6Дек

Пцр хеликобактер пилори: Анализ кала ПЦР на выявление хеликобактера в Челябинске

Содержание

ПЦР. Helicobacter pylori, качественное определение

Анализ на выявление антител к Helicobacter pylori IgG класса (количественное определение!!!) – это эффективный способ диагностики желудочных патологий. Эти антитела начинают вырабатываться через 3 – 4 недели после инфицирования. Кроме того, если результаты выдаются в количественных единицах (U/ml), такой анализ можно использовать для оценки эрадикации (уничтожения) Helicobacter pylori в процессе лечения.

Выявление антител к Helicobacter pylori IgG (качественно) классу укажет на острое течение заболевания. Выявление же антигенов Helicobacter pylori или ДНК этой бактерии – напрямую указывает на наличие возбудителя в организме.

Зачем назначают исследования?

Для диагностики инфекции Helicobacter pylori у пациентов с гастритом, язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция.

Биоматериал исследования

Слюна, желудочный сок.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Для исследования необходимо самостоятельно собрать порцию слюны в контейнер. Указать на пробирке время взятия пробы.

За сутки до взятия пробы следует исключить употребление спиртных напитков, кофеина, алкоголя. В течение одного часа до сбора слюны не курить. За 30 минут до сбора – воздержаться от приема пищи, жевательной резинки, нельзя пользоваться зубной нитью и чистить зубы. За десять минут до сбора слюны ополоснуть рот водой.

Желудочный сок – забор проводится врачом.

Что может повлиять на результат?

Лечение препаратами тетрациклина, пенициллина (аминопенициллины), макролидами (кларитромицин, азитромицин) и метронидазолом может приводить к получению ложноотрицательного результата.

Синонимы

ПЛР. Helicobacter pylori, якісне визначення.

Хеликобактер [полимеразная цепная реакция в режиме реального времени].

H. pylori, Helicobacter pyloridis, DNA [real-time polymerase chain reaction, RT-PCR, quantitative RT-PCR, qPCR, qRT-PCR].

Что означают результаты? Референтные значения

Положительный результат:

Отрицательный результат:

отсутствие H. pylori-инфекции.

Референтные значения:

Не обнаружено.

Кто назначает исследования?

Гастроэнтеролог, педиатр, врач общей практики.

Тест на helicobacter pylori в СПб

Описание темы:

Рекомендуем сначала ознакомится с материалом: Описание работы личного кабинета

При обращении указывайте ФИО+дата рождения или регистрационный номер из договора.

Обращения обрабатываются только по будним дням в течение 2-х суток.

При обращении обязательно указывайте лабораторный номер (6 цифр под штрих-кодом)!

Обращаем Ваше внимание, что рассылка результатов анализов по электронной почте осуществляется по готовности в районе 13.00 и 18.00.

Рассылка ответов ПЦР на коронавирус  — с 19.00 до 20.00.

Укажите, пожалуйста, свою специальность и контактный телефон (просьба не оставлять в данном сообщении своих полных персональных данных).

Здесь Вы можете задать краткий вопрос и получить краткий ответ врача-специалиста. Но поставить диагноз, назначить лечение, дать рекомендации по приёму лекарств и т.д. врач сможет только при Вашем личном посещении. Расшифровка результатов исследований,  проводится врачом вместе с другими клиническими данными и возможна только на приеме.

В поле «ваш вопрос» укажите телефон, на который вам может перезвонить оператор колл-центра.

Звонки выполняются в часы работы колл-центра: Будни: 8.00 — 21.00, Выходные: 8.00 — 20.00

 

Записаться на приемы врачей, УЗИ, ФГДС и мазок на коронавирус можно в соответствующих разделах или по кнопкам.

Чтобы отменить/перенести запись  — нужно позвонить по телефону медцентра или колл-центра 600-22-10 или оставить свой контактный телефон (просьба не оставлять в данном сообщении своих полных персональных данных).

В данном разделе можно оставить заявку на заключение договора только на выполнение анализов и услуг компанией МедЛаб.

Для коммерческих предложений по поставкам просьба использовать тему «Реклама»

Для оперативного разбора ситуации укажите, пожалуйста, свой регистрационный номер из договора (в разделе реквизиты заказчика), место, дату обращения и контактный телефон (просьба не оставлять в данном сообщении своих полных персональных данных).

Правила подготовки к УЗИ и др. процедурам можно уточнить тут

Мы оставляем за собой право не отвечать на неконкретные вопросы, на вопросы по рекламе и снабжению, не имеющие отношения к содержанию сайта, а также, находящиеся вне компетенции технической службы, а также на вопросы, заданные в неуважительной форме.

ПЦР диагностика бактерии Хеликобактер пилори

ПЦР диагностика Helicobacter pylori в анализе крови


ПЦР диагностика Helicobacter pylori проводят с целью обнаружения бактерий, которые вызывают болезни слизистой оболочки органов.

ПЦР или полимеразная цепная реакция — это высокоточный, современный метод обнаружения бактериальной клетки. Идентифицировать возбудителя инфекции можно, даже если он присутствует в незначительной концентрации в биологическом материале. Метод основан на многократном клонировании генома и выявлении даже скрытой инфекции.

Helicobacter pylori (Хеликобактер пилори) — это бактериальная грамотрицательная клетка, которая паразитируя на слизистых оболочках желудка и/или кишечника, вызывает их воспаление. Бактерия вырабатывает токсичные вещества в процессе своей жизнедеятельности и с течением времени воспаления (поражённые места Helicobacter pylori ) могут преобразоваться в язвы, эрозии и даже новообразования.


Когда проводят ПЦР диагностику?


ПЦР диагностику инфекций, которые могут быть вызваны бактериальной клеткой Хеликобактер Пилори, проводят в следующих ситуациях:

Как выявляют Хеликобактер Пилори?


Для проведения ПЦР анализа выявления Хеликобактер Пилори важно правильно подготовиться:
  1. Кровь сдают утром натощак.
  2. Последний прием пищи рекомендован вечером, накануне сдачи анализа.
  3. В день сдачи анализа ничего не кушать. Сладкие чай, кофе и соки запрещены.
  4. За час до анализа не нужно курить.
  5. За день до проведения анализа после консультации с врачом, стоит отменить препараты, направленные на борьбу с Helicobacter pylori.
Биологическим материалом служит венозная кровь, которую возьмут из локтевой вены в лаборатории для анализа.

Расшифровка ПЦР диагностики


Результатами проведения ПЦР анализа выявления Helicobacter pylori являются следующие варианты:
  1. Отрицательный результат  — отсутствие бактериальной клетки в крови.
  2. Положительный результат — бактерии Helicobacter pylori в крови обнаружены. В этом случае говорят об инфицировании организма.
Далее проводят подсчет бактерий, чтобы оценить клиническую значимость. Это необходимо, так как принято считать, что у преобладающего числа людей в крови есть эта бактериальная клетка, но болезнь она может вызвать не всегда.
  • Если концентрация бактерий в крови менее, чем 0,9 ед/мл, то врачи считают такое количество клинически незначимым.
  • Если показатель составляет 0,9-1,1 ед/мл, то говорят о средней степени клинической значимости (возможно развитие заболеваний).
  • При обнаружении более 1,1 ед/мл, говорят о высокой концентрации и активности бактерий в организме.
Инфекции, которые вызывают бактерии Хеликобактер Пилори, многочисленны и широко распространены. Для своевременного и правильного лечения патологий желудочно-кишечного тракта, необходимо периодически сдавать кровь для дифференциальной диагностики возбудителя инфекций. Правильная подготовка к сдаче анализа способствует получению точных результатов.

Хеликобактер пилори, определение ДНК в биоптате слизистой желудка и/или двенадцатиперстной кишки (Helicobacter pylori, DNA, Bioptates of Gastric Mucosa and/or Duodenum, PCR)

Исследуемый материал биоптат/биоптаты слизистой оболочки желудка и/или двенадцатиперстной кишки.

Метод определения полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени.

Определение ДНК Хеликобактер пилори в биоптате слизистой желудка и/или двенадцатиперстной кишки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени.

Helicobacter pylori (H. pylori) – спиралевидная бактерия, которая обитает на слизистой оболочке желудка, прикрепляясь к ворсинкам эпителия. Инфицирование человека H. pylori широко распространено. По оценкам эпидемиологов, присутствие этой бактерии в желудке можно обнаружить примерно у половины населения планеты, а в некоторых регионах у 80-100% популяции. У инфицированных носителей Helicobacter pylori могут не обнаруживаться симптомы заболевания. При этом существует корреляция между наличием бактерии и подтвержденными функциональными состояниями, гастроинтестинальными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, такими как диспепсия, хронический и атрофический гастрит, язвенная болезнь, рак желудка. Вероятность развития таких угрожающих состояний зависит от штамма H. pylori и факторов его вирулентности, индивидуальных особенностей организма и характера реакций на присутствие H. pylori, влияния условий жизни, в частности, диеты. Данную инфекцию успешно элиминируют (эрадикация H. pylori), но это не исключает вероятности повторного инфицирования в будущем. Вопрос о необходимости эрадикации H. pylori решается индивидуально. Тактика врача во многом зависит от клинических проявлений инфекции и, что особенно важно, наличия патологических изменений слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

Аналитические показатели: чувствительность определения ДНК H. pylori – 100 копий в образце. Специфичность – 100%.

 

Литература

  • Баранская Е.К., Ивашкин В.Т., Шептулин А.А. Париет в лечении язвенной болезни, симптоматических гастродуоденальных язв и функциональной диспепсии. Гл. 4., с. 75. В кн. Профилактика и лечение хронических заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Под. ред. акад. РАМН В.Т. Ивашкина. 2-е издание. — М.: Изд. «МЕДпресс-информ». 2013:152. ISBN 978-5-98322-905-1
  • Исаков В.А. Диагностика и лечение инфекции, вызванной Helicobacter pylori: IV Маастрихтское соглашение. Новые рекомендации по диагностике и лечению инфекции H. pylori – Маастрихт IV (Флоренция). Best Clinical Practice. Русское издание. 2012;2:4-23.
  • Chung W.C., Jeon E.J., Oh J.H., Park J.M., Kim T.H., Cheung D.Y., Kim B.W., Kim S.S., Kim J.I. Dual-priming oligonucleotide-based multiplex PCR using tissue samples from the rapid urease test kit for the detection of Helicobacter pylori in bleeding peptic ulcers. Digestive and Liver Disease. 2016;4. pii: S1590-8658(16)30394-2. doi: 10.1016/j.dld.2016.04.012.
  • Du L.J., Chen B.R., Kim J.J., Kim S., Shen J.H., Dai N. Helicobacter pylori eradication therapy for functional dyspepsia: Systematic review and meta-analysis. World Journal of Gastroenterology. 2016;22(12):3486-3495. doi: 10.3748/wjg.v22.i12.3486.
  • Helicobacter pylori and gastric or duodenal ulcer. Prescrire International. 2016;25(167):18-23.
  • Schulz C., Schütte K., Malfertheiner P. Helicobacter pylori and Other Gastric Microbiota in Gastroduodenal Pathologies. Digestive Diseases. 2016;34(3):210-216. doi: 10.1159/000443353.
  • Seo J.H., Hong S.J., Kim J.H., Kim B.W., Jee S.R., Chung W.C., Shim K.N., Baik G.H., Kim S.S., Kim S.G., Kim J.I. Long-Term Recurrence Rates of Peptic Ulcers without Helicobacter pylori. Gut Liver. 2016;4. doi: 10.5009/gnl15262.

Дыхательный тест на хеликобактер пилори в Минске

Тест-система ХЕЛИКR-скан-М с индикаторной трубкой – это устройство, предназначенное для неинвазивной специфической экспресс- диагностики инфекции Helicobacter pylory. В состав диагностической системы входит одноразовая индикаторная трубка, компрессор и компьютерная программа обработки данных. В основе принципа работы системы положена простая биохимическая реакция расщепления мочевины на аммиак и углекислый газ специфическим хеликобактерным ферментом – уреазой.

В отличие от дыхательных уреазных тестов с мочевиной13С/14С (с радиоактивной меткой), ХЕЛИКR-скан-М система предполагает использование стабильной (нерадиоактивной) мочевины, что делает тест доступным для широкого применения в практике педиатра и семейного врача. При этом чувствительность и специфичность ХЕЛИКR-скан-М теста составляет 95% и 97% соответственно, что сопоставимо с диагностическими характеристиками дыхательных тестов с радиоактивной меткой (95% и 96% соответственно).

«ХЕЛИКR-скан рекомендован Научным обществом гастроэнтерологов России, соответствует европейским стандартам качества (СЕ), что подтверждено многочисленными наградами за инновации в медицинской диагностике. При соблюдении всех правил подготовки ХЕЛИКR-скан тест гарантирует получение достоверного и быстрого результата» Ассоциация Медицины и Аналитики.

Правила подготовки к дыхательному тесту на хеликобактер

  1. Обследование проводят утром строго натощак: последний приём пищи должен быть не менее чем за 12 часов до исследования. Он должен быть лёгким с исключением мяса рыбы и грибов;
  2. Категорически нельзя принимать следующие лекарственные препараты:
  3. Антибиотики в течение 4-6 недель перед обследованием;
  4. Антациды (ингибиторы протонной помпы или h3-блокаторы), противовоспалительные средства, антисекреторные препараты, препараты висмута, аналгетики в течение 14 дней перед обследованием;
  5. Нельзя принимать спиртные напитки в течение 3-х суток перед обследованием;
  6. Нельзя есть бобовые (фасоль, горох, чечевицу, сою) в течение 3-х суток перед исследованием;
  7. В день обследования необходимо отказаться от жевательной резинки;
  8. Нельзя курить за 3 часа до обследования. После курения необходимо почистить зубы и тщательно прополоскать рот;
  9. Утром перед обследованием необходимо почистить зубы и тщательно прополоскать рот.

При несоблюдении данных правил подготовки могут быть получены как ложно отрицательные, так и ложноположительные результаты!

