59) или Imaris (Bitplane). Количественное определение микроглии и клеток RFP ⁺ описано в Приложении SI .

Двухфотонная визуализация.

Подробная процедура имплантации черепного окна приведена в Приложении SI . Флуоресценцию моноцитов через окна черепа регистрировали с помощью резонансного 2-фотонного микроскопа (Neurolabware) с использованием возбуждающего света от 780 до 800 нм (Mai Tai HP, Spectra-Physics) и иммерсионной линзы Nikon 16x (0.8 нет данных). Эмиссии фильтровали с использованием полосового фильтра BrightLine 510/84 и 607/70 нм (Semrock). Последовательности изображений были собраны с использованием программного обеспечения для сбора данных Scanbox (Scanbox) на глубине от 50 до 150 мкм ниже мозговых оболочек. Каждое поле записи было отображено дважды в каждый момент времени. Сначала использовалась электрически настраиваемая линза (Optotune) для одновременного изображения 5 плоскостей (685 × 682 мкм) на расстоянии ∼10 мкм друг от друга, каждая с частотой 4 Гц. Чтобы захватить быстро движущиеся моноциты, одна плоскость (900 × 448 мкм) была получена при 40 Гц.Скорость ячейки отслеживалась вручную с помощью программного обеспечения Imaris (Bitplane). Сосуды очерчивали с использованием аутофлуоресценции нативной ткани в канале GFP и инъекции в хвостовую вену 200 мкг альбумина-AF-488 в стерильном PBS (Invitrogen). Ослепление было сделано для экспериментов с 2-фотонной микроскопией и описано в Приложении SI .

Иммуноокрашивание и оптическая очистка всего тела.

Пять мышей CCR2 ^{RFP / +} , инфицированных внутрибрюшинно 200 паразитами PA7 и 5 контрольными мышами PBS, были убиты при 15 dpi.Кроме того, 4 мышам CCR2 ^{RFP / +} ежедневно внутрибрюшинно вводили 1 мг / кг LPS из S. enterica Typhimurium (Sigma) и убивали через 24 часа после последней инъекции. Всем мышам была проведена транскардиальная перфузия PBS и 4% параформальдегида. Мозг извлекали и помещали в 4% параформальдегид на 12–16 ч и промывали 3 раза в 1 × PBS по 1 ч каждый. Ткань головного мозга обрабатывалась протоколом iDISCO ⁺ (31) для иммуноокрашивания целиком и для придания ей оптической прозрачности.Стандартный протокол соблюдался со следующими отклонениями: 24-часовая инкубация в 30% MeOH / 66% DCM с последующими 2 промываниями в 100% метаноле в течение 1 часа каждая выполнялась непосредственно перед 5% H ₂ O ₂ инкубации. Перед инкубацией в растворе для повышения проницаемости образцы головного мозга разрезали на 2 части на 1 мм латеральнее средней линии. Часть, содержащую левое полушарие, использовали для последующей обработки. Ткань инкубировали с кроличьими анти-RFP (Rockland; 1: 400) и куриными анти-GFP (Aves; 1: 800) в 2-мл растворе в течение 4 дней.Для вторичной амплификации антител ткань инкубировали с козьими антителами против цыплят Alexa Fluor 647 (LifeTechnologies; 1: 400) и козьими антителами против кроликов Alexa Fluor 568 (LifeTechnologies; 1: 400) в 2 мл раствора в течение 4 дней.

Световая флуоресцентная визуализация.

Образцы, обработанные и иммуноокрашенные iDISCO ⁺ , были визуализированы в сагиттальной ориентации с использованием специальных держателей образцов и модифицированной камеры визуализации, предназначенной для размещения образцов всего мозга, визуализированных в ди-бензиловом эфире. Образцы были сфотографированы на Z.1 LSFM (Zeiss) с использованием осветительной оптики 5 × / 0,1NA и детекторной оптики 5 × / 0,16NA при 1,5-кратном оптическом увеличении. Возбуждение осуществлялось с помощью лазерных линий с длиной волны 488 нм и 638 нм, подключенных к эмиссионным фильтрам BP 505–545 и LP 660 соответственно. Мощность лазера и экспозиция были согласованы между образцами, и каждый канал отображался на отдельной дорожке, чтобы минимизировать перекрестные помехи. Освещение производилось только левой листовой оптикой. Разделение отдельных z -стек было выполнено вручную с помощью Vision4D (Arivis AG), а правильность размещения была проверена другим оценщиком.

Анализ сегментации клеток всего мозга.

Анализ проводился с использованием модифицированной версии ClearMap (31), которая была переоборудована для обработки больших наборов данных, созданных Z.1 LSFM. Подробное описание анализа и проверки классификатора сегментации ячеек приведено в Приложении SI .

GFP ⁺ T. gondii кластеров были идентифицированы у 5 инфицированных мышей CCR2 ^{RFP / +} с сегментированными моноцитами.Данные пропускались через средний фильтр 5 пикселей, затем подвергались скользящему вычитанию фона с радиусом 30 пикселей (60) и, наконец, преобразовывались в двоичную форму с порогом на 1 SD выше среднего значения изображения. Данные окончательного изображения были сегментированы для идентификации кластеров T. gondii . Кластеры размером менее 1000 пикселей были исключены. Сегментированные кластеры были преобразованы в справочный атлас Аллена (32), как описано, и воксели, содержащие кластеры, были назначены как принадлежащие кластеру. Для каждого сегментированного моноцита в эталонном координатном пространстве минимальное евклидово расстояние в вокселях до Тл.gondii был рассчитан и округлен до бина данных. Подсчитывали количество клеток с каждым округленным расстоянием. Ячейки внутри кластеров получили нулевое расстояние. Значения были умножены на 25 для перевода в кубические микрометры.

Статистические методы для всех анализов описаны в Приложении SI .

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лабораторий M.B.L., Теннера, Нельсона, Морриссетта, Андраде и Мессауди за полезное обсуждение этого проекта; ДокторАдиле Сайед за ее опыт в области визуализации; Д-р Туен Хоанг из отдела биостатистики, эпидемиологии и дизайна исследований Калифорнийского университета, Ирвинский институт клинических и трансляционных наук; Доктору Роберту Спитейлу и доктору Уитни Ингланд за статистические консультации; и д-р Ким Грин за помощь в количественном определении микроглии. Эта работа была поддержана NIH R01AI120846 (для M.B.L.), Американским онкологическим обществом 126688-RSG-14-202-01-MPC (для M.B.L.), NIH 5F30EY029596-02 (для R.A.), 5F31EY028046-03 для (D.X.F.V.), NIH T32GM008620 (для R.A. и E.M.H.) и NIH T32AI060573 (для C.A.S. и E.M.H.). Это исследование стало возможным отчасти благодаря доступу к Основному объекту оптической биологии Центра биологии развития, общему ресурсу, поддерживаемому грантом поддержки онкологического центра (CA-62203) и грантом Центра поддержки сложных биологических систем (GM-076516) по адресу: Калифорнийский университет в Ирвине.

Сноски

• Вклад авторов: C.A.S., D.X.F.V., R.A., S.P.G., и M.B.L. спланированное исследование; C.A.S., D.X.F.V., R.A., E.M.H., C.J.T., C.L. и O.V. проведенное исследование; Р.А. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; C.A.S., D.X.F.V., R.A., E.M.H. и M.B.L. проанализированные данные; и C.A.S., D.X.F.V., R.A., E.M.H., S.P.G. и M.B.L. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: код, связанный с этим документом, размещен на GitHub (https: // github.com / sunilgandhilab / brainquant3d).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1_{8116/-/DCSupplemental.}

% PDF-1.5 % 1 0 объект > / OCGs [7 0 R] >> / Страницы 2 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 32 0 объект > поток 2021-03-10T20: 19: 16-08: 002006-09-29T09: 19: 31 + 08: 002021-03-10T20: 19: 16-08: 00uuid: 943ca9f2-c799-4642-8c98-1fccaf5f5e6fuuid: 6286177b- 1dd2-11b2-0a00-1e00d842b5ffприложение / pdf конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 27 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2 36 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 22 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2> / T1_3> / T1_4 36 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 17 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2> / T1_3> / T1_4> / T1_5 36 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 12 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2> / T1_3 36 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 5 0 obj > / Font> / T1_1 36 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 33 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 45 0 объект [51 0 R 52 0 R 53 0 R 54 0 R 55 0 R] эндобдж 46 0 объект > поток q 540.05 0 0 68.6011963 35.9702911 675.3988037 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 85,56995 594,99988 тм (1988; 48: 4812-4816.) Tj / T1_1 1 Тс -5.55699 0 Тд (Рак Res \ 240) Tj / T1_0 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj 0 1.00001 TD (Дмитрий Флигер и Х. В. Л \ 366 мс Циглер-Хайтброк) Tj / T1_2 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс 18 0 0 18 30 635 тм (Аномальные моноциты крови при хроническом лимфоцитарном лейкозе) Tj ET 30 540 552 35 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120. 547.99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -7,55696 1 тд (Обновленная версия) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 141 539.99994 Тм (\ 240) Tj / T1_0 1 Тс 23.17895 1 тд () Tj 0 0 1 рг -23.17895 0 Тд (http://cancerres.aacrjournals.org/content/48/17/4812)Tj 0 г 0 1.00001 TD (См. Самую последнюю версию этой статьи по адресу:) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 519,99997 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 499,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 479,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET 30 365 552 115 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120. 447.99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -5.66901 1 тд (Оповещения по электронной почте) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 295,4996 460 тм (относится к этой статье или журналу.) Tj 0 0 1 рг -15.44996 0 Тд (Зарегистрируйтесь, чтобы получать бесплатные уведомления по электронной почте) Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120. 414.99994 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -6.38997 1 тд (Подписки) Tj 0,556 1,00001 тд (Отпечатки и) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 417,99994 тм (\ 240) Tj 13.46496 1 тд (.) Tj 0 0 1 рг -6.85098 0 Тд ([email protected]) Tj 0 г -6.61398 0 Тд (Отделение) Tj 0 1.00001 TD (Чтобы заказать перепечатку статьи или подписаться на журнал, свяжитесь с нами \ t Публикации AACR) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120. 392,99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -5.66901 1 тд (Разрешения) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 364,99988 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (Сайт Rightlink.) Tj 0 1.00001 TD (Нажмите «Запросить разрешения», чтобы перейти на страницу защиты авторских прав \ Центр Рэнсиса \ (CCC \)) Tj 23.17895 1 тд (.) Tj 0 0 1 рг -23.17895 0 Тд (http://cancerres.aacrjournals.org/content/48/17/4812)Tj 0 г 0 1 ТД (Чтобы запросить разрешение на повторное использование всей или части этой статьи, используйте это li \ nk) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 9 0 0 9 252.