Рекомендации ВГО (Всемирной Гастроэнторологической Организации, 2010) по диагностике хеликобактерной инфекции

  • в странах с высоким уровнем распространённости Hp и заболеваемости раком желудка для пациентов моложе 50 лет рекомендован эмпирический подход «тестируй -лечи»;
  • для пациентов 50 лет и старше для диагностики Hp и исключения злокачественных новообразований верхних отделов ЖКТ, необходимо проведение эндоскопического исследования;
  • дыхательный уреазный тест и анализ антигена в кале рекомендованы для диагностики Hp до и после лечения, как высоко чувствительные, высокоспецифичные не инвазивные и недорогостоящие методы.

Что такое Инфекция Хеликобактер пилори?

Оценка ПЦР в реальном времени на выявление ДНК Helicobacter pylori в кале при коинфекции кишечными паразитами: сравнительное исследование методов выделения ДНК | BMC Microbiology

  • Peters BM, Jabra-Rizk MA, O’May GA, William Costerton J, Shirtliff ME. Полимикробные взаимодействия: влияние на патогенез и болезни человека. Clin Microbiol Rev. 2012;25(1):193–213.

    Артикул Google ученый

  • Gravina AG, Zagari RM, De Musis C, Romano L, Loguercio C, Romano M.Helicobacter pylori и внежелудочные заболевания: обзор. Мир J Гастроэнтерол. 2018;24(29):3204–21.

    КАС Статья Google ученый

  • Салих Б. Инфекция Helicobacter pylori в развивающихся странах: как долго это бремя? Саудовская J Гастроэнтерология. 2009;15(3):201–7.

    Артикул Google ученый

  • Liao CW, Fu CJ, Kao CY, Lee YL, Chen PC, Chuang TW и др.Распространенность кишечных паразитарных инфекций среди школьников в столичных районах Демократической Республики Сан-Томе и Принсипи, Западная Африка. Afr Health Sci. 2016;16(3):690–7.

    Артикул Google ученый

  • Морейра Э.Д., Насри В.Б., Сантос Р.С., Матос Дж.Ф., де Карвалью В.А., Сильвани К.С. и др. Ассоциация инфекции Helicobacter pylori и лямблиоза: результаты исследования суррогатных маркеров фекального воздействия у детей.Мир J Гастроэнтерол. 2005;11(18):2759–63.

    Артикул Google ученый

  • Ankarklev J, Hestvik E, Lebbad M, Lindh J, Kaddu-Mulindwa DH, Andersson JO, et al. Распространенные коинфекции кишечной лямблией и хеликобактерной пилори у бессимптомных детей Уганды. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(8):e1780.

    Артикул Google ученый

  • Якуб Дж., Аббас З., Хан Р., Тарик К., Аван С., Бег М.А.Ассоциация Helicobacter pylori и протозойных паразитов у пациентов с хронической диареей. Бр J биомедицинских наук. 2018;75(3):105–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Кайсар МММ, Бриенен Э.Т., Джуарди Й., Сартоно Э., Язданбахш М., Вервейдж Дж.Дж. и др. Улучшенная диагностика Trichuris trichiura за счет использования процедуры взбивания шариков на образцах стула, консервированных этанолом, перед выделением ДНК и проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления кишечных паразитов.Паразитология. 2017; 144:965–74.

    КАС Статья Google ученый

  • Ayana M, Cools P, Mekonnen Z, Biruksew A, Dana D, Rashwan N, et al. Сравнение четырех протоколов выделения ДНК и трех протоколов сохранения для молекулярного обнаружения и количественного определения гельминтов, передающихся через почву, в стуле. PLoS Negl Trop Dis. 2019;13(10):e0007778.

    Артикул Google ученый

  • Andersen LOB, Röser D, Nejsum P, Nielsen HV, Stensvold CR.Необходимо ли дополнительное бисерное биение для выделения ДНК из яиц нематод с использованием протокола nuclisens easymag. Дж. Клин Микробиол. 2013;51(4):1345–1347.

    КАС Статья Google ученый

  • Лю Дж., Грац Дж., Амур С., Ншама Р., Валонго Т., Маро А. и др. Оптимизация количественных методов ПЦР для выявления энтеропатогенов. ПЛОС Один. 2016;11(6):e0158199.

    Артикул Google ученый

  • Platts-Mills JA, Gratz J, Mduma E, Svensen E, Amour C, Liu J, et al.Связь между количеством энтеропатогенов в стуле и заболеванием у танзанийских детей с использованием карт TaqMan Array: вложенное исследование случай-контроль. Am J Trop Med Hyg. 2014;90(1):133–8.

    Артикул Google ученый

  • Бекман Э., Сарачино И., Фиорини Г., Кларк С., Слепнев В., Патель Д. и др. Новый ПЦР-тест стула на Helicobacter pylori может прогнозировать резистентность к кларитромицину и эрадикацию инфекции с высокой скоростью. Дж. Клин Микробиол.2017;55(8):2400–5.

    КАС Статья Google ученый

  • Беер-Дэвидсон Г., Хиндие М., Мухсен К. Обнаружение Helicobacter pylori в образцах стула маленьких детей с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. Хеликобактер. 2018;23:1.

    Артикул Google ученый

  • Scaletsky ICA, Aranda KRS, Garcia GT, Goncalves MEP, Cardoso SR, Iriya K, et al. Применение анализа стула ПЦР в реальном времени для обнаружения Helicobacter pylori и тестирования чувствительности к кларитромицину у бразильских детей.Хеликобактер. 2011;16(4):311–5.

    КАС Статья Google ученый

  • Rasmussen LT, de Labio RW, Neto AC, Silva LC, Queiroz VF, Smith MAC, et al. Обнаружение Helicobacter pylori в биоптатах желудка, слюне и зубных бляшках больных диспепсией из Марилии, Сан-Паулу, Бразилия: наличие генов vacA и cagA. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2012;18(2):180–7.

    Артикул Google ученый

  • Осаки Т., Заман С., Йонезава Х., Лин И., Окуда М., Нодзаки Э. и др.Влияние местной микробиоты кишечника на внутрисемейную инфекцию Helicobacter pylori в Японии. Фронт Иммунол. 2018;9:287.

    Артикул Google ученый

  • Пуз С., Иннерхофер А., Рамхартер М., Хефнер М., Хиршль А.М., Ковач З. и др. Новый неинвазивный метод генотипирования Helicobacter pylori с использованием образцов стула. Гастроэнтерология. 2008;135(5):1543–51.

    КАС Статья Google ученый

  • Ногучи Н., Римбара Э., Като А., Танака А., Токунага К., Каваи Т. и др.Обнаружение смешанной резистентной и чувствительной к кларитромицину Helicobacter pylori с помощью гнездовой ПЦР и прямого секвенирования ДНК, выделенной из фекалий. J Med Microbiol. 2007; 56 (часть 9): 1174–80.

    КАС Статья Google ученый

  • Римбара Э., Сасацу М., Грэм Д.Ю. ПЦР-выявление Helicobacter pylori в клинических образцах. Методы Мол Биол. 2013; 943: 279–87.

    КАС Статья Google ученый

  • Сеид А., Тамир З., Касанев Б., Сенбетай М.Коинфекция кишечными паразитами и Helicobacter pylori среди взрослых пациентов с симптомами верхних отделов желудочно-кишечного тракта, посещающих больницу Меканесалем, Северо-Восточная Эфиопия. Примечания BMC Res. 2018;11(1):144.

    Артикул Google ученый

  • Ek C, Whary MT, Ihrig M, Bravo LE, Correa P, Fox JG. Серологические доказательства того, что аскариды и токсоплазма влияют на воспалительные реакции на Helicobacter pylori у колумбийцев. Хеликобактер. 2012;17(2):107–15.

    КАС Статья Google ученый

  • Долан Б., Беркитт-Грей Л., Шовелин С., Бурк Б., Драмм Б., Роуленд М. и др. Использование образцов стула позволяет выявить разнообразие штаммов Helicobacter pylori в когорте подростков и членов их семей в развитой стране. Int J Med Microbiol. 2018;308(2):247–55.

    Артикул Google ученый

  • Монтейро Л., Грас Н., Видаль Р., Кабрита Х., Мегро Ф.Обнаружение ДНК Helicobacter pylori в фекалиях человека с помощью ПЦР: стабильность ДНК и удаление ингибиторов. J Микробиологические методы. 2001;45(2):89–94.

    КАС Статья Google ученый

  • ten Hove RJ, Verweij JJ, Vereecken K, Polman K, Dieye L, van Lieshout L. Мультиплексная ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения инфекции Schistosoma mansoni и S. haematobium в образцах стула, собранных в северном Сенегале. Trans R Soc Trop Med Hyg.2008;102(2):179–85.

    Артикул Google ученый

  • Нистерс ХГМ. Клиническая вирусология в режиме реального времени. Джей Клин Вирол. 2002; 25 (Приложение 3): S3–12.

    КАС Статья Google ученый

  • Perandin F, Pomari E, Bonizzi C, Mistretta M, Formenti F, Bisoffi Z. Оценка полимеразной цепной реакции в реальном времени для обнаружения trichostrongylus spp. ДНК из образцов фекалий человека.Am J Trop Med Hyg. 2018;98(3):768–71.

    КАС Статья Google ученый

  • Verweij JJ, Schinkel J, Laeijendecker D, Van Rooyen MAA, Van Lieshout L, Polderman AM. ПЦР в реальном времени для обнаружения Giardia lamblia. Молекулярные зонды. 2003;17(5):223–5.

    КАС Статья Google ученый

  • Verweij JJ, Oostvogel F, Brienen EAT, Nang-Beifubah A, Ziem J, Polderman AM.Краткое сообщение: распространенность Entamoeba histolytica и Entamoeba dispar в северной Гане. Trop Med Int Heal. 2003;8(12):1153–1156.

    Артикул Google ученый

  • Verweij JJ, Mulder B, Poell B, van Middelkoop D, Brienen EAT, van Lieshout L. ПЦР в реальном времени для обнаружения Dientamoeba fragilis в образцах фекалий. Молекулярные зонды. 2007;21(5–6):400–4.

    КАС Статья Google ученый

  • Verweij JJ, Canales M, Polman K, Ziem J, Brienen EAT, Polderman AM, et al.Молекулярная диагностика Strongyloides stercoralis в образцах фекалий с использованием ПЦР в реальном времени. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2009;103(4):342–6.

    КАС Статья Google ученый

  • Джотикумар Н., Да Силва А.Дж., Моура И., Кварнстром Ю., Хилл В.Р. Обнаружение и дифференциация Cryptosporidium hominis и Cryptosporidium parvum с помощью двойного анализа TaqMan. J Med Microbiol. 2008; 57 (часть 9): 1099–105.

    КАС Статья Google ученый

  • Obeng BB, Aryeetey YA, De Dood CJ, Amoah AS, Larbi IA, Deelder AM, et al.Применение тест-полоски с циркулирующим катодным антигеном (CCA) и ПЦР в реальном времени в сравнении с микроскопией для обнаружения Schistosoma haematobium в образцах мочи из Ганы. Энн Троп Мед Паразитол. 2008;102(7):625–33.

    КАС Статья Google ученый

  • Stensvold CR, Ahmed UN, Andersen LOB, Nielsen HV. Разработка и оценка родоспецифичного, основанного на зондах и контролируемого внутренним процессом ПЦР-анализа в реальном времени для чувствительного и специфичного обнаружения Blastocystis spp.Дж. Клин Микробиол. 2012; 50(6):1847–51.

    КАС Статья Google ученый

  • Liu J, Gratz J, Amour C, Kibiki G, Becker S, Janaki L, et al. Лабораторно разработанная карта массива Taqman для одновременного обнаружения 19 энтеропатогенов. Дж. Клин Микробиол. 2013;51(2):472–80.

    КАС Статья Google ученый

  • Ллевелин С., Инпанкеу Т., Нери С.В., Грей Д.Дж., Вервей Дж.Дж., Клементс А.К.А. и др.Применение мультиплексной количественной ПЦР для оценки распространенности и интенсивности кишечных паразитарных инфекций в контролируемом клиническом исследовании. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(1):e0004380.

    Артикул Google ученый

  • ПЦР в реальном времени улучшает обнаружение Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из пептической язвы

    Аннотация

    Предыстория и цели

    Гистологический и экспресс-тест на уреазу для выявления H.pylori в образцах биопсии, полученных во время эпизодов кровотечения из пептической язвы (PUB), часто дают ложноотрицательные результаты. Мы стремились выяснить, могут ли иммуногистохимия и ПЦР в реальном времени улучшить чувствительность этих биопсий.

    Пациенты и методы

    Мы отобрали 52 гистологически отрицательных, фиксированных формалином и залитых парафином биоптатов, полученных во время эпизодов ПНБ. Дополнительные тесты показали, что 10 из них были истинно отрицательными, а 42 — ложноотрицательными. Мы также выбрали 17 гистологически положительных образцов биопсии, полученных во время PUB, для использования в качестве контроля.Мы провели иммуногистохимическое окрашивание и ПЦР в реальном времени для 16S рРНК, ureA и 23S рРНК для генов H. pylori на всех образцах.

    Результаты

    Все контроли были положительными в отношении H. pylori во всех ПЦР-анализах и иммуногистохимическом окрашивании. Что касается 52 исходно отрицательных результатов биопсии, то все ПЦР-тесты были значительно более чувствительны, чем иммуногистохимическое окрашивание (p<0,01). Чувствительность и специфичность составляли 55% и 80% для ПЦР 16S рРНК, 43% и 90% для ПЦР ureA, 41% и 80% для ПЦР 23S рРНК и 7% и 100% для иммуногистохимического окрашивания соответственно.Комбинированный анализ ПЦР для двух генов был значительно более чувствительным, чем только ПЦР ureA или 23S рРНК (p<0,05), и незначительно лучше, чем ПЦР только 16S рРНК. Наилучшей комбинацией оказалась 16S рРНК+ureA с чувствительностью 64% и специфичностью 80%.

    Выводы

    ПЦР в реальном времени улучшает обнаружение инфекции H. p yl ori в гистологически отрицательных, фиксированных формалином и залитых парафином биоптатах, полученных во время эпизодов ПНБ. Низкая зарегистрированная распространенность H.pylori в PUB может быть связано с неспособностью обычных тестов обнаружить инфекцию.

    Образец цитирования: Рамирес-Ласаро М.Х., Ларио С., Касалотс А., Санфелиу Э., Бойкс Л., Гарсия-Иглесиас П. и др. (2011) ПЦР в реальном времени улучшает обнаружение Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из пептической язвы. ПЛОС ОДИН 6(5): е20009. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020009

    Редактор: Пере-Хоан Кардона, Fundació Institut Germans Trias i Pujol; Universitat Autònoma de Barcelona CibeRES, Испания

    Поступила в редакцию: 23 декабря 2010 г.; Принято: 19 апреля 2011 г.; Опубликовано: 20 мая 2011 г.

    Авторское право: © 2011 Ramírez-Lázaro et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

    Финансирование: Это исследование было поддержано грантами Instituto de Salud Carlos III (PI 05/1157 и PI 05/0664) и Societat Catalana de Digestologia. Мария Хосе Рамирес-Ласаро, Серхио Ларио и Лорето Бойкс являются штатными исследователями CIBERehd.CIBERed финансируется Instituto de Salud Carlos III. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Кровотечение из пептической язвы (PUB) является одним из самых тяжелых осложнений инфекции Helicobacter pylori [1]. Эрадикационная терапия эффективно предотвращает рецидив ПМК [2].Однако зарегистрированная распространенность инфекции H. pylori при кровоточащих язвах ниже, чем при некровоточащих язвах [3]. Поскольку тесты на H. pylori менее надежны в условиях ПМК [4], неизвестно, является ли эта более низкая распространенность подлинной или просто отражает недостаточную чувствительность диагностических тестов.

    Кроме того, косвенные данные свидетельствуют о том, что обычные тесты могут также не выявить H. pylori в других условиях; например, сообщалось, что H. pylori «отрицательных» MALT-лимфом излечиваются после эрадикационной терапии [5].В одном исследовании бактериальной микробиоты в желудке человека полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявила инфекцию H. pylori в образцах желудка от 19 из 23 субъектов; однако только 12 из них были положительными при обычных тестах [6]. Таким образом, высокочувствительные молекулярные подходы могут помочь обнаружить H. pylori в таких условиях, как PUB, рак желудка или MALT-лимфома, при которых диагностика H. pylori важна, но неуловима.

    ПЦР в реальном времени — это чувствительный и точный метод диагностики H.pylori инфекции. По сравнению с другими доступными методами диагностики H. pylori в клинических и исследовательских целях ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и специфичность для H. pylori в замороженных образцах пациентов с некровоточащей пептической язвой [7], [8]. ПЦР также намного лучше, чем гистология, при обнаружении H. pylori в свежезамороженных биоптатах желудка у пациентов с ПМК [9].

    Хотя свежие или замороженные образцы биопсии являются предпочтительными образцами для выделения нуклеиновых кислот, они требуют специального хранения и редко используются в клинической практике.Образцы, фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE), являются наиболее широко доступным материалом для ретроспективных клинических исследований. Учитывая их потенциал для геномного анализа, эти ткани представляют собой бесценный ресурс для исследований. ДНК, выделенная из образцов FFPE, также может быть использована в качестве мишени для ПЦР: несколько экспериментов подтвердили, что амплификация малых продуктов ПЦР является высокоэффективной и специфичной для обнаружения H. pylori [10], [11]. В этом контексте ПЦР для H. pylori в биоптатах FFPE оказалась достаточно точной [11], [12].Тем не менее, лучшие гены для обнаружения инфекции H. pylori в биоптатах FFPE не установлены. Потенциальными кандидатами являются гены 16S рибосомной РНК (16S рРНК) [13], уреазы А (ureA) [14] и гены 23S рибосомной РНК (23S рРНК) [15].

    В предыдущем исследовании мы обнаружили, что биопсия, полученная во время начальной эндоскопии, была отрицательной на H. pylori при гистологическом исследовании у 25% пациентов (58 из 232) с ЛМК. Однако у 82% из 52 пациентов, прошедших отсроченный [ 13 C]-уреазный дыхательный тест (УДТ) через четыре-восемь недель после кровотечения, были признаки инфекции, поэтому окончательная распространенность H.pylori приближается к 100% [16]. Другие авторы сообщают об аналогичных результатах отсроченных тестов [17]–[19], подтверждая низкую чувствительность и отрицательную прогностическую ценность обычных тестов на H. pylori во время острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта. В целом эти исследования показывают, что «идиопатические» кровоточащие язвы могут встречаться реже, чем сообщалось ранее [3].

    Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить потенциальную полезность ПЦР в реальном времени для улучшения обнаружения H.pylori в ложноотрицательных образцах FFPE от пациентов с PUB. Вторичной целью было сравнить чувствительность различных мишеней ПЦР и иммуногистохимического окрашивания для обнаружения H. pylori .

    Методы

    Заявление об этике

    Комитет по этике больницы де Сабадель одобрил протокол исследования. Образцы контрольных пациентов были получены проспективно, и как положительные, так и отрицательные контрольные пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.Что касается случаев PUB, пациенты были идентифицированы в результате ретроспективного исследования и образцов, полученных из залитых парафином образцов биопсии, хранящихся в отделении патологии больницы. У этих пациентов информированное согласие не было получено в соответствии с испанским законом 14/2007 о биомедицинских исследованиях. Согласно закону, архивные образцы могут быть использованы для биомедицинских исследований без информированного согласия, когда получение информированного согласия невозможно или крайне затруднено, при условии, что а) проводимое исследование представляет общий интерес, б) нет предварительного заявления пациента против использование образцов для исследования, c) конфиденциальность данных предоставляется и d) комитет по этике больницы оценивает и утверждает протокол исследования.

    пациентов

    Первоначально мы использовали гистологию для отбора H. pylori -негативных образцов антральной биопсии, полученных во время острой ПМК во время экстренной эндоскопии у 58 пациентов; шесть пациентов не завершили последующее наблюдение, и их образцы были исключены из анализа. Из оставшихся 52 пациентов 42 были положительными, а 10 — отрицательными в отношении H. pylori при [ 13 C]-UBT, выполненном через четыре-восемь недель после PUB. Антибиотики были прекращены по крайней мере за четыре недели, а ингибиторы протонной помпы (ИПП) — по крайней мере за две недели до [ 13 C]-UBT.Мы включили 17 гистологически положительных образцов от пациентов с PUB в качестве положительного контроля. Эти 69 пациентов (52 мужчины и 17 женщин; средний возраст 61,5±15,8 года; диапазон 22–90 лет) были включены в период с января 1995 г. по сентябрь 2000 г. Отделение болезней госпиталя де Сабадель [16]. Всем пациентам внутривенно вводили омепразол после поступления и в первые 24 часа проводили срочную эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта для диагностики и лечения кровотечения.Все образцы биопсии, проанализированные в этом исследовании, были получены в ходе этой первоначальной процедуры. В таблице 1 представлены характеристики пациентов, включенных в исследование.

    Мы также отобрали 32 отрицательных контроля из большей серии пациентов с диспепсическими симптомами, которым проводилась эндоскопия в период с 2006 по 2009 год [20], [21]. Все пациенты не принимали ИПП как минимум за две недели, а антибиотики прекращали не менее чем за четыре недели до эндоскопии. Чтобы убедиться, что контроли действительно не инфицированы, мы включили только тех, у кого были строго нормальные гистологические данные, включая отсутствие косвенных гистологических признаков H.pylori , такая как лимфоидные фолликулы или острый или хронический гастрит; кроме того, все контроли не имели признаков H. pylori в экспресс-тестах на уреазу, УБТ и фекальных тестах.

    Экстракция ДНК

    Мы получили образцы биопсии желудка FFPE, собранные во время начальной эндоскопии, из архивов отделения патологии. Из каждого образца вырезали три среза толщиной 10 мкм и помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл (Eppendorf, Гамбург, Германия). Каждый парафиновый блок содержал от одной до пяти антральных биопсий.ДНК экстрагировали, как описано Chomczynski и Sacchi [22]. Вкратце, парафин удаляли путем трехкратной промывки 1 мл ксилола в течение 5 минут с последующей регидратацией посредством трехкратной промывки 100% этанолом и двух промывок 70% этанолом. После каждого этапа ткань собирали центрифугированием при 16000×g в течение 3 минут. После последней промывки 70% этанолом осадок ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера, содержащего 100 ммоль/л хлорида натрия, 10 ммоль/л трис/HCl (pH 8,0), 25 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0.5% додецилсульфата натрия (Applichem, Дармштадт, Германия) и 100 мкг/мл протеиназы K (Roche Applied Science, Мангейм, Германия) и инкубировали при 50°C в течение ночи до полного растворения ткани. ДНК очищали смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25∶24∶1, объем/объем/объем) с последующим осаждением 2,5 объемами изопропанола в присутствии 0,1 объема 3 моль/л ацетата натрия и 5 мкг линейного акриламида. (Амбион, Остин, США). Осадок ДНК однократно промывали 70% этанолом, сушили и ресуспендировали в 50 мкл 10 ммоль/л Трис/HCl (pH 8), 0.1 ммоль/л ЭДТА.

    Бактериальные штаммы

    Для оценки специфичности ПЦР-анализов 16S рРНК, ureA и 23S рРНК 11 видов бактерий выращивали на колумбийском кровяном агаре с добавлением 5% овечьей крови (Biomerieux, Испания) при 37°C и соответствующих атмосферных условиях. Бактериальные виды были получены из клинических изолятов ( Staphylococcus epidermidis , Corynebacterium sp. , Proteus sp. , Candida albicans и Neisseria meningitidis) или из Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD) , США): синегнойной , , Enterococcus фекальный , кишечной палочки , золотистый стафилококк , пневмококк и гемофильной ) и Helicobacter Pylori штаммы J99 и 26695 (таблица 2).

    ПЦР в реальном времени

    ПЦР

    TaqMan использовали для амплификации фрагментов генов 16S рРНК и ureA, а ПЦР SyBR Green использовали для амплификации фрагментов гена 23S рРНК H. pylori и гена β-глобина человека. ПЦР в реальном времени проводили в термоциклере ABI 7500 (Applied Biosystems) при следующих условиях термоциклирования:

    1. ПЦР TaqMan для гена 16S рРНК: начальная инкубация урацил-ДНК-гликозилазы (UNG) при 37°C в течение 10 мин с последующей денатурацией при 95°C в течение 10 мин., и 40 циклов, состоящих из денатурации при 92°С в течение 15 с. с последующим отжигом/удлинением при 64°С в течение 1 мин.
    2. ПЦР TaqMan для гена UreA: начальная инкубация UNG при 37°C в течение 10 мин, затем денатурация при 95°C в течение 10 мин и 40 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 15 с, сенсорный отжиг от 60 °С до 57°С в течение 10 с (температурный спад 0,2°С) и удлинение при 72°С в течение 35 с.
    3. SyBR Green ПЦР для гена 23S рРНК H. pylori : Начальная инкубация UNG при 37°C в течение 10 мин.с последующей денатурацией при 95°С в течение 10 мин и 45 циклами, состоящими из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 60°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 35 с. После амплификации проводили стадию плавления.

    25 мкл реакционной смеси для ПЦР готовили из 12,5 мкл 2× SensiMix (dU) (Quantace LTD., Лондон, Великобритания), 0,5 мкл 50× UNG и 2,5 мкл ДНК для всех генов. Концентрации MgCl 2 составляли 5,5 мМ, 4,0 мМ и 3,0 мМ для генов 16S рРНК, ureA и 23S рРНК соответственно.Концентрации праймеров составляли 0,1 мкМ, 0,25 мкМ и 0,4 мкМ для генов 16S рРНК, ureA и 23S рРНК соответственно. Концентрация зонда TaqMan составляла 4,0 нМ для 16S рРНК и 20 нМ для ureA.

    зонда TaqMan были помечены флуоресцентными красителями 6-карбоксифлуоресцеином (6-FAM) на 5′-конце и 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3′-конце; зонды очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией. Праймеры и зонды были приобретены у Stabvida Lda. (Санкт-Антонио де Оэйрас, Португалия).Соответствующие последовательности перечислены в таблице 3.

    Амплификация β-глобина человека

    Качество ДНК, выделенной из образцов биопсии, было подтверждено первоначальной ПЦР. Мы использовали ПЦР для каждого экстракта ДНК для амплификации фрагмента размером 110 п.н. из области гена β-глобина [23]. Все тесты проводились двумя опытными молекулярными биологами, которые не знали о статусе H. pylori образцов и результатах других тестов.

    Гистологические предикторы инфекции и иммуногистохимический анализ

    Два специализированных патологоанатома (AC, ES), которые не знали об окончательном диагнозе H.pylori проанализировали биоптаты и зафиксировали наличие активного гастрита (да/нет), хронического гастрита (да/нет), лимфоидных агрегатов (да/нет), атрофического гастрита (да/нет) и кишечной метаплазии (да/нет). нет). Также было выполнено специфическое иммуногистохимическое окрашивание, чтобы убедиться, что H. pylori не обнаруживаются под микроскопом. Срез толщиной 3 мкм из тех же парафиновых блоков, что и для ПЦР, фиксировали на предметных стеклах, покрытых клеем. Образцы инкубировали с первичными антителами (поликлональные кроличьи анти- Helicobacter pylori ) в разведении 1/500, а биоптаты иммуногистохимически окрашивали H.pylori с использованием методики Envision™ Flex/Hrp. Первичные и вторичные антитела были приобретены у Dako (Glostrup, Дания).

    Статистический анализ

    Три метода ПЦР были подтверждены ПЦР-анализом трех праймеров ПЦР в 17 положительных и 32 отрицательных контролях.

    Распространенность инфекции H. pylori , определенная с помощью различных методов ПЦР, указывается в процентах (95% доверительный интервал) для отдельных методов ПЦР и для комбинаций двух или более методов.У 52 пациентов с дальнейшим наблюдением мы рассчитали чувствительность, специфичность, положительные прогностические значения (PPV) и отрицательные прогностические значения (NPV) вместе с их 95% доверительными интервалами для гистологических параметров и различных методов ПЦР, используя результаты. отсроченного УБТ как золотого стандарта. Чувствительность и специфичность сравнивали с использованием теста McNemar, описанного Biswas [24]. Мы использовали критерий хи-квадрат для анализа различий в пропорциях между группами.Мы использовали SPSS 15.0.1 для Windows (SPSS Inc. Чикаго, Иллинойс) для всех анализов. Значимость была установлена ​​на уровне p<0,05.

    Результаты

    Видовая специфичность ПЦР-анализа

    Вся ДНК, полученная от видов Helicobacter , отличных от , была отрицательной для всех трех продуктов ПЦР; два штамма H. pylori были положительными для всех трех продуктов. Таблица 2 суммирует эти результаты.