Увеличение субпопуляций моноцитов крови CD16 + и CD56 + у пациентов с активной болезнью Крона | Воспалительные заболевания кишечника

Предпосылки

Циркулирующие моноциты можно подразделить в зависимости от наличия или отсутствия рецептора Fcγ CD16 и молекулы адгезии нервных клеток CD56. Моноциты, отнесенные к этим субпопуляциям, характеризуются различными фенотипическими и функциональными особенностями. Мы предположили, что пациенты с активной болезнью Крона различаются субпопуляциями периферических моноцитов.

Методы

Используя проточную цитометрию, мы исследовали экспрессию CD16 и CD56 на циркулирующих моноцитах у 11 пациентов с активной болезнью Крона и 11 пациентов контрольной группы. Эти субпопуляции моноцитов затем анализировали на экспрессию хемокинового рецептора фракталкина, CX ₃ CR1, и хемоаттрактантного белка-1 моноцитов, CCR2.

Результаты

Мы обнаружили медианное увеличение в 3,7 раза количества моноцитов CD16 ⁺ , относящихся к популяции с высокой экспрессией рецептора распознавания образов CD14, по сравнению с контрольной группой ( P <0.001). Изучая процентное содержание моноцитов, экспрессирующих CX ₃ CR1, и их относительную интенсивность флуоресценции (RFI), мы обнаружили значительные различия, как с самым высоким процентом, так и с самым высоким RFI в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ , тогда как Подгруппа CD14 ^{высокая} CD16 ⁺ представляла промежуточную популяцию. Напротив, экспрессия CCR2 была самой высокой в ​​популяциях с высокой экспрессией CD14, тогда как субпопуляция CD14 ^low CD16 ⁺ показала самый низкий процент и самый низкий RFI для CCR2.Мы обнаружили, что процент моноцитов CD14 ⁺ CD56 ⁺ у пациентов с активной болезнью Крона был увеличен в 2,7 раза по сравнению с контролем ( P = 0,011).

Выводы

Эти результаты показывают, что субпопуляции периферических моноцитов с более зрелым фенотипом увеличиваются у пациентов с активной болезнью Крона.

Моноциты играют ключевую роль на различных стадиях самозащиты, включая фагоцитоз опсонизированных патогенов, переваривание и процессинг чужеродных антигенов, презентацию антигена в ассоциации с молекулами класса I или класса II и, наконец, высвобождение нескольких воспалительных эффекторных молекул.Они также определяют направление и интенсивность воспалительных реакций, вызываемых в ответ на определенные патогены путем выработки выбранных цитокинов с иммуномодулирующей активностью. ¹ Grip et al предоставляют более подробное описание роли моноцитов в воспалительных заболеваниях кишечника в предыдущем обзоре. ²

Теперь стало лучше понимать, что моноциты неоднородны, и субпопуляции были идентифицированы в соответствии с критериями физических, функциональных и поверхностных маркеров.Циркулирующие моноциты можно отличить по наличию рецептора Fcγ CD16. ³ Моноциты, идентифицированные как принадлежащие к одной из этих двух субпопуляций, характеризуются различными спектрами продукции цитокинов и экспрессии хемокиновых рецепторов. ^{4 , — 6} Основная классическая субпопуляция экспрессирует высокий уровень рецептора распознавания образов CD14, часто используемого в качестве маркера моноцитов / макрофагов, без коэкспрессии CD16 (CD14 ^{высокий} CD16 ^— ), тогда как второстепенная субпопуляция, составляющая 5-10% моноцитов, одновременно экспрессирует CD16 и низкий уровень рецепторов CD14 (CD14 ^low CD16 ⁺ ) на поверхности клетки. ⁵ Известно, что классическая субпопуляция вырабатывает противовоспалительные цитокины, включая ИЛ-10, тогда как второстепенная субпопуляция увеличивается во время острого воспалительного заболевания ^{7 , — 9} , а также во время хронических воспалительных заболеваний, таких как как ревматоидный артрит и ВИЧ-инфекция. ^{10 , 11}

Предполагается, что небольшая подгруппа периферических моноцитов, недавно идентифицированная и определяемая по присутствию молекулы адгезии нервных клеток CD56, выполняет регуляторную функцию в воспалительных клетках. ¹² Они составляют 1,3% мононуклеарных клеток и были описаны как более зрелые, чем классические моноциты CD14 ⁺ .

Мы предположили, что у пациентов с активной болезнью Крона субпопуляции периферических моноцитов различаются, возможно, потому, что болезнь вызывает дифференцировку моноцитов крови. Классифицируя периферические моноциты в соответствии с экспрессией маркеров клеточной поверхности для дифференцированных клеток с помощью проточной цитометрии, мы определили субпопуляции, фенотипические свойства которых мы затем исследовали на экспрессию 2 основных хемокиновых рецепторов моноцитов, CCR2 и CX ₃ CR1.

2″> Пациенты и контроли

Мы получили периферическую кровь у 11 пациентов с активной болезнью Крона, посетивших нашу амбулаторную клинику из-за усиления клинических симптомов, а также у 11 здоровых людей из контрольной группы. В таблице 1 приведены демографические характеристики пациентов. Количество моноцитов периферической крови у пациентов с активной болезнью Крона (медиана 0,5 × 10 ⁹ / л, диапазон 0,3–1,6 × 10 ⁹ / л) было равно таковому в контроле (0.5 × 10 ⁹ / л, 0,3–1,1 × 10 ⁹ / л), как анализировали с помощью Beckman Coulter LH 7450 (Броммей, Швеция). Образцы крови для проточной цитометрии собирали в пробирки Vacutainer (BD Diagnostics, Стокгольм, Швеция), содержащие 3,2% раствор цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Образцы желательно брать у пациентов, которые не принимали иммуномодуляторы или до того, как им были назначены препараты для контроля обострений; тем не менее, некоторые из наших пациентов уже принимали препараты от ВЗК. Индекс тяжести болезни Крона ¹³ Харви Брэдшоу использовался для количественной оценки активности заболевания, и пациенты, набравшие не менее 7 баллов в сочетании с повышенными уровнями С-реактивного белка в плазме (> 3.0 мг / л) были включены в исследование. Результаты исследований на патогены, паразиты и токсин Clostridium difficile в стуле были отрицательными. У пациентов отсутствовали клинические признаки сепсиса или перфорации кишечника. Контрольной группой были здоровые добровольцы того же пола и возраста, у которых был нормальный уровень С-реактивного белка (<2,0 мг / л). Информированное согласие было получено от всех пациентов, и исследование было одобрено местным комитетом по медицинской этике.

Образцы крови окрашивали методом цельной крови с использованием протокола, описанного ранее. ¹⁴ Вкратце, пробирки Falcon, содержащие 50 мкл цельной крови, окрашивали в темноте в течение 15 минут при 4 ° C соответствующим количеством конъюгированного с флуоресцеином изотиоцианатом анти-CX ₃ CR1 от Nordic Biosite (Täby, Швеция), конъюгированный с аллофикоцианином анти-CD56 от MACS, Miltenyi Biotec (GTF, Västra Frölunda, Швеция), конъюгированный с фикоэритрином анти-CD16 и анти-CCR2 Alexa Fluor 647 и конъюгированный с перидином хлорофиллом анти-CD14 от BD Pharmingen (Stockholm, Stockholm, Stockholm, Швеция).Для проверки неспецифической реактивности использовали конъюгированные с флуорохромом изотипические контрольные антитела против крысиного IgG _2b (Nordic Biosite), а также мышиного IgG ₁ и IgG _2b (BD Pharmingen). Эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали в течение 10 минут с помощью BD FACT Lysing Solution (BD Pharmingen), затем дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и центрифугировали в течение 3 минут при 1500 g . Проточную цитометрию выполняли на 4-цветном проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences), и перед анализом с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences) были получены данные не менее 4000 моноцитов, стробированных морфологически (двумерный график прямого и бокового рассеяния) Программное обеспечение WinList (Verity Software House Inc., Топшэм, штат Мэн). Относительная интенсивность флуоресценции (RFI) отображалась как отношение линеаризованной положительной медианы к медиане линеаризованного изотипического контроля.

9″> Результаты

^{4″> CD14 высокий CD16 + Моноциты обладают высокой экспрессией CCR2 и промежуточной экспрессией CX ₃ CR1}

Изучая процентное содержание моноцитов, экспрессирующих CX ₃ CR1, и их относительную интенсивность флуоресценции (RFI), мы обнаружили значительные различия между всеми 3 субпопуляциями, как с самым высоким процентом, так и с самым высоким RFI в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ и промежуточная экспрессия обоих в субпопуляции CD14 ^high CD16 ⁺ .Процент моноцитов, экспрессирующих CX ₃ CR1, в определенных субпопуляциях (CD14 ^{высокий} CD16 ^— , CD14 ^{высокий} CD16 ⁺ и CD14 ^низкий CD16 ⁺ ) составлял 53,3%, 72,9%, и 86,8% соответственно у пациентов ( P <0,05) и 70,2%, 89,3% и 96,5% соответственно в контроле ( P <0,05). В субпопуляциях пациентов, положительных по CD16, мы обнаружили значительно более низкий процент моноцитов, экспрессирующих CX ₃ CR1, чем в контроле ( P = 0.049 в субпопуляции CD14 ^high CD16 ⁺ и P = 0,003 в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ ). RFI CX ₃ CR1 увеличивался аналогичным образом, с максимальной экспрессией в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ (3,5%, 5,1% и 11,7%, соответственно, в субпопуляциях пациентов [ P <0,05] и 3,1%, 4,9% и 10,9% соответственно в контроле [ P <0,05]).