    Валидация ПЦР-анализов

    Все образцы антральной биопсии из 17 положительных контролей были положительными во всех трех ПЦР-анализах.Все образцы антральной биопсии из 32 отрицательных контролей были отрицательными во всех трех ПЦР-анализах, за исключением образцов одного пациента, которые были положительными на ureA, и образцов другого пациента, которые были положительными на все три гена, таким образом повышая вероятность скрытой инфекции. обычными методами.

    Все образцы были положительными в отношении амплификации β-глобина, что указывает на отсутствие ингибиторов ПЦР.

    Распространенность инфекции по данным разных методов

    ПЦР в реальном времени дала положительный результат на 16S рРНК у 25 из 52 пациентов (48%) и на UreA и 23S рРНК у 19 из 52 (37%).Иммуногистохимический анализ выявил инфекцию только у трех (6%) больных. Чувствительность, специфичность, PPV и NPV для анализов ПЦР и иммуногистохимического окрашивания в этой группе по отношению к золотым стандартам отсроченного УДТ представлены в таблице 4. Мы не обнаружили связи между количеством биопсий в парафиновом блоке и частотой биопсий. Обнаружение H. pylori с помощью ПЦР.

    Таблица 4. Чувствительность, специфичность, положительное прогностическое значение (PPV), отрицательное прогностическое значение (NPV), положительное отношение правдоподобия и отрицательное отношение правдоподобия H.pylori диагностических тестов у пациентов с гистологически отрицательным PUB.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020009.t004

    Чувствительность всех ПЦР-анализов была значительно выше, чем у иммуногистохимического окрашивания, со значениями p в диапазоне от 0,01 до <0,001. Однако существенных различий между ПЦР-анализами не наблюдалось. Кроме того, количество «истинных» H. pylori -негативных случаев было слишком низким, чтобы можно было провести статистическое сравнение специфики.Все комбинации тестов ПЦР повышали чувствительность, но несколько снижали специфичность (табл. 4). Все комбинации ПЦР были значительно более чувствительными, чем только ПЦР-тест ureA (p<0,05) или только ПЦР-тест 23S рРНК (p<0,05), и незначительно лучше, чем только тест 16S рРНК. Существенных различий между комбинациями тестов ПЦР не наблюдалось.

    Кроме того, мы оценили прогностическую ценность различных гистологических параметров для инфекции H. pylori (таблица 5).Наличие острого гастрита было единственным гистологическим параметром с приемлемой чувствительностью и специфичностью для выявления активной инфекции H. pylori .

    Таблица 5. Чувствительность, специфичность, положительные (PPV) и отрицательные (NPV) прогностические значения, а также положительные и отрицательные отношения правдоподобия гистопатологических параметров для диагностики инфекции в H. pylori отрицательных биоптатах у пациентов с PUB.

    https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0020009.t005

    Обсуждение

    Мы обнаружили, что ПЦР в реальном времени выявляет H. pylori более чем в 2/3 гистологически отрицательного образца, что является гораздо более чувствительным, чем обычная гистологическая идентификация бактерий или иммуногистохимия, и может быть полезной альтернативой для выявление инфекции H. pylori у пациентов с ПБ. Описанная здесь ПЦР в реальном времени имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что ее можно использовать в образцах FFPE, что позволяет обнаруживать H.pylori как в проспективных, так и в ретроспективных исследованиях.

    В дополнение к показу того, что ПЦР полезна при острой ПМК, наше исследование подтверждает недавно оспоренное [25] классическое мнение о том, что даже небольшое количество полиморфноядерных нейтрофилов в биоптате желудка является почти верным индикатором активности H. pylori [26]. У пациентов с ПМК это утверждение остается верным, даже если бактерии не обнаруживаются с помощью прямой визуализации или иммуногистохимии.По этой причине обнаружение острого воспаления в биоптатах, отрицательных на H. pylori , должно побудить к дополнительным исследованиям.

    Наши результаты подтверждают, что инфекция H. pylori неуловима в PUB. Исследования методов диагностики H. pylori у пациентов с ЛМК выявили от 25% до 50% ложноотрицательных результатов при гистологическом исследовании биоптатов, полученных во время эпизодов кровотечения [4], [27]. Следовательно, текущие рекомендации рекомендуют либо более чувствительный диагностический анализ, либо отсроченное тестирование, чтобы исключить инфекцию [28].

    Хотя нет общепринятого объяснения снижения надежности диагностических тестов для H. pylori в условиях PUB, различные факторы могут привести к временному снижению плотности бактерий, что затруднит обнаружение. Во-первых, из-за бактерицидного действия сыворотки присутствие крови в желудке напрямую снижает плотность бактерий [29], [30]. Во-вторых, на точность экспресс-теста с уреазой в условиях PUB также может влиять присутствие альбумина в просвете желудка, который может предотвратить изменение цвета, действуя как буфер на индикатор pH [31].В-третьих, эти пациенты часто принимают ИПП, которые могут снизить бактериальную нагрузку [32]. Наконец, промывание желудка большим объемом перед эндоскопией может привести к временному удалению бактерий [33].

    По сравнению с другими инвазивными методами ПЦР обеспечивает очень чувствительную и точную диагностику H. pylori у пациентов с некровоточащими пептическими язвами [13], [34]. Однако в нескольких исследованиях изучалась диагностическая точность ПЦР у пациентов с ЛМК [9], [35], [36]. Большинство из них указывают на то, что ПЦР более чувствительна, чем другие тесты для H.pylori в PUB, хотя они не оценивали ПЦР в реальном времени и не использовали биопсию FFPE. ПЦР в реальном времени имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной ПЦР, таких как короткое рабочее время, высокая специфичность и низкий риск перекрестного заражения. Однако из-за разнообразия генома H. pylori выбор конкретных праймеров имеет первостепенное значение. Мы использовали ПЦР для небольшой части генов 16S рРНК, ureA и 23S рРНК, которые, как сообщается, обладают высокой чувствительностью и специфичностью и хорошо сохраняются в образцах FFPE [13]–[15].Наши результаты показывают, что наиболее точным ПЦР-тестом на H. pylori у пациентов с ПНБ является либо комбинация 16S рРНК и ureA (чувствительность, специфичность, PPV и NPV 64%, 80%, 93% и 35%, соответственно) или сочетание всех трех целей (чувствительность, специфичность, PPV и NPV 67%, 60%, 88% и 30% соответственно).

    Поскольку ПЦР в реальном времени основана на обнаружении ДНК и не требует жизнеспособных бактерий, она является полезным дополнением к культивированию, золотому стандарту диагностики H.pylori , особенно когда антимикробное лечение уже начато [37]. ПЦР в реальном времени стоит недорого; действительно, это дешевле, чем гистология. Таким образом, стоимость использования ПЦР в реальном времени у пациентов, отрицательных на H. pylori при гистологическом исследовании, вероятно, будет компенсирована клиническими преимуществами, полученными в результате обнаружения инфекции в значительном проценте гистологически отрицательных биопсий. Кроме того, методы ПЦР постепенно включаются в рутинную работу микробиологических отделений, а некоторые ПЦР-тесты уже являются рутинными в клинической практике.Таким образом, включение тестов ПЦР в реальном времени в рутинное обследование гистологически отрицательных биопсий пациентов с ЛМК кажется возможным.

    Настоящее исследование ставит под сомнение предположение о том, что распространенность H. pylori в кровоточащих язвах ниже, чем в некровоточащих [3], [38]–[42]. В некоторых исследованиях даже сообщалось о росте распространенности идиопатических язв [43]. Однако в некоторых из этих исследований использовались отсроченные тесты на H. pylori или методы ПЦР. Поскольку ПЦР обнаружила H.pylori в более чем двух третях гистологически-отрицательных биопсий в нашей серии, разумно задаться вопросом, сколько «идиопатических» PUB, обнаруженных в предыдущих исследованиях, на самом деле были недодиагностированными H. pylori-, связанными с PUB. Истинная распространенность идиопатических язв и идиопатических ПМК еще предстоит определить.

    Некоторые моменты исследования заслуживают особого комментария: во-первых, хотя чувствительность ПЦР (диапазон 41–67%) может показаться низкой, важно учитывать, что изученные биопсии были отрицательными для H.pylori при гистологии. Таким образом, ПЦР не только выявила H. pylori во всех гистологически положительных контрольных биоптатах, но также обнаружила H. pylori в двух третях гистологически отрицательных образцов от пациентов с отсроченным положительным результатом 13 C- УБТ [16]. Точно так же, хотя специфичность может показаться относительно низкой, не существует идеального золотого стандарта для H. pylori , а также методов, способных выявить все случаи инфекции. Таким образом, поскольку ПЦР в реальном времени обладает высокой чувствительностью, вполне возможно, что по крайней мере один из пациентов, считавшихся ложноположительными при ПЦР, на самом деле был инфицирован и, следовательно, имел бы ложноотрицательные результаты отсроченного 13 C-UBT. мы использовали в качестве золотого стандарта.

    Это исследование посвящено выбранной субпопуляции пациентов с ЛМК с изначально отрицательными результатами гистологического исследования. В нашей среде такие пациенты редки, и поэтому их трудно рекрутировать. Это объясняет ограниченный размер нашей выборки и, следовательно, широкий 95% ДИ для чувствительности ПЦР (около ±15%). Тем не менее, размер выборки достаточно велик, чтобы продемонстрировать, что ПЦР гораздо более чувствительна, чем гистология или иммуногистохимия, и что наилучшие результаты наблюдаются при воздействии на два или три гена.

    Наконец, мы оценивали только образцы антральной биопсии. Гисберт и др. [2] предположили, что гистологическое исследование образцов как из антрального отдела, так и из тела желудка повысило диагностическую чувствительность с 70% до 83%. Однако предыдущее исследование [16] не выявило значительных преимуществ комбинации биопсии антрального отдела и тела желудка. В настоящем исследовании не было образцов тела для ПЦР-анализа, поэтому мы не могли проанализировать потенциальную полезность ПЦР или иммуногистохимического исследования образцов биопсии из тела.

    Наши результаты поднимают различные вопросы для дальнейших исследований. Распространенность инфекции H. pylori высока в южной Европе, как среди населения в целом, так и у пациентов с ПМК [44], [45]; Было бы интересно узнать, могут ли наши результаты быть подтверждены в регионах с низкой распространенностью, таких как Северная Европа, Канада или некоторые части Соединенных Штатов. Также было бы интересно оценить, полезна ли ПЦР в реальном времени для обнаружения H. pylori в других сценариях, когда инфекция часто неуловима, например, у пациентов с MALT-лимфомой желудка низкой степени злокачественности или раком желудка или даже у пациентов с неосложненная язва или диспепсия, получающая ИПП перед эндоскопией.Наконец, было бы интересно сравнить ПЦР в реальном времени с обычными тестами в невыбранной популяции пациентов с диспепсией.

    В заключение, наше исследование показывает, что ПЦР в реальном времени улучшает обнаружение H. pylori в биопсиях FFPE у пациентов с ЛМК и может использоваться для выявления инфекции H. pylori у пациентов с отрицательными результатами гистологического исследования. Наши результаты подтверждают предыдущие данные, которые предполагают, что значительный процент «идиопатических» кровоточащих язв на самом деле может быть ложноотрицательным результатом обычных тестов для обнаружения H.пилори .

    Благодарности

    Мы в долгу перед доктором Хорди Мартинес-Гомисом за предоставление штаммов H. pylori , а также перед Майклом Модсли и Джоном Гиба за их помощь с англичанами.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: MJR-L SL XC. Проведены эксперименты: MJR-L SL AC. Проанализированы данные: MJR-L SL XC. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: LB PG-I JS-D AM MG IS FS. Написал статью: MJR-L SL XC.Анализ и интерпретация данных и обзор гистологических препаратов: ES MRB-C.