Мы наблюдали обратную ситуацию для экспрессии CCR2, обнаруживая самый низкий процент и самый низкий RFI в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ .Значительные различия были обнаружены в экспрессии субпопуляций моноцитов CD14 ^high CD16 ^— , CD14 ^high CD16 ⁺ и CD14 ^low CD16 ⁺ (88,9%, 77,1% и 28,3% соответственно у пациентов и 92,9%, 66,7% и 19,6% соответственно в контроле; P <0,05). Кроме того, мы наблюдали тенденцию к тому, что субпопуляции пациентов имели более высокий процент моноцитов, экспрессирующих CCR2, чем контрольные субпопуляции.RFI CCR2 снижался аналогичным образом, с наименьшей экспрессией в субпопуляции CD14 ^low CD16 ⁺ (12,0%, 12,6% и 6,3% соответственно в субпопуляциях пациентов и 10,8%, 7,6% и 3,0% соответственно в контроле; P <0,05). В контроле наблюдались существенные различия между всеми субпопуляциями, при этом клетки CD14 ^high CD16 ⁺ представляли промежуточную популяцию, тогда как в субпопуляциях пациентов экспрессия CCR2 в промежуточной популяции CD14 ^high CD16 ⁺ была такой же высокий, как в популяции CD16 ^— .Мы обнаружили значительно более высокие RFI для CCR2 в субпопуляциях пациентов, положительных по CD16, чем в контроле ( P = 0,008 в субпопуляции CD14 ^{с высоким} CD16 ⁺ и P = 0,010 в субпопуляции CD14 ^{с низким} CD16 ^{+ Субпопуляция} ; рис.3). Таким образом, CCR2 был доминирующим рецептором хемокина как в самой большой популяции моноцитов, классических клетках CD14 ^high CD16 ^—, так и в популяции, которая была увеличена у пациентов с активной болезнью Крона, CD14 ^high CD16 ⁺ моноциты.

Рисунок 3

Экспрессия хемокинов CX ₃ CR1 и CCR2 на моноцитах, взятых у пациентов с активной болезнью Крона и контрольной группы. Данные представлены как доля положительных клеток (%) и их относительная интенсивность флуоресценции (RFI) в определенных субпопуляциях (CD14 ^{высокий} CD16 ^— , CD14 ^{высокий} CD16 ⁺ и CD14 ^низкий CD16 ⁺ ).

Фиг. 3

Экспрессия хемокинов CX ₃ CR1 и CCR2 на моноцитах, взятых у пациентов с активной болезнью Крона и контрольной группы.Данные представлены как доля положительных клеток (%) и их относительная интенсивность флуоресценции (RFI) в определенных субпопуляциях (CD14 ^{высокий} CD16 ^— , CD14 ^{высокий} CD16 ⁺ и CD14 ^низкий CD16 ⁺ ).

1″> Обсуждение

Существование субпопуляций моноцитов у людей известно и изучается в течение многих лет, в большинстве случаев на основе экспрессии CD16. Поскольку исследований на пациентах с болезнью Крона не проводилось, мы хотели оценить значимость экспрессии CD16 при этом хроническом воспалительном заболевании. Наши результаты показали четкую экспансию моноцитов CD16 ⁺ , указывая на то, что они могут играть важную роль в патогенезе болезни Крона.Моноциты CD16 ⁺ были описаны как «провоспалительные», ¹⁵ продуцирующие высокие уровни TNF, с низким или отсутствующим противовоспалительным цитокином IL-10. Клетки ⁵ CD16 ⁺ также демонстрируют особенности дифференцированных моноцитов или тканевых макрофагов, такие как повышенная миграция в ткань, ¹⁶ , и было высказано предположение, что они вносят значительный вклад в предшественников дендритных клеток. ¹⁷ Исследования воспаленных тканей пациентов с воспалительным заболеванием кишечника выявили субпопуляции CD16-экспрессирующих макрофагов вблизи собственной пластинки, которые редко присутствуют в нормальной, не воспаленной ткани. ^{18 , 19} Было показано, что вовлечение CD16 играет важную роль в передаче сигналов о выживании, предотвращая апоптоз моноцитов в ответ на IL-10. ²⁰ Этот механизм, действующий in vivo, может сохранять жизнеспособность фагоцитов со способностью мигрировать в лимфатические узлы в качестве антигенпрезентирующих дендритных клеток.

Предыдущие исследования показали, что созревание моноцитов отражается в повышенной поверхностной экспрессии CD16 и сниженной экспрессии CD14. ^{10 , 16 , 17} Возможно, бактериальные антигены могут индуцировать моноциты CD16 ex vivo , что предполагает, что CD14 ^низкий CD16 ⁺ моноциты могут созревать из CD14 ^{высокий} CD16 ^— моноцитов. ²¹ Предположение о прогрессирующей дифференцировке моноцитов в кровотоке при воспалительных условиях in vivo подтверждается экспериментальными данными, полученными на адоптивно перенесенных клетках у мышей. ²² Однако созревание циркулирующих моноцитов, вероятно, будет только одним из источников. Данные, представленные другими авторами, подтверждают теорию о том, что моноциты CD16 ⁺ представляют собой более зрелые клетки, поступающие в кровоток из ткани в экстремальных воспалительных условиях. ¹⁷

Большая часть обширных исследований трафика лейкоцитов была сосредоточена на нейтрофилах и Т-клетках. Внутреннее разнообразие мононуклеарных миелоидных клеток сделало специфические исследования транспорта моноцитов более трудными.Однако в последние годы наши знания о механизмах, лежащих в основе рекрутирования моноцитов, расширились. ²³ Первым этапом миграции моноцитов является активация интегринов лейкоцитов, что приводит к прочной адгезии лейкоцитов к эндотелию до того, как они эмигрируют через стенку сосуда. Хемокины могут инициировать сигналы, которые вызывают интегрины β ₁ и β ₂ , а хемокины, которые контролируют положение клеток, происходящих из моноцитов, в тканях — это те, которые активируют интегрины лейкоцитов α _L β ₂ (LFA1), α _M β ₂ (MAC1), α _X β ₂ и α ₄ β ₁ (VLA4).Моноциты CD16 ⁺ были описаны как демонстрирующие преимущественную миграцию через эндотелиальные слои в ответ на хемокин фракталкин (CX ₃ CL1). ^{4 , 24} Исследования фракталкина показали, что он может усиливать адгезию макрофагоподобных клеточных линий посредством как β ₁ интегрин-, так и β ₂ интегрин-зависимых и -независимых механизмов. ²⁵ Путем изящных экспериментов, проведенных на мышах, были детально идентифицированы 2 субпопуляции моноцитов, частично за счет включения репортера зеленого флуоресцентного белка (GFP) в рецептор фракталкина (CX ₃ CR1). ²⁶ Исследования с использованием этого маркера показали, что клетки, экспрессирующие низкие уровни CX ₃ CR1, селективно рекрутируются в места воспаления, тогда как моноциты, демонстрирующие высокие уровни CX ₃ CR1, вызывают тканевые макрофаги посредством фракталкин-зависимого рекрутирования. В отличие от рекрутирования моноцитов в ткань, которая не воспалена, рекрутирование в воспаленную ткань в основном зависит от хемоаттрактантного белка моноцитов – 1 (MCP-1), лиганда хемокинового рецептора CCR2. ^{27 , 28} MCP-1, как было показано, способствует адгезии моноцитов к воспаленному эндотелию человека через пути β ₂ -интегрина. ²⁹ Таким образом, было идентифицировано 2 подмножества: CCR2 ^— CX ₃ CR1 ^high моноцитов, которые постоянно находятся в ткани, и CCR2 ⁺ CX ₃ CR1 ^low моноцитов, которые находятся в на ткани только в том случае, если она воспалена. В нашем исследовании мы обнаружили, что популяция CD14 ^high CD16 ^— очень похожа на подмножество CCR2 ⁺ CX ₃ CR1 ^low и что популяция CD14 ^low CD16 ⁺ соответствует CCR2 ^— CX3CR1 ^{высокая субпопуляция} .Однако моноциты, которые были увеличены у пациентов с активной болезнью Крона в нашем исследовании, представляли собой клетки CD14 ^high CD16 ⁺ , которые имели высокую экспрессию CCR2 и промежуточную экспрессию CX ₃ CR1. Эта субпопуляция, которая, как предполагается, является более зрелой, чем классическая воспалительная популяция CD14, ^{, высокая,} , CD16, ^–, таким образом, может прижиться в воспаленных тканях. Иммуногистохимическое окрашивание образцов толстой кишки, взятых у пациентов с болезнью Крона, показало повышенную экспрессию хемокинов, включая MCP-1, которая коррелировала с активностью заболевания. ³⁰ В воспаленной слизистой оболочке множество клеток способны продуцировать МСР-1, включая макрофаги собственной пластинки, эндотелиальные клетки, веретеновидные клетки и кишечные эпителиальные клетки. ³¹ В предыдущих исследованиях мы также обнаружили повышенное содержание МСР-1 в плазме, взятой у пациентов с активной болезнью Крона, ³² , что указывает на то, что путь CCR2 является центральным для рекрутирования моноцитов у этих пациентов.

Молекула адгезии нервных клеток (NCAM) CD56, которая имеет внеклеточный домен, содержащий 5 иммуноглобулиновых и 2 фибронектиновых домена III типа, использовалась в нескольких исследованиях в качестве маркера для определения популяций природных цитотоксических клеток, включая NK и NK-T. клетки.CD56 также использовался в качестве диагностического и прогностического маркера миелоидных злокачественных новообразований. ^{33 , 34} Кроме того, CD56 в сочетании с маркерами дендритных клеток (DC) облегчил идентификацию подмножества плазматических DC. ³⁵ Мало что известно о кроветворных функциях CD56, кроме его ассоциации с клетками, проявляющими естественный иммунитет. Было высказано предположение, что клетки CD56 ⁺ взаимодействуют с интегринами LFA-1 и LFA-3 для усиления взаимодействий между NK и другими клетками CD56 ⁺ , что приводит к повышенной цитотоксичности. ³⁶ Однако другим исследователям не удалось продемонстрировать прямое участие CD56 в цитотоксичности, опосредованной NK-клетками. ³⁷ Совсем недавно CD56 в сочетании с миелоидными маркерами был использован для характеристики популяции миелоидных клеток CD56. ¹² Авторы обнаружили, что эта популяция обладает антигенпредставляющими функциями, которые превосходят функции классических моноцитов CD14 ⁺ , вызывая большую пролиферацию Т-клеток, когда лимфоциты-респондеры не соответствуют HLA.Мы можем только догадываться, почему мы наблюдали явную экспансию моноцитов CD56 ⁺ у пациентов с болезнью Крона. Однако, поскольку болезнь Крона считается следствием нерегулируемого Т-клеточного ответа, который приводит к пролиферации фенотипа Т-хелперных Т-клеток (Th2) типа 1, моноциты CD56 ⁺ могут быть важным медиатором в этом процессе.

Таким образом, мы охарактеризовали подмножества периферических моноцитов, которые имеют более зрелый фенотип, чем у классической популяции моноцитов, и которые увеличиваются у пациентов с активной болезнью Крона.Эти данные, вероятно, не специфичны для болезни Крона и, скорее всего, могут быть обнаружены при других острых или хронических воспалительных состояниях. Однако исследования популяций моноцитов CD14 ^high CD16 ⁺ и CD56 ⁺ и их функций могут улучшить наше понимание этого заболевания и повлиять на наши терапевтические стратегии. Более того, было бы интересно посмотреть, могут ли определенные субпопуляции использоваться в качестве биомаркеров воспалительного статуса у пациентов с болезнью Крона, например, влияют ли они на медикаментозное лечение до того, как у пациентов будет заметен клинический эффект.

Заметки автора

Авторские права © 2007 Crohn’s & Colitis Foundation of America, Inc.

Monocyte | Bio-Rad

Моноциты — это лейкоциты, которые играют ключевую роль в воспалении, заражении патогенами и гомеостазе.Они происходят от предшественников в костном мозге и перемещаются с током крови в периферические ткани. В месте инфицирования или повреждения тканей они могут дифференцироваться в дендритные клетки или макрофаги, которые опосредуют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ на заболевание. Моноциты демонстрируют обширную пластичность и гетерогенность и корректируют свой функциональный фенотип в ответ на иммунологические сигналы. Они являются критически важными клетками в поддержании здоровья человека и были предметом интенсивных исследований с 1880-х годов, когда их фагоцитарная способность была впервые описана Ильей Мечниковым.В этом обзоре мы охарактеризовали основные субпопуляции моноцитов человека и мыши и их функции, описали процесс рекрутирования и дифференцировки моноцитов, а также подчеркнули роль моноцитов в заболевании.

1. Введение в моноциты

Моноциты представляют собой эволюционно законсервированную субпопуляцию лейкоцитов, которые происходят из миелоидных предшественников в костном мозге. Они составляют 4% белых кровяных телец у мышей и 10% у людей (van Furth R and Sluiter W 1986) со значительным количеством моноцитов в селезенке и легких, которые могут мобилизоваться в другие ткани (Swirski FK et al.2009 г.). Моноциты быстро попадают в ткани во время инфекции и воспаления, где они дифференцируются в макрофаги или дендритные клетки (ДК). Их фагоцитарная способность была впервые продемонстрирована Ильей Мечниковым в 1880-х годах, и с тех пор было показано, что они незаменимы в иммунологической защите от патогенов (Karlmark KR et al. 2012, Nathan CF 2008). Они также играют ключевую роль в поддержании гомеостаза. Однако, хотя моноциты необходимы для уничтожения вторгшихся бактерий, вирусов, грибов и простейших, они также могут оказывать негативное влияние на патогенез воспалительных и дегенеративных заболеваний.Соответственно, они считаются ключевыми терапевтическими мишенями для лечения заболеваний.

2. Развитие и дифференциация моноцитов.

Моноциты являются членами системы мононуклеарных фагоцитов (MPS), которая представляет собой исчерпывающую классификацию всех высокофагоцитарных мононуклеарных клеток и их предшественников (van Furth R и Cohn ZA 1968, van Furth R et al. 1972). Он включает все миелоидные иммунные клетки, кроме полиморфноядерных гранулоцитов. Однако происхождение и происхождение клеток в MPS оставались плохо изученными до тех пор, пока не появилась возможность сортировки клеток, активируемой многоцветной флуоресценцией, которая позволила идентифицировать предшественников и дифференцированные популяции клеток на основе экспрессии специфических клеточных маркеров (Geissmann F et al.2010).

Современные модели дифференцировки моноцитов предполагают, что циркулирующие моноциты происходят из предшественников, происходящих из гемопоэтических стволовых клеток (HSC) с миелоидно-ограниченным потенциалом (Geissmann F et al. 2010). Последующие шаги приверженности во время дифференцировки моноцитов в костном мозге включают общие миелоидные предшественники (CMPs), предшественники гранулоцитов-макрофагов (GMPs) и предшественники макрофагов и DC (MDPs) (Fig. 1) (Geissmann F et al. 2010).

В экспериментах по адаптивному переносу внутрикостного мозга на мышах установлено, что MDP являются законными инициаторами моноцитов, показывая, что помимо моноцитов они дают начало классическим DC (cDC) и плазмоцитоидным DC через общие предшественники DC (CDP) (Ginhoux F and Jung S 2014, Fogg DK et al.2006 г.). MDP характеризуются как отрицательные по клону (LIN ^—), положительные по CD135 (также известные как FLT3), положительные по CD117 (также известные как KIT) и положительные по CD115 (также известные как CSF1R).

Другой предшественник костного мозга, названный общим предшественником моноцитов (cMoP), был недавно идентифицирован (Hettinger J et al. 2013). Было показано, что cMoPs дают начало моноцитам и их производным, но не генерируют плазмацитоидные DC или cDC. Фенотипически cMoP отличаются от MDP тем, что они не экспрессируют CD135 (Hettinger J et al.2013). Рисунок 1 демонстрирует дифференцировку моноцитов у мышей.

Развитие моноцитов происходит во время эмбрионального и взрослого гемопоэза, а также при воспалительных условиях (Robbins CS et al. 2012, Ginhoux F and Jung S 2014). После развития в костном мозге моноциты попадают в периферический кровоток и примерно через три дня мигрируют в периферические ткани как следствие гомеостаза и воспаления (Stefater JA et al. 2011). В тканях моноциты дифференцируются в ряд макрофагов или DC под воздействием местных факторов роста, таких как провоспалительные цитокины и микробные соединения (Tacke F and Randolph GJ 2006).

Рис. 1. Дифференцировка моноцитов у мышей . По материалам Geissmann F et al. 2010 и Ginhoux F и Jung S 2014. HSC, гемопоэтические стволовые клетки; MP, миелоидный предшественник; MDP, предшественник макрофагов и дендритных клеток; CDP, общий предшественник дендритных клеток; CMoP, общий предшественник моноцитов; CD103 ⁺ IpDC, CD103 ⁺ дендритные клетки собственной пластинки; CX ₃ CR1, CX ₃ C-хемокиновый рецептор 1; TipDC, дендритные клетки, продуцирующие фактор некроза опухоли (TNF) и индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS); MDSC, клетка-супрессор миелоидного происхождения; PDC, плазматические дендритные клетки; cDC, классические дендритные клетки.

Вернуться наверх

3. Характеристика субпопуляций моноцитов у человека и мыши.

Моноциты периферической крови человека определяются по их экспрессии маркеров клеточной поверхности CD14 (корецептор LPS), CD16 (Fc гамма RIII), CD64 (Fc гамма RI) и хемокиновых рецепторов CD192 (также известных как CCR2) (ключевой медиатор миграции моноцитов) и CX ₃ CR1 (рецептор фракталкина) (Shi C and Pamer EG 2011). Существует три различных подгруппы человеческих моноцитов: классические, промежуточные и неклассические (таблица 1).Эти субпопуляции могут дополнительно характеризоваться различными уровнями лейкоцитарного антигена человека, связанного с антигеном D (HLA-DR) (самый высокий уровень в промежуточной популяции) и CD195 (также известного как CCR5), а также рецепторов TNFR1 (CD120a) и TNFR2. (CD120b). Экспрессия TNFR1 выше на промежуточных моноцитах, за которыми следуют классические, а затем неклассические моноциты. Напротив, TNFR2 экспрессируется выше в неклассических моноцитах, за ним следует промежуточный, с самым низким уровнем экспрессии в классической субпопуляции (Hijdra D et al.2012).

Моноциты мыши также имеют три субпопуляции (таблица 1), определяемые по экспрессии на их клеточной поверхности Ly6C (также известного как Gr-1), CD43 (Ziegler-Heitbrock L et al.2010), CD11b и хемокиновых рецепторов CD192 для транспортировки и эмиграции ( Tsou CL et al. 2007) и CX ₃ CR1 для неоваскуляризации (Kumar AHS et al.2013). Хотя экспрессия хемокиновых рецепторов помогает определить субпопуляции моноцитов мыши (классические по сравнению с неклассическими), высокий уровень экспрессии CD115 облегчает различение моноцитов крови от гранулоцитов и лимфоцитов, которые также экспрессируют CD11b (Mac-1).