    Каталожные номера

    1. 1. Suerbaum S, Michetti P (2002) Инфекция Helicobacter pylori . N Engl J Med 347: 1175–1186.
    2. 2. Gisbert JP, Khorrami S, Carballo F, Calvet X, Gene E и др. (2004) Метаанализ: эрадикационная терапия Helicobacter pylori в сравнении с антисекреторной неэрадикационной терапией для профилактики рецидивирующих кровотечений из пептической язвы.Aliment Pharmacol Ther 19: 617–629.
    3. 3. Gisbert JP, Pajares JM (2003) Helicobacter pylori и кровоточащая пептическая язва: какова распространенность инфекции у пациентов с этим осложнением? Scand J Gastroenterol 38: 2–9.
    4. 4. Gisbert JP, Abraira V (2006)Точность диагностических тестов Helicobacter pylori у пациентов с кровоточащей пептической язвой: систематический обзор и метаанализ. Am J Gastroenterol 101: 848–863.
    5. 5. Raderer M, Streubel B, Wohrer S, Hafner M, Chott A (2006)Успешное лечение антибиотиками Helicobacter pylori негативных лимфом лимфоидной ткани, связанных со слизистой оболочкой желудка. Гут 55: 616–618.
    6. 6. Бик Э.М., Экбург П.Б., Гилл С.Р., Нельсон К.Е., Пурдом Э.А. и соавт. (2006)Молекулярный анализ бактериальной микробиоты в желудке человека. Proc Natl Acad Sci USA 103: 732–737.
    7. 7. He Q, Wang JP, Osato M, Lachman LB (2002)Количественная ПЦР в реальном времени для обнаружения Helicobacter pylori .J Clin Microbiol 40: 3720–3728.
    8. 8. Tankovic J, Chaumette-Planckaert MT, Deforges L, Launay N, Le Glaunec JM, et al. (2007) Рутинное использование ПЦР в реальном времени для обнаружения Helicobacter pylori и мутаций устойчивости к кларитромицину. Гастроэнтерол Клин Биол 31: 792–795.
    9. 9. Lo CC, Lai KH, Peng NJ, Lo GH, Tseng HH и др. (2005) Полимеразная цепная реакция: чувствительный метод обнаружения инфекции Helicobacter pylori при кровоточащих пептических язвах.World J Gastroenterol 11: 3909–3914.
    10. 10. Ciesielska U, Jagoda E, Marciniak Z (2002)Значение метода ПЦР при обнаружении Helicobacter pylori в материале, залитом парафином. Folia Histochem Cytobiol 40: 129–130.
    11. 11. Scholte GH, van Doorn LJ, Quint WG, Lindeman J (1997) Полимеразная цепная реакция для обнаружения Helicobacter pylori в фиксированных формальдегидом сублиматом, залитых парафином желудочных биоптатах. Диагн Мол Патол 6: 238–243.
    12. 12. Weiss J, Mecca J, da Silva E, Gassner D (1994)Сравнение ПЦР и других диагностических методов для выявления инфекции Helicobacter pylori у пациентов с диспепсией. Дж. Клин Микробиол 32: 1663–1668.
    13. 13. Кобаяси Д., Эйши Ю., Окуса Т., Ишиге, Сузуки Т. и др. (2002)Плотность слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori , оцененная с помощью ПЦР в реальном времени, по сравнению с результатами уреазного дыхательного теста и гистологической оценкой. J Med Microbiol 51: 305–311.
    14. 14. Шаберейтер-Гуртнер С., Хиршль А.М., Драгосикс Б., Хуфнагл П., Пуз С. и соавт. (2004) Новый ПЦР-анализ в реальном времени для обнаружения инфекции Helicobacter pylori и одновременного тестирования чувствительности образцов кала и биопсии к кларитромицину. J Clin Microbiol 42: 4512–4518.
    15. 15. Ласколс С., Ламарк Д., Коста Дж. М., Копи-Бергман С., Ле Глаунек Дж. М. и др. (2003) Быстрое и точное количественное определение Helicobacter pylori и идентификация мутаций устойчивости к кларитромицину в H.pylo ri изолируется из образцов биопсии желудка с помощью ПЦР в реальном времени. J Clin Microbiol 41: 4573–4577.
    16. 16. Гуэль М., Артигау Э., Эстев В., Санчес-Дельгадо Дж., Хункера Ф. и др. (2006)Полезность отсроченного теста для диагностики инфекции Helicobacter pylori при кровоточащей пептической язве. Aliment Pharmacol Ther 23: 53–59.
    17. 17. Кастро-Фернандес М., Санчес-Муньос Д., Гарсия-Диас Э., Мираллес-Санчиз Дж., Варгас-Ромеро Дж. (2004)Диагностика инфекции Helicobacter pylori у пациентов с кровоточащей язвенной болезнью: экспресс-тест на уреазу и гистология.Преподобный Эсп Энферм Раскопки 96: 395–398.
    18. 18. Gisbert JP, Esteban C, Jimenez I, Moreno-Otero R (2007) Дыхательный тест с 13C-мочевиной во время госпитализации для диагностики инфекции Helicobacter pylori при язвенном кровотечении. Helicobacter 12: 231–237.
    19. 19. Gisbert JP, Trapero M, Calvet X, Mendoza J, Quesada M, et al. (2004)Оценка трех различных тестов для обнаружения антигенов стула для диагностики инфекции Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта.Aliment Pharmacol Ther 19: 923–929.
    20. 20. Кальвет X, Ларио С., Рамирес-Ласаро М.Дж., Монтсеррат А., Кесада М., Ривз Л. и др. (2010)Сравнительная точность 3 моноклональных тестов кала для диагностики инфекции Helicobacter pylori у пациентов с диспепсией. Clin Infect Dis 50: 323–328.
    21. 21. Кальвет X, Санчес-Дельгадо Дж., Монтсеррат А., Ларио С., Рамирес-Ласаро М.Дж. и др. (2009) Точность диагностических тестов на Helicobacter pylori : переоценка.Clin Infect Dis 48: 1385–1391.
    22. 22. Хомчински П., Сакки Н. (1987)Одноэтапный метод выделения РНК путем экстракции кислотным тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом. Анальный биохим 162: 156–159.
    23. 23. Сайки Р.К., Бугаван Т.Л., Хорн Г.Т., Муллис К.Б., Эрлих Х.А. и др. (1986) Анализ ферментативной амплификации бета-глобина и альфа-ДНК HLA-DQ с помощью аллель-специфических олигонуклеотидных зондов. Природа 324: 163–166.
    24. 24. Biswas B (2006) Соглашение об оценке диагностических устройств.FDA/Семинар по промышленной статистике. 28–29 сентября, доступно по адресу: http://www.amstat.org/meetings/fdaworkshop/presentations/2006/Assessing%20Agreement%20for%20diagnostic%20tests%202006.ppt. Дата обращения: 15.09.08. 2006.
    25. 25. Genta RM, Lash RH (2010) Helicobacter pylori-отрицательный гастрит: ищите, но не всегда найдете. Am J Surg Pathol 34: e25–e34.
    26. 26. Диксон М.Ф., Гента Р.М., Ярдли Дж.Х., Корреа П. (1994) Классификация и градация гастрита. Обновленная Сиднейская система.Международный семинар по гистопатологии гастрита, Хьюстон, 1994 г. Am J Surg Pathol 20: 1161–1181.
    27. 27. Calvet X, Barkun AN, Kuipers EJ, Lanas A, Bardou M, et al. (2009) Является ли тестирование H. pylori клинически полезным при остром кровотечении из верхних отделов желудочно-кишечного тракта? Систематический обзор. Гастроэнтерология 136: приложение 1 Т1943.
    28. 28. Ланас А., Кальве Х., Феу Ф., Понсе Дж., Гисберт Дж. П. и др. (2010)Первый испанский консенсус по лечению кровотечения из пептической язвы.Consenso sobre Hemorragia Digestiva por Úlcera Péptica. Мед Клин (Барк) 135: 608–616.
    29. 29. Martin de Argila C, Boixeda D (2001) Практические соображения по диагностике инфекции Helicobacter pylori [на испанском языке]. Мед Клин (Барк) 117: 386–391.
    30. 30. Houghton J, Ramamoorthy R, Pandya H, Dhirmalani R, Kim KH (2002)Плазма человека оказывает прямое бактерицидное действие на Helicobacter pylori in vitro , что потенциально объясняет снижение обнаружения Helicobacter pylori во время острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта.Гастроинтест Эндоск 55: 11–16.
    31. 31. Леунг В.К., Сунг Дж.Дж., Сиу К.Л., Чан Ф.К., Линг Т.К. и др. (1998) Ложноотрицательный уреазный тест биопсии при кровоточащих язвах, вызванных буферными эффектами крови. Am J Gastroenterol 93: 1914–1918.
    32. 32. Грэм Д.Ю., Опекун А.Р., Хаммуд Ф., Ямаока Ю., Редди Р. и др. (2003) Исследования механизма ложноотрицательных уреазных дыхательных тестов с ингибиторами протонной помпы. Am J Gastroenterol 98: 1005–1009.
    33. 33.Fantry GT, Rosenstein AH, James SP (1999) Смешивающие факторы при обнаружении инфекции Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Am J Gastroenterol 94: 1421–1422.
    34. 34. Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A, Burette A, Butzler JP, et al. (1995) Диагностика инфекции Helicobacter pylori с помощью ПЦР: сравнение с другими инвазивными методами и обнаружение гена cagA в образцах биопсии желудка. J Clin Microbiol 33: 2752–2756.
    35. 35. Lin HJ, Lo WC, Perng CL, Tseng GY, Li AF и другие. (2005)Цепная реакция полимеразы слизистых оболочек для диагностики инфекции Helicobacter pylori у пациентов с кровоточащими пептическими язвами. World J Gastroenterol 11: 382–385.
    36. 36. Кастильо-Рохас Г., Бальестерос М.А., Понсе де Л.С., Леон С. и др. (2002) Кровоточащие пептические язвы и наличие Helicobacter pylori с помощью различных тестов: исследование случай-контроль. Eur J Gastroenterol Hepatol 14: 1113–1118.
    37. 37. Рести М., Микели А., Мориондо М., Бекчолини Л., Кортимилья М. и др. (2009)Сравнение влияния лечения антибиотиками на возможность диагностики инвазивной пневмококковой инфекции культуральными или молекулярными методами: проспективное обсервационное исследование детей с доказанной пневмококковой инфекцией. Clin Therapeutics 31: 1266–1273.
    38. 38. Lee JM, Breslin NP, Fallon C, O’Morain CA (2000) Экспресс-тесты на уреазу не обладают чувствительностью при диагностике Helicobacter pylori , когда язвенная болезнь проявляется кровотечением.Am J Gastroenterol 95: 1166–1170.
    39. 39. Wu CY, Poon SK, Chen GH, Chang CS, Yeh HZ (1999)Взаимодействие между Helicobacter pylori и нестероидными противовоспалительными препаратами при язвенном кровотечении. Scand J Gastroenterol 34: 234–237.
    40. 40. Сотудехманеш Р., Асгари А.А., Факери Х.Т., Нурайе М., Хатибиан М. и соавт. (2005) Кровотечение из пептической язвы: является ли Helicobacter pylori фактором риска в эндемичном районе? Индийский Дж. Гастроэнтерол 24: 59–61.
    41. 41. Хаят М., Эверетт С., Бреслин Н.П., Моайеди П., О’Махони С. и др. (1999)Распространенность Helicobacter pylori при кровоточащей язвенной болезни. Кишка 45: A77.
    42. 42. Пилотто А., Леандро Г., Ди Марио Ф., Франчески М., Боззола Л. и др. (1997) Роль инфекции Helicobacter pylori в кровотечениях из верхних отделов желудочно-кишечного тракта у пожилых людей: исследование случай-контроль. Dig Dis Sci 42: 586–591.
    43. 43. Hung LC, Ching JY, Sung JJ, To KF, Hui AJ и др.(2005)Долгосрочные результаты Helicobacter pylori -отрицательных идиопатических кровоточащих язв: проспективное когортное исследование. Гастроэнтерология 128: 1845–1850.
    44. 44. Арройо М.Т., Форне М., де Аргила К.М., Феу Ф., Аренас Дж. и др. (2004) Распространенность пептической язвы, не связанной с Helicobacter pylori или приемом нестероидных противовоспалительных препаратов, в южной Европе незначительна. Helicobacter 9: 249–254.
    45. 45. Гисберт Дж. П., Гонсалес Л., де Педро А., Вальбуэна М., Прието Б. и др.(2001) Helicobacter pylori и кровоточащая язва двенадцатиперстной кишки: распространенность инфекции и роль нестероидных противовоспалительных препаратов. Scand J Gastroenterol 36: 717–724.

    Количественная ПЦР для обнаружения Helicobacter pylori

    Введение

    Helicobacter pylori является распространенным патогеном, который поражает почти 50% населения мира. 1 Заражение этим патогеном вызывает хронический гастрит, который может вызывать хронические гастродуоденальные заболевания, такие как гастрит, язва желудка, язва двенадцатиперстной кишки, рак желудка и В-клеточная лимфома, ассоциированная со слизистой оболочкой желудка (MALT). 2 Хотя H. pylori является сильнейшим известным фактором риска, на долю которого приходится 80% или более случаев рака желудка, следует отметить, что только у 3% инфицированных пациентов впоследствии развивается рак желудка. 3

    Резистентность к антибиотикам H. pylori является важным фактором, влияющим на эффективность современных терапевтических режимов. В общей популяции распространенность бактериальной резистентности связана с потреблением антибиотиков и варьирует в разных географических регионах. 4 Резистентность к противомикробным препаратам является основным фактором, приводящим к терапевтической неудаче, особенно в случае кларитромицина, который может вызвать 70-процентную потерю эффективности эрадикации H. pylori в составе ингибитора протонной помпы (ИПП)/амоксициллина на основе тройной терапии. 5,6 Левофлоксацин был рекомендован в качестве терапии спасения, и было показано, что он более эффективен, чем четырехкомпонентная терапия во второй и третьей линии лечения инфекции H. pylori . 7 Однако резистентность к кларитромицину или левофлоксацину является основной причиной неудачной эрадикации после тройной терапии на основе кларитромицина или левофлоксацина соответственно. 8

    Резистентность к кларитромицину и левофлоксацину обусловлена ​​исключительно специфическими мутациями в небольшой области ответственных генов, поэтому молекулярные методы предлагают альтернативу традиционным методам обнаружения этих мутаций. 9 Устойчивость к кларитромицину у H. pylori вызывается мутациями в области пептидилтрансферазы, кодируемой в домене V гена 23S рибосомной РНК (рРНК) H. pylori в 50S субъединице рибосомы.Кларитромицин стимулирует высвобождение пептидил-тРНК из сайта А (сайт акцептора аминоацила), блокируя удлинение зарождающейся пептидной цепи во время синтеза бактериального белка. 10 Мутации в домене V гена 23S рРНК являются основной причиной устойчивости к кларитромицину у H. pylori . Наиболее частыми мутациями являются A2143G, A2142G и A2142C, на долю которых приходится более 80% резистентности к кларитромицину у H. pylori . Сообщалось также о других мутациях, таких как A2115G, G2141A, C2147G, T2190C, C2195T, A2223G и C2694A, но их роль в устойчивости к кларитромицину неясна. 11 Определяющая устойчивость к хинолонам область (QRDR) представляет собой короткую консервативную область в генах gyrA (кодон 74–113) и gyrB (кодон 500–538), которая, как было показано, связана с устойчивостью к левофлоксацину. 12 Устойчивость к левофлоксацину у H. pylori опосредована мутациями аминокислот в положении 87 (Asn87) и 91 (Asp91) в QRDR gyrA гена, который оказывает более важное влияние, чем gyrB . 13,14 Мутации в гене gyrB также зарегистрированы в устойчивых к левофлоксацину штаммах, но часто встречаются вместе с мутациями gyrA . 15 Знание механизмов резистентности может способствовать разработке более рациональных комбинаций антибиотиков с целью повышения эффективности лечения. Существуют различные методы, используемые для обнаружения инфекции H. pylori , и ее можно разделить на два типа, т. е. инвазивные и неинвазивные методы.Эти методы имеют свои преимущества и ограничения. 16 Культура H. pylori из биоптатов является золотым стандартом для тестирования чувствительности к антибиотикам и наиболее специфичным методом обнаружения H. pylori . Однако чувствительность культуры может быть снижена из-за привередливости к штаммам, эффекта терапии, вызывающей низкую плотность клеток или изменение морфологических особенностей и потерю жизнеспособности и/или избыточный рост контаминирующих микроорганизмов. 16

    Разработка быстрого и надежного высокопроизводительного метода обнаружения H.ожидается, что резистентность к H. pylori будет очень полезна для оказания помощи в лечении H. pylori . Это особенно важно, учитывая тот факт, что посев и тестирование чувствительности H. pylori должны быть обязательными после первой неудачи лечения. Молекулярное обнаружение H. pylori с использованием метода, основанного на ПЦР, позволяет обнаруживать небольшие количества бактериальной ДНК и может помочь в обнаружении H. pylori с гораздо более высокой скоростью. Разработка молекулярных методов обнаружения мутаций, связанных с устойчивостью к кларитромицину и/или левофлоксацину H.pylori в образцах стула сообщалось в нескольких исследованиях. 17–21 Количественная ПЦР (кПЦР) представляет собой высокочувствительную и мощную технологию количественного определения ДНК Helicobacter в образцах желудочно-кишечного тракта. По сравнению с другими доступными методами для клинических и исследовательских целей, количественная ПЦР является высоконадежной, быстрой и чувствительной для диагностики инфекции H. pylori . 22 На сегодняшний день количественная ПЦР широко используется для оценки чувствительности к антибиотикам H.pylori в образцах биопсии, специально для выявления резистентности к кларитромицину. 21,23–25 И наоборот, существует лишь несколько доступных анализов количественной ПЦР для обнаружения H. pylori и мутаций, придающих устойчивость как к антибиотикам кларитромицину, так и к левофлоксацину. 26,27 Таким образом, целью данного исследования была разработка и оценка мультиплексного количественного ПЦР для обнаружения H. pylori и генных мутаций, придающих резистентность к кларитромицину и левофлоксацину у H.pylori в образцах биопсии желудка. Этот анализ предоставит нам новый инструмент наряду с методом быстрого обнаружения и стандартными протоколами для управления и мониторинга, а также для улучшения результатов эрадикационной терапии H. pylori .