Дополнительные маркеры, такие как хорошо охарактеризованный маркер макрофагов F4 / 80, также экспрессируются на низких уровнях на моноцитах (Francke A et al. 2011).

Таблица 1. Основные популяции моноцитов человека и мыши

CCR2, CC-хемокиновый рецептор 2; CX ₃ CR1, CX ₃ C-хемокиновый рецептор 1, TNFR1, рецептор 1 фактора некроза опухоли; TNFR2, рецептор 2 фактора некроза опухоли; HLA-DR, человеческий лейкоцитарный антиген-антиген D связанный; CCR5, CC-хемокиновый рецептор 5

Вернуться наверх

4.Молекулы, участвующие в рекрутировании моноцитов

Моноциты — это центральные клетки иммунной системы, которые играют ключевую роль в поддержании общего состояния здоровья и реагировании на патогенные инфекции. Однако в первую очередь они действуют как медиаторы воспаления; они также служат источником макрофагов и ДК в кровообращении и в тканях. Они демонстрируют высокую фагоцитарную способность к удалению инфицированных и умирающих клеток и играют роль в адаптивном иммунитете, либо напрямую активируя Т-клетки, либо дифференцируясь в макрофаги и ДК, которые способны индуцировать пролиферацию Т-клеток CD8 ⁺ и регулировать активацию CD4 ⁺ Т-клеток (Geissmann et al.2003 г.).

Во время инфекции моноциты привлекаются из костного мозга к инфекционным или воспалительным участкам, где они инициируют противомикробную активность или способствуют адаптивным Т-клеточным ответам (Serbina NV et al. 2008, Shi C and Pamer EG 2011). Моноциты также могут быть привлечены к участкам опухоли, где они могут опосредовать механизмы противоопухолевой защиты (Peranzoni E et al. 2010). Следовательно, способность моноцитов перемещаться к участкам ткани является центральным элементом их функций иммунной защиты. Рекрутирование и доставка моноцитов в первую очередь опосредуется взаимодействием хемокиновых рецепторов и молекул адгезии, экспрессируемых на клеточной поверхности моноцитов, с их соответствующими партнерами по связыванию.Ниже мы выделяем рецепторы хемокинов и молекулы адгезии, участвующие в этом процессе, которые разделяются между набором классических и неклассических моноцитов. Обсуждаемые результаты в первую очередь относятся к моноцитам мышей, так как рекрутирование моноцитов в первую очередь изучается на мышах. Однако сходство между субпопуляциями моноцитов мыши и человека указывает на консервативную систему, и исследования, проведенные на мышах, полезны для понимания биологии моноцитов человека (Geissmann F et al. 2003).

Хемокиновые рецепторы и хемокины, участвующие в рекрутинге классических моноцитов

Большинство циркулирующих моноцитов относятся к классической подгруппе, и они избирательно перемещаются к участкам воспаления (Geissmann F et al.2003 г.). CC-хемокиновый лиганд 2 (CCL2; также известный как MCP1) и CCL7 (также известный как MCP3) связываются с CD192, облегчая эмиграцию моноцитов Ly6C ^hi (Tsou CL et al. 2007) из костного мозга в ткани. Делеция либо Ccl2 , либо Ccl7 у мышей приводит к снижению рекрутирования моноцитов на 40-50% во время инфекции, указывая на то, что они необходимы для транспортировки моноцитов во время заражения патогенами (Jia T et al. 2008). Точный механизм CCL2 и CCL7 опосредованного рекрутирования моноцитов неясен; однако было высказано предположение, что экспрессия IL-23 необходима для опосредованного CCL2 и CCL7 рекрутирования воспалительных моноцитов в селезенку во время бактериальной инфекции (Indramohan M et al.2012).

Моноциты также экспрессируют CD191 (также известный как CCR1) и CD195, которые связываются с рядом хемокинов, включая CCL3 и CCL5 (Mack M et al. 2001, Kaufmann A et al. 2001). Истощение CD195 и CD191 in vivo демонстрирует, что эти хемокиновые рецепторы играют неизбыточную роль в рекрутинге воспалительных моноцитов (Eis V et al. 2004, Braunersreuther V et al. 2007). Было показано, что привлечение моноцитов Ly6C ^hi к атеросклеротическим бляшкам на мышиной модели атеросклероза частично опосредуется CD195, а также CD192 и CX ₃ CR1 (Tacke F et al.2007). Однако определение роли CD191 и CD195 в привлечении моноцитов осложняется тем фактом, что в отличие от CD192, эти хемокиновые рецепторы экспрессируются в широком диапазоне клеток (Shi C and Pamer EG 2011). Следовательно, возможно, что изменения в рекрутировании моноцитов, наблюдаемые у мышей с дефицитом CD191 и CD195, могут быть следствием эффектов на другие популяции клеток, которые экспрессируют эти рецепторы (Shi C and Pamer EG 2011).

Хемокиновые рецепторы и хемокины, участвующие в рекрутинге неклассических моноцитов

Неклассические моноциты составляют 40% циркулирующих моноцитов и в первую очередь патрулируют кровеносные сосуды и проникают в невоспаленные ткани.При воспалительных условиях они рекрутируются в места инфекции раньше, чем классические моноциты (Auffray C et al. 2007). Они в первую очередь отвечают на CX ₃ CL1, лиганд для CX ₃ CR1, который экспрессируется на моноцитах. Экспрессия CX ₃ CL1 может быть обнаружена в краевой зоне селезенки во время инфекции, и было показано, что это опосредует раннее привлечение моноцитов Ly6C ^low в селезенку. Удаление CX ₃ CR1 приводит к уменьшению патрулирования моноцитов Ly6C ^low и снижению рекрутирования моноцитов Ly6C ^hi в селезенку во время бактериальной инфекции (Auffray C et al.2009 г.). CD195 также играет роль в привлечении моноцитов Ly6C ^low . На модели атеросклероза на мышах было показано, что рекрутирование моноцитов Ly6C ^low частично зависит от CD195, регуляция которого в этой субпопуляции моноцитов сильно повышена.

Другие хемокиновые рецепторы, которые, как было показано, участвуют в привлечении как классических, так и неклассических моноцитов, включают CD196 (также известный как CCR6), CD197 (также известный как CCR7), CDw198 (также известный как CCR8), рецептор антигена Даффи для хемокинов. (DARC) и CXC-хемокиновый рецептор 2 (CXCR2).Однако они менее изучены, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять их роль в перемещении моноцитов во время инфекции и воспаления (Shi C and Pamer EG 2011).

Молекулы адгезии, участвующие в привлечении моноцитов

Рекрутирование и доставка моноцитов также зависит от экспрессии интегринов и других адгезионных молекул на активированных эндотелиальных клетках (Ley K et al. 2007). Например, было показано, что моноциты Ly6C ^hi экспрессируют гликопротеин-лиганд 1 P-селектина (PSGL1), L-селектин (также известный как CD62L), антиген 1, связанный с функцией лимфоцитов (LFA1; также известный как интегрин αLβ2), макрофаги. рецептор 1 (MAC1; также известный как αMβ2), молекула адгезии 1 эндотелиальных клеток тромбоцитов (PECAM1) и очень поздний антиген 4 (VLA4; также известный как интегрин α4β1).Все эти молекулы вносят вклад в адгезию и миграцию моноцитов (Shi C and Pamer EG 2011).

Моноциты также экспрессируют молекулу адгезии лейкоцитов CD226 (DNAM-1; также обнаруживается на NK-клетках, субпопуляциях Т-клеток, тучных клетках и тромбоцитах), и взаимодействие этой молекулы с CD155 (экспрессируется в соединениях на первичных эндотелиальных клетках) регулирует миграцию моноцитов через клетку. соединения (Xu Z and Jin B 2010).

Вернуться наверх

В таблице 2 суммированы молекулы адгезии и хемокиновые рецепторы, участвующие в привлечении моноцитов, а также их соответствующие партнеры по связыванию.

Таблица 2. Молекулы, участвующие в привлечении и перемещении моноцитов

По материалам Shi C и Pamer G et al.2011 и Kalmark KR et al. 2012. CCL, CC-хемокиновый лиганд; CCR, CC-хемокиновый рецептор; CX ₃ CL1, CX ₃ C-хемокиновый лиганд 1; CX ₃ CR1, CX ₃ C-хемокиновый рецептор 1; CXCR2, CXC-хемокиновый рецептор 2; GLYCAM1, молекула 1 клеточной адгезии, зависимая от гликозилирования; ICAM1, молекула межклеточной адгезии 1; LFA1, антиген 1, связанный с функцией лимфоцитов; MAC1, рецептор макрофагов 1; MADCAM1, адгезионная молекула 1 для адгезии клеток слизистой оболочки; MIF, фактор ингибирования миграции макрофагов; PECAM1, молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов; PSGL1, гликопротеиновый лиганд 1 P-селектина; VCAM1, молекула адгезии сосудистых клеток 1; VLA4, очень поздний антиген 4; МСР, хемотаксический белок моноцитов; RANTES, регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются; MIP, воспалительный белок макрофагов, DNAM-1, ДНКX Accessory Molecule-1.

5. Моноциты в болезни

Моноциты играют решающую роль в поддержании здоровья. Следовательно, повышенная продукция или отсутствие моноцитов приводит к заболеванию. Моноцитоз определяется как увеличение абсолютного количества моноцитов крови до более чем 800 / мкл. Повышение пролиферативной активности моноцитов в костном мозге в ответ на воспаление, приводящее к моноцитозу, было впервые зарегистрировано в 1970-х годах (Meuret G et al. 1974). Теперь известно, что моноцитоз является индикатором различных воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунное заболевание, желудочно-кишечные расстройства, саркоидоз, а также вирусные и бактериальные инфекции.Это также происходит у пациентов с онкологическими заболеваниями и хроническими заболеваниями, такими как туберкулез (Dutta P and Nahrendorf M, 2014). С другой стороны, моноцитопения — это недостаток или отсутствие моноцитов в кровообращении. Синдром моноцитопении и микобактериальной инфекции (MonoMAC) характеризуется комбинированным отсутствием циркулирующих моноцитов, DC, B-клеток и естественных клеток-киллеров (Vinh DC et al. 2010). Этот синдром встречается у пациентов с мутациями в гене гемопоэтического фактора транскрипции GATA2 (Camargo JF et al.2013) , и клинически проявляется как нетуберкулезная микобактериальная инфекция на участках кожи или инфекция генитального вируса папилломы человека, которая имеет высокий риск прогрессирования до рака половых органов (Vinh DC et al. 2010).