    Материалы и методы

    Пациенты и образцы биопсии желудка

    В это исследование были включены двести восемьдесят восемь пациентов с хронической диспепсией, которым была проведена верхняя эзофагогастродуоденоскопия (ОГДС) в отделении эндоскопии Малайзийского медицинского центра Университета Кебангсаан (UKMMC), Куала-Лумпур, Малайзия, с апреля 2014 года по август 2015 года.Исключались пациенты, получавшие антибиотики или нестероидные противовоспалительные препараты в течение 4 недель до OGDS, а также пациенты со злокачественными новообразованиями желудка или иммуносупрессией. У каждого пациента были взяты три биоптата из антрального отдела и/или тела желудка. Биоптаты помещали по отдельности в разные пробирки для определения H. pylori обычными методами, включая посев, экспресс-тест на уреазу и гистологическое исследование, как указано в предыдущем исследовании. 28 Всего была получена 571 биопсия желудка и H.pylori определяли в этих биоптатах с помощью посева (n=571), быстрого уреазного теста (n=571) и гистологического исследования (n=569; две биопсии не подходили).

    Клинические

    H. pylori Изоляты

    Культура считалась положительной, когда рост H. pylori определялся как грамотрицательные изогнутые/спиральные палочки с помощью окрашивания по Граму и был положительным по уреазе, каталазе и оксидазе. 28 Всего 59 H. pylori было выделено путем посева. Тестирование чувствительности к антибиотикам кларитромицина и левофлоксацина проводили, как описано в нашем предыдущем исследовании 28 , с использованием Е-теста, а мутации определяли с помощью секвенирования генов.

    Среди 59 изолятов H. pylori ; В качестве положительных контролей использовали штаммы H. pylori A3, A26, C81, C55, A142, A129, A150, A177 и C192. Все они представляют собой изогнутые/спиральные стержни, уреазо-, каталазо- и оксидазо-положительные и положительные по glmM , 29 , как определено обычной ПЦР. Штамм H. pylori C55 использовали в качестве положительного контроля для обнаружения H. pylori с помощью ureA -qPCR. Секвенирование подтвердило генетические мутации гена 23S рРНК и gyrA H.pylori в штаммах A3, A26, C81, A142, A129, A150, A177 и C192, которые использовали в качестве положительных контролей для выявления устойчивости к кларитромицину или левофлоксацину. штаммов H. pylori A177 и A142 содержали мутации A2142G и A2143G соответственно. штаммов H. pylori A129, A150 и C192 представляли собой штаммы дикого типа, несущие мутации N87K и N87I соответственно. В то время как штаммов H. pylori A3, A26 и C81 были штаммом дикого типа, штаммом, содержащим мутации D91N и D91Y, соответственно.

    Экстракция ДНК

    ДНК

    из 59 изолятов H. pylori и 571 биопсии желудка (использованных для экспресс-теста на уреазу) экстрагировали с использованием мини-набора FavorPrep TM Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit (Favorgen Biotech Corporation, Тайвань) в соответствии с инструкциями производителя. Экстрагированную ДНК хранили при -20°С до использования. Концентрацию и чистоту образца ДНК измеряли путем определения оптической плотности поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм с помощью ультрафиолетового (УФ) спектрофотометра (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, США).Образцы с низким (<1,5) или высоким (>2,0) соотношением OD 260 /OD 280 не использовали для количественной ПЦР, и экстракцию повторяли.

    Конструкция праймеров и зондов

    В

    GenBank был проведен поиск последовательностей гена ureA H.pylori. Опубликованные последовательности гена 23S рРНК H. pylori (регистрационный номер KC556778), gyrA (регистрационный номер L29481), H. pylori дикого типа ATCC 26695 и последовательности из клинических штаммов H. pylori были выровнены с помощью CLUSTAL W Multiple Alignment 30 в версии 7 Bioedit.2.5, а праймеры и зонды были разработаны с использованием онлайн-инструмента PrimerQuest на веб-сайте IDT ( https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index ). Праймеры и зонды для ureA были выбраны из области со 100% гомологией между всеми опубликованными последовательностями, кодирующими H.pylori ureA . Поиск BLAST выявил 100% гомологию только с H. pylori -специфическим геном ureA . Праймеры и зонды для гена 23S рРНК были разработаны для нацеливания на расположение двух соседних аденинов, где происходят мутации A2142 и A2143, придающие устойчивость к кларитромицину в гене 23S рРНК.Праймеры и зонды для гена gyrA были разработаны для нацеливания на мутации в положениях кодона 87 и 91 гена H. pylori gyrA (N87K и N87I, и D91N и D91Y). Для проверки специфичности последовательностей ДНК праймеров и зондов был проведен поиск BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Свойства праймеров и зондов оценивали по оптимизированным температурам плавления, вторичной структуре, основному составу и длине ампликонов. Потенциальный самоотжиг и образование шпилек проверяли с помощью бесплатного программного обеспечения для проверки самодополняемости олигонуклеотидов ( http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html ). Праймеры и зонды были синтезированы компаниями Integrated DNA Technologies (Singapore Science Park II, Сингапур) и Macrogen (Synapase, Сингапур) и перечислены в таблице 1.

    Таблица 1 Последовательность олигонуклеотидов, использованная в этом исследовании

    Обнаружение

    H. pylori в образцах биопсии методом количественной ПЦР

    Для обнаружения ureA готовили реакционную смесь в конечном объеме 20 мкл в конечной концентрации, содержащую 10 мкл 1x Probe PCR master mix буфера реакции (содержит Tris-Cl, KCl, NH 4 Cl, MgCl 2 , dNTP и ДНК-полимераза QuantiNova) (набор QuantiNova TM Probe PCR, Qiagen, Corbett Robotics, Австралия), 0.5 мкМ праймера UreA-F, 0,5 мкМ праймера UreA-R, 0,2 мкМ UreA-зонда, 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы. Реакцию амплификации проводили с использованием Rotor-Gene Q (Qiagen, Corbett Robotics, Австралия) с предварительной денатурацией в течение 2 минут при 95°С, с последующими 40 циклами амплификации денатурации при 95°С в течение 5 секунд и комбинированной стадией отжига/удлинения. в течение 5 секунд при 60°С. Образцы анализировали дважды и считали положительными, если обе реакции были положительными. ДНК двух H.pylori эталонные штаммы (ATCC 43526 и J99) и один клинический штамм C55 использовали в качестве положительных с отрицательными контролями, содержащими матрицу ДНК, замененную стерильной дистиллированной водой. Стандартная кривая была построена с использованием 10-кратных серийных разведений образцов ДНК, выделенных из штамма H. pylori C55, в диапазоне от 100 нг/мкл до 1 фг/мкл (от 10 0 до 10 -7 ) 1,22× 10 8 КОЕ/мл, которые использовались в качестве матрицы для количественной ПЦР. Показания флуоресценции для каждого образца были сняты на стадии отжига по зеленому каналу [6-карбоксифлуоресцеин (FAM)].Для проверки амплифицированного ureA все продукты количественной ПЦР подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле и визуализировали в УФ-свете с окрашиванием GelStain.

    Чтобы исключить влияние ДНК человека на количественный анализ ДНК H. pylori , ген альбумина человека (геном человека состоит только из одной копии гена альбумина) был амплифицирован для количественного определения количества клеток человека в биопсии с использованием следующие праймеры: прямой (5´-CTGCATTGCCGAAGTGGAA-3´) и обратный (5´-CAAACATCCTTACTTTCAAAAAAAATCA-3´) и зонд (5´-FAM-TGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTG-3´-TAMRA). 31 ДНК, выделенную из цельной крови человека, использовали для определения концентрации и чистоты ДНК и использовали в качестве шаблона для стандартной кривой для клеток человека. Преобразование ДНК-матрицы (нг) в число копий (C, копий/мкл) в каждой мишени проводили с использованием формулы, как описано ранее. 32 H. pylori ДНК-нагрузка в биоптате желудка выражалась как частное между числом копий микроорганизмов и числом копий клеток человека в каждом образце желудка 31 , умноженное на 100, чтобы получить число копий H.pylori ДНК на 100 клеток человека. 33

    Предел обнаружения ureA qPCR assay был определен с использованием 10 последовательно разведенных образцов ДНК H. pylori штамма C55. Концентрация ДНК в диапазоне от 100 нг/мкл до 0,01 фг/мкл использовалась в качестве матрицы для количественной ПЦР. Специфичность праймеров и зондов исследовали путем нанесения ДНК различных видов бактерий, в том числе штаммов бактерий, продуцирующих уреазу (клинические изоляты), таких как Staphylococcus aureus, Acinetobacter spp., Vibrio parahaemolyticus, Proteus mirabilis, Serratia spp., Staphylococcus epidermidis, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae и Bacillus subtilis. H. pylori ATCC 43526 и H. pylori J99 использовали в качестве положительного контроля.

    Обнаружение точечной мутации в гене 23S рРНК

    H. pylori в образцах биопсии с помощью мультиплексной количественной ПЦР

    ureA -положительные образцы подвергали мультиплексной количественной ПЦР для обнаружения мутации в гене 23S рРНК.Реакционную смесь готовили в конечном объеме 20 мкл, содержащем пять мкл 1× мастер-микса Multiplex PCR (содержит ДНК-полимеразу QuantiNova, буфер QuantiNova Multiplex PCR и смесь dNTP) (набор QuantiNova TM Multiplex PCR, Qiagen, Corbett Robotics, Австралия), 0,4 мкМ праймера Cla-Fw, 0,4 мкМ праймера Cla-Rw, 0,25 мкМ ClaPWT, зонда Cla-P2142G и Cla-P2143G TaqMan, 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы. Амплификацию проводили с использованием Rotor-Gene Q (Qiagen, Corbett Robotics, Австралия) в условиях предварительной денатурации в течение 2 минут при 95°С, с последующими 40 циклами амплификации денатурации при 95°С в течение 5 секунд и комбинированной стадией отжига/удлинения. в течение 30 секунд при 60°С.Образцы анализировали дважды и считали положительными, если обе реакции были положительными. Штамм H. pylori J99 и устойчивые к кларитромицину A177 (мутация A2142G) и A142 (мутация A2143G) использовали в качестве положительного контроля, а стерильную дистиллированную воду использовали в качестве отрицательного контроля. Стандартные кривые были построены индивидуально с использованием 10-кратных разведений ДНК в диапазоне от 72 нг до 7,2 фг 1,15×10 8 КОЕ/мл для штамма дикого типа ( H. pylori J99), от 150 нг до 15 фг 1.1×10 8 КОЕ/мл для H. pylori A177 и от 100 нг до 10 фг 1,38×10 8 КОЕ/мл для A142. Семь 10-кратных серийных разведений каждой ДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР. Показания флуоресценции для каждого образца были сняты на этапе отжига по красному каналу (Cy5), желтому каналу (HEX) и зеленому каналу [6-карбоксифлуоресцеин (FAM)]. Для проверки амплифицированной последовательности гена 23S рРНК все продукты количественной ПЦР подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле и визуализировали в УФ-свете с окрашиванием GelStain.

    Одиночная ПЦР была проведена перед проведением мультиплексных реакций, чтобы подтвердить эффективность количественной ПЦР. Реакционную смесь готовили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 5 мкл 1×Multiplex мастер-микса для ПЦР (набор QuantiNova TM Multiplex PCR, Qiagen, Corbett Robotics, Австралия), 0,4 мкМ праймера Cla-Fw, 0,4 мкМ праймера Cla -Rw, 0,25 мкМ зонда ClaPWT или Cla-P2142G или Cla-P2143G TaqMan и 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы. Для мультиплексной реакции готовили реакционную смесь в конечном объеме 20 мкл, содержащем 5 мкл 1× мастер-микса для мультиплексной ПЦР (набор QuantiNova TM для мультиплексной ПЦР, Qiagen, Corbett Robotics, Австралия), 0.4 мкМ праймера Cla-Fw, 0,4 мкМ праймера Cla-Rw, 0,25 мкМ ClaPWT, Cla-P2142G и Cla-P2143G зонда TaqMan и 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы.

    Вышеупомянутые реакции одиночной и мультиплексной реакций проводились независимо, и сравнивались значения анализа C q . Значения, полученные для данной мишени в одиночном и мультиплексном анализах, не должны существенно различаться.

    Для оценки чувствительности мультиплексного количественного ПЦР использовали 10-кратные разведения ДНК в диапазоне от 72 нг до 0.0072 фг 1,15×10 8 КОЕ/мл для штамма дикого типа ( H. pylori J99), от 150 нг до 0,0015 фг 1,1×10 8 КОЕ/мл для H. pylori J99 A07 нг до 0,001 фг 1,38×10 8 КОЕ/мл для H. pylori A142 получали независимо. Бактериальную ДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР.

    Специфичность анализа гена 23S рРНК методом количественной ПЦР определяли путем тестирования других бактериальных штаммов, включая Acinetobacter spp., B. subtilis, S. flexneri, P. mirabilis, Serratia spp., S. typhimurium, E. coli, S. epidermidis, P. aeruginosa, Enterobacter spp., K. pneumoniae, V. parahaemolyticus, V. холера, S. aureus и Flavobacterium spp. H. pylori ATCC 43526 и H. pylori J99 использовали в качестве положительных контролей.

    Обнаружение точечной мутации в

    gyrA из образцов биопсии с помощью мультиплексной количественной ПЦР

    Образцы, положительные по ureA , подвергали мультиплексной количественной ПЦР для обнаружения двух разных сайтов мутации в gyrA (аминокислоты в положениях 87 и 91).Для амплификации gyrA в положении аминокислоты 87 (136 п.н.) реакционную смесь готовили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 5 мкл 1×Multiplex PCR master mix (набор QuantiNova TM Multiplex PCR, Qiagen, Corbett Robotics). , Австралия), 0,4 мкМ праймера Levo-Fw, 0,4 мкМ праймера Levo-Rw, 0,25 мкМ Levo-N87WT, зонда Levo-N87K и Levo-N87I TaqMan, 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы. H. pylori A129 (дикий тип), H. pylori A150 (резистентный к левофлоксацину, содержащий мутацию N87K) и H.pylori C192 (устойчивый к левофлоксацину, содержащий мутацию N87I) использовали в качестве положительного контроля со стерильной дистиллированной водой в качестве отрицательного контроля. Стандартные кривые были построены индивидуально с использованием 10-кратных разведений ДНК в диапазоне от 100 нг до 10 фг 1,28×10 8 КОЕ/мл для штамма дикого типа ( H. pylori A129), от 160 нг до 16 фг 1,45×10 8 КОЕ/мл для H. pylori A150 и от 145 нг до 14,5 фг 1,31×10 8 КОЕ/мл для H. pylori A192.10-кратные серийные разведения каждой ДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР.

    Для амплификации gyrA в положении аминокислоты 91 (136 п.н.) реакционную смесь готовили в конечном объеме 20 мкл при конечной концентрации, содержащей 5 мкл 1×Multiplex PCR master mix (QuantiNova TM Multiplex PCR kit , Qiagen, Corbett Robotics, Австралия), 0,4 мкМ праймера Levo-Fw, 0,4 мкМ праймера Levo-Rw, 0,25 мкМ Levo-D91WT, зонда Levo-D91N и Levo-D91Y TaqMan, 2,5 мкл матричной ДНК и воды без РНКазы. .Штаммы H. pylori A3 (дикий тип), A26 (устойчивый к левофлоксацину, несущий мутацию D91N) и C81 (устойчивый к левофлоксацину, несущий D91Y) использовали в качестве положительных контролей, а в отрицательный контроль добавляли стерильную дистиллированную воду. Стандартные кривые были построены индивидуально с использованием 10-кратных разведений ДНК в диапазоне от 120 нг до 12 фг 1,59×10 8 КОЕ/мл для штамма H. pylori A3, от 110 нг до 11 фг 1,25×10 8 КОЕ/мл для H. pylori A26 и от 180 нг до 18 фг 1.98×10 8 КОЕ/мл для H. pylori C81. 10-кратные серийные разведения каждой ДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР.

    Реакцию амплификации проводили на Rotor-Gene Q (Qiagen, Corbett Robotics, Австралия) в условиях предварительной денатурации в течение 2 минут при 95°С, с последующими 40 циклами амплификации денатурации при 95°С в течение 5 секунд и комбинированным отжигом/ этап удлинения в течение 30 секунд при 60°C. Образцы анализировали дважды и считали положительными, если обе реакции были положительными.Показания флуоресценции для каждого образца были сняты на этапе отжига по красному каналу (Cy5), желтому каналу (HEX) и зеленому каналу [6-карбоксифлуоресцеин (FAM)]. Для проверки обнаруженной последовательности gryA все продукты количественной ПЦР подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле и визуализировали в УФ-свете с окрашиванием GelStain.

    Для проверки мультиплексной количественной ПЦР gyrA -N87 и gryA -D91, оптимизации праймеров, эффективности одиночных и мультиплексных реакций, чувствительности и специфичности множественной количественной ПЦР, а также эффективности мультиплексной количественной ПЦР для обнаружение нескольких штаммов в одном и том же образце биопсии проводили в соответствии с протоколом, описанным выше для обнаружения мутаций в гене 23S рРНК.

    Расхождение результатов между КПЦР и Е-тестом анализировали путем секвенирования с использованием набора для секвенирования BigDye terminator v3.1 на секвенаторе ABI 3730×L (MyTACG Bioscience Enterprise, Селангор, Малайзия). Используемые праймеры представляли собой праймеры Cla для выявления кларитромицина и праймеры Lev для выявления устойчивости к левофлоксацину (таблица 1). После секвенирования выполняли поиск BLAST для проверки сходства/идентичности последовательностей ДНК.

    Параметры количественной ПЦР и критерии приемлемости

    КПЦР измеряет флуоресценцию на каждом этапе отжига.Для анализа данных использовалось программное обеспечение Rotor-Gene серии Q. Был построен график амплификации, показывающий увеличение флуоресценции репортерного красителя (Rn) с каждым циклом ПЦР. Количественное определение вводимого целевого количества анализировали по значению цикла количественного определения (Cq), которое представляет собой точку, в которой образец графика амплификации ПЦР пересекает пороговое значение. Приемлемой стандартной кривой считали, если между каждым из 10-кратных разведений демонстрировалась разница в -3,1±0,5 циклов, и высокоэффективными и воспроизводимыми реакциями, если коэффициент корреляции ( R 2 ) из всех независимых экспериментов находился в пределах диапазон 0.90–1,0 ( R 2 =0,90–1).

    Статистический анализ

    Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS версии 23 (SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс, США). Различия между группами категориальных данных оценивали статистически с использованием критерия Хи-квадрат Пирсона (χ 2 ). Независимые образцы t -test используются для определения положительных результатов между одиночной и мультиплексной количественной ПЦР. Различия qPCR-отрицательных и qPCR-положительных были статистически оценены с использованием критерия Хи-квадрат (χ 2 ) для одного образца.Тесты Каппа и Макнемара использовались для сравнения согласованности между различными методами обнаружения. Различия считались значимыми, когда значение P было <0,05. Были рассчитаны точность, чувствительность, специфичность, положительные прогностические значения (PPV), отрицательные прогностические значения (NPV), положительное отношение правдоподобия (+LR) и отрицательное отношение правдоподобия (-LR) результатов количественной ПЦР.

    Результаты

    Обнаружение

    H. pylori в образцах биопсии методом количественной ПЦР

    Специфичность видоспецифичных праймеров и протокола количественной ПЦР была оптимизирована для эталонных штаммов H.pylori ( H. pylori ATCC 43526 и H. pylori J99) и девять штаммов, продуцирующих уреазу. Эталонные штаммы H. pylori дали специфическую амплификацию количественной ПЦР при C q ≤37 циклов с ожидаемым ампликоном 120 п.н. Виды разных родов демонстрируют амплификацию при C q ≥37 циклов (, Дополнение 1 ), что позволяет предположить, что ДНК других бактерий разных видов не вступала в перекрестную реакцию с праймерами, следовательно, наши праймеры были специфичны для H.пилори . Стандартную кривую для количественного определения строили с использованием оптимизированных условий анализа амплификации кПЦР, основанных на концентрации ДНК в диапазоне от 100 нг до 0,01 фг. Стандартные кривые показали коэффициенты корреляции ( R 2 ) 0,990, а пределы обнаружения количественного определения составили 1 фг на реакцию ( Приложение 1 ). Если одна бактерия соответствует 1,8 фг ДНК (1 667 867 п.н.) на геном, 34 , то есть 1 фг равен 0,56 бактериальной клетки. Электрофорез в агарозном геле продуктов количественной ПЦР (120 п.н.) подтвердил желаемое качество амплификации.Продукты количественной ПЦР секвенировали для проверки амплифицированной ureA со 100% гомологией с H. pylori ureA в GenBank.

    Оптимизированная количественная ПЦР была проведена для амплификации фрагментов ureA H. pylori во всех 571 биоптатах желудка. Пороговые значения, которые отличают положительное и отрицательное обнаружение, были рассчитаны с использованием анализа кривой рабочих характеристик приемника (ROC) для нормализованного количества (бактериальная плотность) (, Приложение 2, ).Была получена площадь под ROC-кривой (AUC) (табл. 2). Оптимальные точки отсечки рассчитывали по определению положительного результата как количество микроорганизмов, которые максимизировали взвешенную комбинацию чувствительности и специфичности (т.е. максимизировали индекс Юдена ( J ) = чувствительность + специфичность-1). 39 На основании полученных координат кривой образец считался положительным, если было выбрано значение от 0,5 числа копий на 100 клеток человека для поддержания наивысшего индекса Юдена, равного 98.5% (табл. 2). Площадь под ROC-кривой составила 0,999 (95% доверительный интервал: 0,998–0,999) (таблица 2), что указывает на хороший прогноз колПЦР с использованием этого порогового значения.

    Табл. 2

    Распределение значений C q среди qPCR-положительных и -отрицательных образцов биопсии было проанализировано для определения порогового значения C q ( Приложение 3 ).Распределение значений C q позволило определить оптимальную отсечку при ≤30 циклах. Точка отсечки при количестве копий 0,5 подтверждается тем фактом, что значения C q , полученные из всех положительных образцов биопсии (n=136), были ниже и равны 30 циклам. Никакие образцы биопсии, которые были положительными для qPCR ureA , не демонстрируют значения C q , превышающие 30 циклов (, Приложение 3, ). Таким образом, результат кПЦР считался положительным, если он приводил к графику амплификации с C q ≤30, т. е. 0.Количество копий 5 на 100 клеток человека.

    При обнаружении H. pylori обычными методами сравнения образец биопсии считался положительным, если он был положительным либо по культуре, либо по экспресс-тесту на уреазу, либо по гистологии. Показатель положительного обнаружения для анализа КПЦР был значительно выше, чем при использовании традиционных методов [23,8%, (136/571) против 14,7% (84/571), P <0,0001]. В общей сложности 136 H. pylori положительных результатов биопсии с помощью ureA -qPCR были обнаружены у 92 из 288 пациентов.Эти биопсии были взяты из антрального отдела и/или тела желудка пациентов. КПЦР с использованием биопсий из разных участков желудка показала согласованные результаты. Были проанализированы характеристики количественной ПЦР по сравнению с результатами обычных методов в качестве золотого стандарта. На основании оптимального порогового значения для количественной ПЦР чувствительность, специфичность и точность количественной ПЦР составляли 96,4% (95% доверительный интервал [ДИ] = 89,1–99,1%), 88,5% (95% ДИ = 85,3–91,1%). ) и 89,7% соответственно (табл. 2). Результаты количественной ПЦР в настоящем исследовании демонстрируют приемлемую чувствительность, специфичность и точность обнаружения H.pylori в образцах биопсии. Положительная прогностическая ценность (PPV), отрицательная прогностическая ценность (NPV), положительное отношение правдоподобия (+LR), отрицательное отношение правдоподобия (-LR) и составили 58,8% (95% ДИ = 50,1–67,1%), 99,3% (95% ДИ=97,8–99,8%), 8,72 и 0,04 соответственно (табл. 2). Значение каппа указывает на существенную степень согласия (каппа = 0,67, P <0,0001) анализа количественной ПЦР и обычных методов обнаружения H. pylori в образцах биопсии желудка.

    Анализ qPCR позволил обнаружить и количественно определить H.pylori в образцах биопсии. В общей сложности была протестирована 571 биопсия, 23,8% (136/571) были положительными при количественной ПЦР на основе оптимального порогового значения (0,5 числа копий на 100 клеток человека при значении C q ≤30), а 76,2% (435/571) были отрицательными для H. pylori (количество копий <0,5 в образце при значении C q >30). H. pylori -положительные биоптаты с помощью количественной ПЦР дали продукты амплификации с предсказанным размером 120 п.н. Выравнивание последовательностей показало 100% гомологию с опубликованным H.pylori ureA в GenBank. Существовала значительная разница между H. pylori — положительными и H. pylori -отрицательными образцами, обнаруженными с помощью количественной ПЦР ( p <0,0001).

    Оптимизация мультиплексной кПЦР гена 23S рРНК, мультиплексной кПЦР

    gyrA 87 и мультиплексной кПЦР gyrA 91

    Параметры, используемые для валидации мультиплексной кПЦР гена 23S рРНК, кПЦР gyrA 87 и кПЦР gyrA 91, включали концентрацию праймеров, одиночную реакцию кПЦР, тройную реакцию кПЦР и реакцию одинарной кПЦР по сравнению с тройной.Оптимум реакции триплексной кПЦР определял предел обнаружения триплексной кПЦР, специфичность тройной кПЦР и обнаружение множественных штаммов в одних и тех же образцах биопсии. Ключевыми изучаемыми факторами были эффективность одиночной и тройной реакции количественной ПЦР. Результаты показали, что мультиплексная реакция гена 23S рРНК (, Приложение 4, ), количественная ПЦР gyrA 87 (, Приложение 5, ) и gyrA 91 (, Приложение 6, ) дает такую ​​же эффективность реакции, как и одиночная реакция.Протестированные штаммы H. pylori показали только одно значение C q для одного генотипа, который не показал перекрестной реактивности с другими нецелевыми штаммами. Отсутствовала статистическая значимость (независимая t -тест P -значение >0,05) значения C q , полученного для данной мишени в одиночном и множественном анализе (, Приложение 7–9 ), что доказывало, что зонд для обнаружения гена 23S рРНК и gyrA специфичны для каждой мутации.Сигнал флуоресценции от других протестированных бактериальных штаммов не был получен для всех цветов флуоресценции (, Приложение 10–12 ), и ни одна полоса ПЦР не была амплифицирована.