Моноциты также могут быть полезными или вредными при таких заболеваниях, как атеросклеротические сердечно-сосудистые заболевания, фиброз печени, болезнь Альцгеймера и рак (Yang J et al. 2014, Karlmark KR et al. 2012). Ниже мы описываем роль моноцитов в развитии атеросклероза, фиброза печени, болезни Альцгеймера и прогрессирования опухоли.

Вернуться наверх

Атеросклероз

Атеросклероз — это утолщение артериальной стенки, вызванное накоплением холестерина, что приводит к образованию бляшек и закупорке артерий. Это основной фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе заболеваний периферических артерий, ишемической болезни сердца, инсульта и сердечного приступа. Воспалительные моноциты являются основным клеточным компонентом атеросклеротических бляшек (Zhang D et al. 2012). Было показано, что классические моноциты накапливаются в атеросклеротических бляшках за счет рекрутирования через CD192, CD195 и CX ₃ CR1 и играют важную роль в прогрессировании бляшек, тем самым обостряя заболевание.Они способствуют воспалению сосудов при атеросклерозе, продуцируя воспалительные цитокины и индуцируя активацию Т-клеток посредством взаимодействия CD40-CD40L (Yang J et al. 2014). Мыши с дефицитом CX ₃ CR1 демонстрируют сниженную тяжесть заболевания на мышиной модели атеросклероза из-за снижения выживаемости инфильтрирующих моноцитов и макрофагов (Combadie’re C et al. 2003). Это указывает на то, что терапевтическое ингибирование рекрутирования моноцитов может значительно повлиять на прогрессирование атеросклероза.Кроме того, моноклональные антитела против CD40L снижают количество осложнений, связанных с атеросклерозом, что позволяет предположить, что ингибирование передачи сигналов CD40 моноцитов / макрофагов при сердечно-сосудистых заболеваниях может быть полезной терапевтической стратегией (Kawai T. et al. 2000).

Фиброз печени

Фиброз печени вызывается длительным воздействием на печень через инфекцию гепатита B или C или хронический алкоголизм. Это приводит к отложению коллагена 1 типа во внеклеточном пространстве, что в конечном итоге ухудшает функцию печени.Мышиные модели фиброза печени демонстрируют повышенную инфильтрацию моноцитов Ly6C ^hi CCR2 ⁺ в печень. Эти моноциты продуцируют профиброгенные цитокины, такие как IL-6 и TGF beta-1, которые активируют вырабатывающие коллаген клетки в печени, что приводит к усилению фиброза (Karlmark KR et al. 2009). Истощение CCR2 у мышей приводит к снижению инфильтрации моноцитов Ly6C ^hi в печень и снижению фиброза печени (Karlmark KR et al. 2009). Это демонстрирует отрицательный эффект инфильтрации моноцитов Ly6C ^hi CCR2 ⁺ на прогрессирование фиброза печени.Однако на более поздних стадиях заболевания моноциты также играют роль в уменьшении фиброза печени. Проникающие моноциты могут дифференцироваться в макрофаги, которые секретируют матриксные металлопротеиназы (MMP), которые разрушают отложения коллагена, что приводит к регрессии фиброза (Karlmark KR et al. 2012).

Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее распространенное неврологическое заболевание, поражающее пожилых людей во всем мире. Он характеризуется наличием бляшек бета-амилоида (Aβ) в паренхиме головного мозга.Исследования показали, что Aβ может рекрутировать моноциты в мозг (Feng Y et al. 2011). Однако было показано, что циркулирующие и инфильтрирующие моноциты очищают бляшки Aβ (Thèriault O et al. 2015). Хотя обе субпопуляции моноцитов играют роль в AD, неклассические (Ly6C ^низкий / CD14 ^низкий CD16 ^hi ) противовоспалительные моноциты более значительно способствуют удалению бляшек Aβ у пациентов с AD и мышиных моделей AD ( Терио П и др., 2015). Эта подгруппа патрулирующих моноцитов устраняет микроагрегаты Aβ путем интернализации и транспортировки их из микрососудов головного мозга в кровоток (Michaud JP et al.2013). Однако исследования также показали, что инфильтрирующие моноциты демонстрируют нарушение фагоцитарной способности при БА, что снижает их способность фагоцитировать бляшки Aβ (Karlmark KR et al. 2012). Это указывает на то, что механизмы, используемые при инфильтрации моноцитов для удаления бляшек Aβ, не зависят исключительно от их фагоцитарной способности.

Прогрессирование опухоли

Недавние исследования продемонстрировали противоречивую роль моноцитов в онкогенезе и удалении опухоли. Моноциты могут опосредовать противоопухолевые ответы, представляя ассоциированные с опухолью антигены цитотоксическим Т-клеткам (ЦКО), инфильтрирующим опухоль, для индукции уничтожения опухоли.Однако активность моноцитов часто деактивируется при раке, что приводит к снижению способности моноцитов активировать CTL и секретировать воспалительные цитокины IFN-гамма, TNF-альфа и IL-12. Кроме того, моноциты в микроокружении опухоли демонстрируют повышенную способность продуцировать ИЛ-10, иммунодепрессивный цитокин (Pardoll D 2003). Это демонстрирует ингибирующую роль, которую среда опухоли играет в противоопухолевой функции моноцитов. Клетки-супрессоры миелоидного происхождения, которые происходят в основном из моноцитов Ly6C ^hi , также секретируют IL-10 для подавления активности Т-клеток, инфильтрирующих опухоль.Совместное культивирование моноцитов CD14 ⁺ с различными опухолевыми клетками показало, что опухоли экспрессируют высокие уровни простагландина, который также играет роль в деактивации противоопухолевой функции моноцитов (Doseff AI and Parihar A 2015).

Однако моноциты могут участвовать в росте опухоли, способствуя ангиогенезу, который является критическим процессом в прогрессии опухоли (Lin et al. 2001). Было показано, что моноциты Ly6C ⁺ CD11b ⁺ напрямую способствуют ангиогенезу через паракринные механизмы (Yang L et al.2004 г.). Более того, моноциты, экспрессирующие Tie-2 рецептор ангиопоэтина (ТЕМ), которые происходят из неклассических моноцитов, также вносят вклад в ангиогенез опухоли (Venneri MA et al. 2007).

Эти исследования ясно демонстрируют, что в контексте заболевания моноциты часто играют двойную роль и могут быть ключевыми терапевтическими мишенями для лечения заболевания.

Вернуться наверх

Дальнейшее чтение моноцитов

Рекомендации

1. Auffray C et al.(2007). Мониторинг кровеносных сосудов и тканей популяцией моноцитов с патрулирующим поведением. Science 317, 666-670.
2. Auffray C et al. (2009). CX3CR1 ⁺ CD115 ⁺ CD135 ⁺ общие предшественники макрофагов / DC и роль CX3CR1 в их ответе на воспаление. J Exp Med 206, 595-606.
3. Braunersreuther V et al. (2007). Дефицит Ccr5, но не Ccr1, снижает развитие индуцированного диетой атеросклероза у мышей. Артериосклер Thromb Vasc Biol 27, 373-379.
4. Камарго Дж. Ф. и соавт. (2013). Синдром MonoMAC у пациента с мутацией GATA2 : описание случая и обзор литературы. Clin Infect Dis 57, 697-699.
5. Combadie’re C et al. (2003). Снижение образования атеросклеротических поражений у мышей с двойным нокаутом CX3CR1 / аполипопротеин E. Тираж 107, 1009-1016.
6. Дозефф А.И., Парихар А. (2015). Субпопуляции моноцитов и их роль в прогрессировании опухоли. Д-р Субхра Бисвас (ред.), InTech, DOI: 10.5772 / 32615.
7. Датта П. и Нахрендорф М. (2014). Регуляция и последствия моноцитоза. Immunol Rev 262, 167-178.
8. Eis V et al. (2004). Хемокиновый рецептор CCR1, но не CCR5, опосредует рекрутирование лейкоцитов и последующий фиброз почек после односторонней обструкции мочеточника. J Am Soc Nephrol 15, 337-347.
9. Feng Y et al. (2011). Моноциты и болезнь Альцгеймера. Neurosci Bull 27, 115-122.
10. Fogg DK et al. (2006). Клоногенный предшественник костного мозга, специфичный для макрофагов и дендритных клеток.Наука 311, 83-87.
11. Francke A et al. (2011). Получение зрелых моноцитов мыши из гетерогенного костного мозга и описание их свойств. J. Histochem Cytochem 59, 813-825.
12. Geissmann F et al. (2003). Моноциты крови состоят из двух основных подгрупп с различными миграционными свойствами. Иммунитет 19, 71-82.
13. Geissmann F et al. (2010). Развитие моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Наука 327, 656-661.
14. Ginhoux F и Jung S (2014).Моноциты и макрофаги: пути развития и тканевый гомеостаз. Нат Рев Иммунол 14, 392-404.
15. Hettinger J et al. (2013). Происхождение моноцитов и макрофагов у преданного предшественника. Нат Иммунол 14, 821-830.
16. Hijdra D et al. (2012). Дифференциальная экспрессия TNFR1 (CD120a) и TNFR2 (CD120b) в субпопуляциях моноцитов человека. J Inflamm (Lond) 9, 38-43.
17. Indramohan M et al. (2012). Рекрутинг воспалительных моноцитов регулируется интерлейкином-23 во время системной бактериальной инфекции.Infect Immun 80, 4099-4105.
18. Jia T et al. (2008). Дополнительные роли MCP-1 и MCP-3 в CCR2-опосредованном рекрутинге воспалительных моноцитов во время инфекции Listeria monocytogenes . Дж. Иммунол 180, 6846-6853.
19. Karlmark KR et al. (2009). Рекрутирование в печень субпопуляции воспалительных моноцитов Gr1 + при повреждении печени способствует фиброзу печени. Гепатология 50, 261-274.
20. Kalmark KR et al. (2012). Моноциты в здоровье и болезни — Миниобзор. Eur J Microbiol Immunol (Bp) 2, 97-102.
21. Кауфманн А. и др. (2001). Повышение экспрессии CCR1 и CCR5 и усиление функционального ответа на MIP-1α во время дифференцировки моноцитов человека в макрофаги. J Leukoc Biol 69, 248-252.
22. Kawai T. et al. (2000). Тромбоэмболические осложнения после лечения моноклональными антителами против лиганда CD40. Нат Мед 6, 114.
23. Kumar AHS et al. (2013). Роль рецептора CX3CR1 в неоваскуляризации, управляемой моноцитами / макрофагами. PLoS One 8, e57230
24. Ley K et al.(2007). Попадание в очаг воспаления: обновился каскад адгезии лейкоцитов. Nat Rev Immunol 7, 678-689.
25. Lin et al. (2001). Колониестимулирующий фактор 1 способствует прогрессированию опухолей молочной железы до злокачественных новообразований. J Exp Med 193, 727-740.
26. Mack M et al. (2001). Экспрессия и характеристика хемокиновых рецепторов CCR2 и CCR5 у мышей. J Immunol 166, 4697-4704.
27. Meuret G et al. (1974). Кинетика моноцитопоэза человека. Кровь 44, 801-816.
28. Michaud JP et al.(2013). Визуализация in vivo в реальном времени показывает способность моноцитов очищать сосудистый бета-амилоид. Cell Rep 5, 646-653.
29. Натан CF (2008). Наследие Мечникова в 2008 году. Nat Immunol. 9, 695-698.
30. Пардолл Д. (2003). Считает ли иммунная система опухоли чужеродными или собственными? Анну Рев Иммунол 21, 807-839.
31. Peranzoni E et al. (2010). Гетерогенность и подгруппа клеток-супрессоров миелоидного происхождения. Curr Opin Immunol 22, 238-244.
32. Роббинс С.С. и соавт.(2012). Экстрамедуллярный гемопоэз генерирует моноциты Ly-6C ^high , которые инфильтрируют атеросклеротические поражения. Тираж 125, 363-374.
33. Сербина Н.В. и соавт. (2008). Опосредованная моноцитами защита от микробных патогенов. Анну Рев Иммунол 26, 421-452.
34. Ши С. и Памер Э. Г. (2011). Рекрутирование моноцитов во время инфекции и воспаления. Нат Рев Иммунол 11, 762-774.
35. Stefater JA et al. (2011). Полицейские-макрофаги Мечникова в развитии, гомеостазе и регенерации.Тенденции Мол Мед 17, 743-752.
36. Swirski FK et al. (2009). Идентификация моноцитов селезеночного резервуара и их размещение в очагах воспаления. Science 325, 612-616.
37. Tacke F и Randolph GJ (2006). Миграционная судьба и дифференциация субпопуляций моноцитов крови. Иммунобиология 211, 609-618.
38. Tacke F et al. (2007). Субпопуляции моноцитов по-разному используют CCR2, CCR5 и CX3CR1 для накопления в атеросклеротических бляшках. Дж. Клин Инвест 117, 185–194.
39. Thèriault P et al.(2015). Динамика моноцитов и микроглии при болезни Альцгеймера. Alzheimer’s Res Ther 7, 41.
40. Tsou CL et al. (2007). Критические роли CCR2 и MCP-3 в мобилизации моноцитов из костного мозга и привлечении их к участкам воспаления. Дж. Клин Инвест 117, 902-909.
41. ван Фурт Р. и Кон З. А. (1968). Происхождение и кинетика мононуклеарных фагоцитов. J Exp Med 128, 415-435.
42. ван Фурт Р. и Слюитер В. (1986). Распределение моноцитов крови между краевым и циркулирующим пулами.J Exp Med 163, 474-479.
43. van Furth R et al. (1972). Система мононуклеарных фагоцитов: новая классификация макрофагов, моноцитов и их клеток-предшественников. Bull World Health Organ 46, 845-852.
44. Venneri MA et al. (2007). Идентификация проангиогенных TIE2-экспрессирующих моноцитов (TEMS) в периферической крови человека и при раке. Кровь 109, 5276-5285.
45. Винх Д.К. и др. (2010). Аутосомно-доминантная и спорадическая моноцитопения с восприимчивостью к микобактериям, грибам, папилломавирусам и миелодисплазии.Кровь 115, 1519-1529 гг.
46. Сюй З. и Цзинь Б. (2010). Новый интерфейс, состоящий из гомологичных членов суперсемейства иммуноглобулинов с множеством функций. Cell Mol Immunol 7, 11-19.
47. Ян л и др. (2004). Экспансия миелоидных иммуносупрессорных клеток Gr1 + CD11b + в хозяине, несущем опухоль, напрямую способствует ангиогенезу опухоли. Cancer Cell 6, 409-421.
48. Ян Дж. И др. (2014). Дифференциация моноцитов и макрофагов: воспалительные моноциты кровообращения как биомаркеры воспалительных заболеваний.Биомарк Res 2, 1.
49. Zhang D et al. (2012). Тяжелая гипергомоцистеинемия способствует дифференцировке резидентных воспалительных моноцитов костного мозга и атеросклерозу у мышей с дефицитом LDLr / CBS. Цирк Res 111, 37–49.
50. Ziegler-Heitbrock L et al. (2010). Номенклатура моноцитов и дендритных клеток крови. Кровь 116, е74-80.

Вернуться наверх

Кровь человека в моноцитах

Моноциты являются крупнейшим типом лейкоцитов и участвуют в иммунных ответах на бактерии, вирусы и грибки.Они могут различать как макрофаги, которые могут проникать в ткани и выполнять защитные функции, или в дендритные клетки миелоидного происхождения, чтобы вызвать иммунный ответ. В крови человека существует как минимум три подкласса моноцитов в зависимости от их фенотипических рецепторов.

В Атласе крови у нас есть 189 генов, обогащенных клеточными линиями, и 27 из этих генов имеют наивысшую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов. Кроме того, 762 гена являются обогащенной группой клеточных линий, а еще 11 генов усилены в этой клеточной линии.В целом 962 гена повышены, и среди них 213 также показывают самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов.

Рис. 1. Распределение всех генов по пяти категориям специфичности на основе количества транскриптов в моноцитарной клеточной линии, а также в других 5 клеточных линиях

Таблица 1. Количество генов в подразделяемых категориях повышенной экспрессии в клонах моноцитов.

Таблица 2.Гены с наивысшим уровнем экспрессии в клеточном клоне моноцитов. «pTPM» показывает уровень транскриптов в виде кодирующих белок транскриптов на миллион. Оценка специфичности соответствует количеству, вычисленному как кратное изменение экспрессии линии моноцитов до второй по величине линии линии.

Классические моноциты

Классический моноцит характеризуется высоким уровнем экспрессии рецептора клеточной поверхности CD14 (моноцит CD14 ++ CD16α).

В Атласе крови у нас есть 18 классических генов, обогащенных моноцитами, и 1 из этих генов имеет самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов. Кроме того, 353 гена являются обогащенной группой типов клеток, а еще 125 генов усилены в этом типе клеток. Всего 496 генов повышены, и среди них 104 также показывают самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов.

Классические моноциты выделяли из PBMC.Остатки, клеточные агрегаты и большая часть лимфоцитов были удалены на основе профилей рассеяния. Оставшиеся NK, T- и B-клетки удаляли путем отбора клеток CD3neg / CD19neg / CD20neg / CD56neg. Классические моноциты были отсортированы как клетки CD14 + / CD16neg, и 50 000 — 190 000 клеток были отсортированы на образец для транскриптомного анализа путем секвенирования мРНК. Анализ транскриптома показывает, что 52% (n = 10180) всех белков человека (n = 19 670) экспрессируются в классических моноцитах, и 353 из этих генов демонстрируют повышенную экспрессию в классических моноцитах по сравнению с другими 17 типами клеток (см. Рисунок ниже). ).

Рис. 2. Распределение всех генов по пяти категориям специфичности на основе количества транскриптов в классических клетках моноцитов, а также в других 17 типах клеток.

Таблица 3. Количество генов в подразделяемых категориях повышенной экспрессии в классических клетках моноцитов.

Таблица 4.Гены с наивысшим уровнем экспрессии в классических клетках моноцитов. «pTPM» показывает уровень транскриптов в виде кодирующих белок транскриптов на миллион. Оценка специфичности соответствует количеству, вычисленному как кратное изменение классической экспрессии клеток моноцитов до второго по величине типа клеток.

Неклассические моноциты

Неклассический моноцит показывает низкий уровень экспрессии CD14 и дополнительную коэкспрессию рецептора CD16 (моноцит CD14 + CD16 ++).

В Атласе крови у нас есть 35 неклассических генов, обогащенных моноцитами, и 2 из этих генов имеют самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов.Кроме того, 300 генов являются обогащенной группой типов клеток, а дополнительные 163 гена усилены в этом типе клеток. Всего 498 генов повышены, и среди них 108 также показывают самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов.

Неклассические моноциты выделяли из PBMC. Остатки, клеточные агрегаты и большая часть лимфоцитов были удалены на основе профилей рассеяния. Оставшиеся NK, T- и B-клетки удаляли путем отбора клеток CD3neg / CD19neg / CD20neg / CD56neg.Неклассические моноциты были отсортированы как клетки CD14low / CD16 +, и 1000-26000 клеток были отсортированы на образец для транскриптомного анализа путем секвенирования мРНК. Анализ транскриптома показывает, что 49% (n = 9720) всех белков человека (n = 19 670) экспрессируются в неклассических моноцитах, и 300 из этих генов демонстрируют повышенную экспрессию в неклассических моноцитах по сравнению с другими 17 типами клеток. (см. рисунок ниже).

Рис. 3. Распределение всех генов по пяти категориям специфичности на основе количества транскриптов в неклассических клетках моноцитов, а также в других 17 типах клеток.

Таблица 5. Количество генов в подразделяемых категориях повышенной экспрессии в неклассических клетках моноцитов.

Таблица 6.Гены с наивысшим уровнем экспрессии в неклассических клетках моноцитов. «pTPM» показывает уровень транскриптов в виде кодирующих белок транскриптов на миллион. Оценка специфичности соответствует количеству, рассчитанному как кратное изменение экспрессии неклассических клеток моноцитов до второго по величине типа клеток.

Промежуточные моноциты

Промежуточный моноцит имеет высокий уровень экспрессии CD14 и низкий уровень экспрессии CD16 (моноциты CD14 ++ CD16 +).

В Атласе крови у нас есть 15 промежуточных генов, обогащенных моноцитами, и 4 из этих генов имеют наивысшую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов. Кроме того, 360 генов являются обогащенной группой типов клеток, а еще 142 гена усилены в этом типе клеток.В общей сложности 517 генов являются повышенными, и среди них 117 также показывают самую высокую экспрессию в крови или лимфоидных тканях при сравнении всех проанализированных тканей и органов.

Промежуточные моноциты выделяли из PBMC. Остатки, клеточные агрегаты и большая часть лимфоцитов были удалены на основе профилей рассеяния. Оставшиеся NK, T- и B-клетки удаляли путем отбора клеток CD3neg / CD19neg / CD20neg / CD56neg. Промежуточные моноциты были отсортированы как клетки CD14 + / CD16 +, и от 2000 до 5000 клеток были отсортированы на образец для транскриптомного анализа путем секвенирования мРНК.Анализ транскриптома показывает, что 51% (n = 9980) всех белков человека (n = 19 670) экспрессируется в промежуточных моноцитах, и 360 из этих генов демонстрируют повышенную экспрессию в промежуточных моноцитах по сравнению с другими 17 типами клеток (см. Рисунок ниже). ).

Рис. 4. Распределение всех генов по пяти категориям специфичности на основе количества транскриптов в промежуточных клетках моноцитов, а также в других 17 типах клеток.

Таблица 7. Число генов в подразделяемых категориях повышенной экспрессии в промежуточных клетках моноцитов.

Таблица 8.Гены с наивысшим уровнем экспрессии в промежуточных клетках моноцитов. «pTPM» показывает уровень транскриптов в виде кодирующих белок транскриптов на миллион. Оценка специфичности соответствует количеству, рассчитанному как кратное изменение промежуточной экспрессии клеток моноцитов по отношению ко второму по величине типу клеток.

Анализ крови | Общество лейкемии и лимфомы Канады

Подсчет клеток крови дает вашему врачу важные сведения о состоянии вашего здоровья до, во время и после лечения. Сами по себе анализы крови не могут определить, есть ли у вас рак крови, но они могут предупредить вашего врача, если потребуется дальнейшее обследование.

Ваш анализ крови (количество и типы клеток, циркулирующих в вашей крови) измеряется с помощью лабораторных тестов, для которых требуется небольшой образец крови.

Кровь состоит из нескольких типов клеток:

• Эритроциты , иногда называемые эритроцитами, улавливают кислород, когда кровь проходит через легкие, и выделяют его клеткам организма.
• Белые клетки , иногда называемые лейкоцитами, помогают бороться с бактериями и вирусами.
• Тромбоциты помогают свертыванию крови в ответ на порез или рану.

CBC также проверяет гемоглобин и гематокрит:

• Гемоглобин — это белок, используемый эритроцитами для распределения кислорода по другим тканям и клеткам организма.
• Гематокрит относится к количеству вашей крови, которое занято эритроцитами.

Нормальный анализ крови

Нормальные показатели крови попадают в диапазон, установленный тестированием здоровых мужчин и женщин всех возрастов. Количество клеток сравнивается со здоровыми людьми того же возраста и пола. Почти все лабораторные отчеты включают «нормальный» диапазон или высокие и низкие «значения», чтобы помочь вам понять результаты тестов.

¹ Отношение гематокрита к гемоглобину составляет примерно 3 к 1.
² Нормальные диапазоны для беременных женщин отличаются от этих диапазонов.
³ Эти диапазоны предназначены для детей от младенческого до подросткового возраста; поговорите со своим врачом, чтобы узнать конкретные значения для младенцев и детей младшего возраста.

Дифференциал белых клеток

Дифференциальный подсчет, иногда называемый «различием», представляет собой разбивку различных типов белых клеток. Дифференциал белых клеток (WBC) также проверяет, выглядят ли белые клетки нормальными. Пять типов лейкоцитов и примерный процент, который они составляют в крови:

• нейтрофилов (от 55% до 70%)
• Кольцевые нейтрофилы (от 0% до 3%)
• Лимфоциты (от 20% до 40%)
• Моноциты (от 2% до 8%)
• Эозинофилы (от 1% до 4%)
• Базофилы (0.От 5% до 1%)

До тех пор, пока детям не исполнится 4 года, процент лимфоцитов в крови у них выше, чем у взрослых.

Как рак крови влияет на анализ крови

Рак крови может влиять на количество клеток крови разными способами, снижая или увеличивая показатели. Если вы в настоящее время получаете лечение рака, такое как химиотерапия, лекарственная терапия или лучевая терапия, это повлияет на ваши показатели крови. Показатели крови обычно возвращаются к норме после завершения лечения.

Следует ли вам отслеживать свои показатели крови?

Некоторые люди хотят знать результаты своих анализов крови, чтобы они могли принять профилактические меры для защиты своего здоровья или того, что вызывает их симптомы. Например:

• Если у вас анемия в результате низкого количества эритроцитов, вы поймете, почему у вас низкий уровень энергии или вы не можете выполнять повседневные задачи.
• Если у вас низкое количество лейкоцитов и у вас поднялась температура, вы должны незамедлительно обратиться к врачу.
• Если у вас слишком низкое количество тромбоцитов, у вас может появиться кровотечение или синяк, поэтому вы можете избегать занятий, которые могут привести к травме.

Нетраковые состояния

Около 5 процентов здоровых людей будут иметь результаты анализов за пределами «нормального» диапазона. Если один или несколько из ваших показателей кровяных телец выше или ниже нормы, ваш врач попытается выяснить, почему. Многие доброкачественные заболевания могут способствовать низкому или высокому количеству клеток крови, как это показано в таблице ниже.

моноцитов отвечают на высокий уровень жира в крови, ведущий к повреждению тканей

В новом исследовании, озаглавленном «Липопротеины, богатые триглицеридами, модулируют распределение и экстравазацию моноцитов Ly6C / Gr1low», ученые обнаружили, что моноцитов, ключевых клеток иммунной системы система, в ответ на высокий уровень жира в крови может увеличить повреждение тканей органов по всему телу .Исследование было опубликовано в журнале Cell Reports .

Часть иммунной системы , моноцитов представляют собой гетерогенную популяцию лейкоцитов , ответственных за поддержание и восстановление целостности ткани . Накопление насыщенных жиров в крови создает гиперлипидемическую среду, где моноциты, как было показано, поглощают избыточные липиды, что приводит к их активации через несколько сигнальных путей, что приводит к повышенной секреции провоспалительных цитокинов .Однако остается неясным, какие липиды вызывают изменения моноцитов, равно как и то, какой тип моноцитов реагирует на это увеличение липидов.

Группа ученых Имперского колледжа Лондона занялась этими вопросами и изучила мышей с необычно высоким уровнем насыщенных жиров, циркулирующих в их крови. Доктор Кевин Вуллард, один из ведущих авторов исследования, объяснил в выпуске новостей : «Мышей, которых мы изучали, лечили лекарством, которое заставляло их накапливать чрезвычайно высокий уровень жира в крови.Хотя это необычно, у людей иногда действительно есть измерения, приближающиеся к этим уровням, либо из-за унаследованного состояния, либо из-за употребления жирной пищи ».

Команда обнаружила, что по мере того, как жир накапливается в органах по всему телу, моноциты трансформируются в другие иммунные клетки, макрофагов , а клетки в тканях поглощают жир и превращаются в «пенистых клеток» . И макрофаги, и пенистые клетки секретируют более высокие уровни хемокина CCL4 , тем самым стимулируя экстравазацию моноцитов крови и их накопление в тканях.Авторы показали, что постоянный высокий уровень насыщенных жиров способствует этому процессу. Особенно интересен тот факт, что авторы наблюдали, что один конкретный тип моноцитов опосредует это явление.

Таким образом, в будущем пациенты с риском сердечно-сосудистых заболеваний из-за высокого уровня жира в кровотоке могут получать терапевтический агент, нацеленный на этот конкретный тип моноцитов, тем самым предотвращая повреждение, вызванное их накоплением в тканях.

Доктор.Woollard прокомментировал эти результаты: «Очень интересно видеть, что все моноциты, которые мигрируют в ткани, относятся к одному типу, а это означает, что мы действительно можем разработать лекарства, которые изменяют это поведение. Интересно, что люди с определенными иммунными нарушениями, влияющими на моноциты, включая некоторые воспалительные и аутоиммунные заболевания, такие как волчанка, могут иметь неожиданно высокий уровень насыщенных жиров в крови, а также с большей вероятностью страдают сердечными приступами и инсультами в более молодом возрасте.”