    Обнаружение точечной мутации в гене 23S рРНК

    H. pylori в образцах биопсии с помощью мультиплексной количественной ПЦР

    Оптимизированная мультиплексная количественная ПЦР гена 23S рРНК была проведена для амплификации фрагментов 23S рДНК H. pylori в 136 положительных образцах. Обнаружение точечных мутаций в гене 23S рРНК с помощью мультиплексной количественной ПЦР показано в таблице 3.В целом штаммы дикого типа были обнаружены в 79,4% (108/136) биопсий, а 20,6% (28/136) биопсий были инфицированы штаммами, устойчивыми к H. pylori . Среди 28 биопсий 22 биопсии были инфицированы одним генотипом (генотип A2142G в трех биопсиях и генотип A2143G в 19 биопсиях), а шесть биопсий были инфицированы смешанным генотипом (дикий тип и мутационные штаммы). Смесь резистентных и чувствительных была обнаружена в шести биоптатах, в которых 66,7% (4/6) биоптатов имели штаммы дикого типа и A2142G, а 33.3% (2/6) биоптатов содержали штаммы дикого типа и A2143G. Характеристики мультиплексной количественной ПЦР гена 23S рРНК показаны в таблице 4. Результат был получен при сравнении множественной количественной ПЦР гена 23S рРНК с Е-тестом в качестве золотого стандарта. Чувствительность, специфичность и точность количественной ПЦР составляли 100%, 98,7% и 98,8% соответственно. Положительные и отрицательные прогностические значения составили 75% и 100% соответственно.

    Таблица 3 Определение чувствительности к кларитромицину с помощью Е-теста, секвенирования и мультиплексной количественной ПЦР 23S рДНК

    Таблица 4

    Обнаружение точечной мутации в гене

    gyrA в образцах биопсии с помощью мультиплексной количественной ПЦР- gyrA

    Обнаружение точечной мутации в гене gyrA в 136 положительных образцах с помощью мультиплексной количественной ПЦР gyrA показано в таблице 5.В целом, штаммы дикого типа, обнаруженные в биоптатах, составили 88,2% (120/136) по сравнению с 11,8% (16/136) у устойчивых к левофлоксацину H. pylori . Среди 16 биопсий одна биопсия была инфицирована одним генотипом, а 15 биоптатов имели смешанный генотип. Производительность мультиплексной количественной ПЦР анализа gyrA показана в таблице 4. Чувствительность, специфичность и точность составляли 100%, 99,8% и 99,8%. Положительные и отрицательные прогностические значения составили 93,8% и 100% соответственно.

    Таблица 5 Определение чувствительности к левофлоксацину с помощью Е-теста и секвенирование с мультиплексной количественной ПЦР gyrA

    Сравнение определения чувствительности к кларитромицину и левофлоксацину с помощью Е-теста и количественной ПЦР

    Тестирование чувствительности к кларитромицину и левофлоксацину с помощью E-теста и методов секвенирования было проведено на 59 H.pylori , в то время как количественная ПЦР была проведена на 136 H. pylori -положительных биоптатах. Сравнение методов (таблица 4) показало, что значения Каппа составляли 0,85 ( P = 0,016) и 0,97 ( P = 1,00), что указывает на то, что методы мультиплексной кПЦР гена 23S рРНК и кПЦР gyrA имели существенную степень достоверности. соответствия золотому стандарту Е-теста для выявления резистентности к кларитромицину и левофлоксацину. Для выявления устойчивости к кларитромицину 59 образцов биопсии были положительными с помощью посева и мультиплексной количественной ПЦР гена 23S рРНК.Из 571 образца биопсии 77 были отрицательными при культивировании, но имели амплификацию ДНК H. pylori и гена 23S рРНК с помощью количественной ПЦР. Среди 77 мультиплексных кПЦР образцов, положительных по гену 23S рРНК, 90,9% (n=70) имели штаммы, чувствительные к кларитромицину, 1,3% (n=1) были устойчивыми к кларитромицину (мутация A2142G) и 7,8% (n=6) содержали смешанные генотипы (четыре имели мутацию дикого типа + A2142G и два имели мутацию дикого типа + A2143G) (таблица 3).

    Таблица 6 Обнаружение генотипа смешанной резистентности в биоптатах антрального отдела и тела желудка

    59 культур-положительных H.pylori образцы имели 38 генотипов дикого типа и 21 мутантный генотип, обнаруженные секвенированием, также были обнаружены с помощью мультиплексной количественной ПЦР для гена 23S рРНК. Среди семи образцов, инфицированных резистентным генотипом, выявленным с помощью мультиплексной количественной ПЦР гена 23S рРНК, медиана бактериальной нагрузки штаммов A2142G в биоптатах составила 10 2 , а в биоптатах со смешанным генотипом — 10 3 и 10 2 бактериальной нагрузки дикого типа и мутантных генотипов соответственно (таблица 3).

    Обнаружение резистентности к левофлоксацину с помощью количественной ПЦР согласовывалось с методом Е-теста, при котором 44 из 136 положительных результатов биопсии показали присутствие штаммов дикого типа (таблица 5). Пятнадцать образцов имели один мутантный генотип, как определено секвенированием, однако мультиплексная количественная ПЦР gyrA показала смешанный генотип в 14 образцах. В семидесяти семи культурально-отрицательных биоптатах была обнаружена смешанная инфекция по данным мультиплексной количественной ПЦР анализа gyrA . В 76 мультиплексных qPCR gyrA -положительных образцах медиана бактериальной нагрузки в биоптатах со смешанной инфекцией дикого типа N87 и D91 составила 10 5 и 10 6 соответственно.При культурально-отрицательной биопсии медиана бактериальной нагрузки штаммов смешанного генотипа штаммов D91 и N87K дикого типа составляла 10 5 и 10 1 соответственно.

    Обнаружение смешанных генотипов

    В таблице 6 показано обнаружение различных генотипов резистентности в биоптатах из разных анатомических областей. Смешанный генотип устойчивости был выявлен у восьми пациентов, из которых у пяти пациентов были разные генотипы устойчивости к кларитромицину, а у трех — разные генотипы устойчивости к левофлоксацину.Для генотипа резистентности к кларитромицину преобладала инфекция тела желудка штаммами H. pylori , чем антрального отдела. Для левофлоксацина участок антрального отдела показал смешанную инфекцию диким типом и мутантным генотипом резистентности, в то время как участок корпуса был инфицирован либо одним генотипом дикого типа, либо мутантным генотипом.

    Обсуждение

    Методы диагностики инфекции H. pylori доступны, разнообразны, и выбор того или иного метода зависит от их преимуществ и недостатков в каждой методике.Ограничения, связанные с традиционными методами, такие как низкая концентрация H. pylori в образце биопсии, являются одной из основных причин невозможности обнаружить эту бактерию культуральным и другими традиционными методами. Молекулярные подходы, основанные на амплификации ДНК, использовались для обнаружения H. pylori в клинических образцах и образцах из окружающей среды. Сообщалось, что ген ureA является высокоспецифичным в Helicobacter spp. обнаружение. 35 Таким образом, в настоящем исследовании ген ureA был выбран для обнаружения методом количественной ПЦР из-за высококонсервативной области и отсутствия перекрестной гомологии с другими близкородственными бактериями или подвидами Helicobacter.

    Были исследованы успешное количественное определение, предел обнаружения и специфичность количественной ПЦР. В настоящем исследовании самая низкая обнаруженная концентрация ДНК H. pylori составляла один фемтограмм. Коэффициент корреляции, полученный с помощью линейного регрессионного анализа в этом эксперименте, составил R 2 =0,99, что свидетельствует о высокой эффективности и воспроизводимости реакций. Предел количественной ПЦР в этом исследовании (один фг) был ниже по сравнению с предыдущим отчетом Ribeiro et al., 36 , который сообщил о 10 фг.Анализ ureA qPCR также специфичен для обнаружения H. pylori , поскольку он положительно выявлял штаммы H. pylori при значениях C q ≤30 без флуоресцентного сигнала от других штаммов бактерий, продуцирующих уреазу, обнаруженных при этих C. q значений. Экспериментальное тестирование пары праймеров для количественной ПЦР показало высокую специфичность обнаружения штаммов H. pylori . Результат показал, что положительный результат qPCR был обнаружен в каждом протестированном штамме H.pylori и отрицательный результат на другие исследованные виды бактерий. Этот результат свидетельствует о том, что предложенные наборы праймеров обеспечивают специфическое обнаружение клинических штаммов H. pylori и могут быть полезны для диагностики инфекции H. pylori непосредственно при биопсии желудка.

    Была определена точка отсечки, которая использовалась для различения положительных и отрицательных результатов. Оптимальная точка отсечки была определена как положительная при наличии любого количества микроорганизмов (ПЦР в реальном времени> 0 микроорганизмов/человеческая клетка), предложенная Saez et al., 31 , в то время как Al-Moayad et al. 33 предложила пороговое значение одной бактерии на 100 клеток человека, чтобы отличить случаи от контроля.Из-за различий в лабораторной практике невозможно напрямую сравнить предлагаемую пороговую точку. Таким образом, в этом исследовании пороговое значение было рассчитано с использованием анализа кривой ROC, чтобы отличить положительные результаты от отрицательных анализов КПЦР. На основании полученных координат ROC-кривой значение 0,5 копий на 100 клеток человека было выбрано в качестве точки отсечки, имеющей наивысшую чувствительность и специфичность (наивысший индекс Юдена 98,5%). Кроме того, распределение значений C q ясно показывает, что значения C q всех положительных образцов биопсии были ниже и равны 30 циклам (, Приложение 3 ).Таким образом, образцы биопсии с 0,5 копиями, воспроизводимые при значениях C q ≤30, считались положительными при количественной ПЦР.

    С новой оптимальной точкой отсечки (количество копий 0,5), полученной в этом исследовании, метод количественной ПЦР, используемый для обнаружения H. pylori в образцах биопсии, является надежным тестом из-за его приемлемой чувствительности (96,4%) и специфичности (88,5%). ) с AUC 0,999.

    Распространенность инфекции H. pylori в Малайзии варьировала от 14,1 до 30.4%. 37–39 Положительные и отрицательные прогностические значения напрямую связаны с распространенностью заболевания/инфекции среди населения. 40 В настоящем исследовании мы наблюдали более низкую распространенность инфекции H. pylori (16,7%) при использовании обычных методов по сравнению с предыдущими исследованиями. В 2010 г. обычными методами была получена распространенность 30,8%, в то время как в 2013 г. сообщалось о 19,2% (положительный результат был определен посевом).pylori в настоящем исследовании может отражать PPV и NPV теста. Отношение правдоподобия является более информативным для измерения клинической полезности количественной ПЦР в диагностике инфекции H. pylori , поскольку этот параметр не зависит от распространенности. В настоящем исследовании +LR 8,72 указывает на 9-кратное увеличение вероятности того, что у пациента, инфицированного H. pylori , будет положительный результат количественной ПЦР. Значение +LR больше единицы, а –LR меньше единицы, полученное с помощью кПЦР, по сравнению с обычными методами указывает на то, что кПЦР, разработанная в этом исследовании, очень полезна для обнаружения H.pylori непосредственно из биопсии желудка.

    Анализ qPCR, нацеленный на ген ureA , используемый для обнаружения H. pylori в биопленке и питьевой воде, был проведен ранее. 35,43 Saez et al 31 показали, что чувствительность количественной ПЦР, нацеленной на ген ureA , используемого для обнаружения H. pylori в антральном отделе желудка у пациентов с кровотечением и без кровотечения, составила 97,9% и 94,7% соответственно, в то время как оно составило 68,4% у больных без кровотечения и 91,5% у больных с кровотечением из тела желудка.Специфичность как в антральном отделе (53,1% против 73%), так и в теле (56,3% против 78,4%) была ниже при кровотечении, чем у пациентов без кровотечения. Было обнаружено, что чувствительность и/или специфичность, полученные с использованием ureA- qPCR в этом исследовании, были выше, чем в предыдущих отчетах. 21,31,33,44 В этом исследовании был получен более высокий +LR (8,72 по сравнению с 4,3) и хороший –LR (0,04 по сравнению с 0,63) по сравнению с исследованием Ramirez-Lazaro et al. 45

    Метод количественной ПЦР показывает статистически значимо более высокий процент H.pylori по сравнению с обычными методами (23,8% против 14,7%, p <0,0001). Согласие между тестами по каппа-анализу было в значительной степени (0,67) для количественной ПЦР и традиционных методов. Наше исследование показало, что ложноотрицательные и ложноположительные случаи были определены как низкая плотность H. pylori обычными методами, поэтому точность количественной ПЦР может быть снижена. Более низкая скорость обнаружения традиционными методами из-за низкой концентрации H.pylori в образцах биопсии и микроаэробный рост, характерный для штаммов H. pylori 46 , являются причинами невозможности обнаружения с помощью культивирования и других традиционных методов. Чувствительность метода количественной ПЦР в этом исследовании была выше, чем у стандартных традиционных методов, что подтверждает результаты других исследований. 21,33,44 Более низкая специфичность относится к большему количеству ложноположительных результатов, которые были обнаружены в тесте, однако получено хорошее значение специфичности (>80%).Большое количество ложноположительных случаев, обнаруженных с помощью количественной ПЦР, вероятно, связано с обнаружением ДНК H. pylori в образцах с низким количеством бактерий, в то время как микроорганизм не был обнаружен с помощью обычных методов. 33 Таким образом, при использовании гипотетического идеального золотого стандарта специфичность количественной ПЦР будет выше. 47 Аналогичным образом He et al. 48 сообщили, что ДНК H. pylori была обнаружена с помощью количественной ПЦР в 24 образцах из 27, которые были отрицательными при культивировании.Lascols et al. 49 обнаружили ДНК H. pylori с помощью количественной ПЦР в девяти случаях, которые были отрицательными как при культивировании, так и при гистологии. Чувствительность и специфичность метода ureA qPCR зависят от оптимальной точки отсечки. Пороговое значение улучшит специфичность анализа, хотя чувствительность немного пострадает. 33 Способность обнаруживать бактерии при очень малом числе бактерий методом количественной ПЦР может поставить под угрозу его специфичность, когда в качестве золотого стандарта используются другие методы. 33 Это становится особенно очевидным, когда доля испытуемых с низкими показателями высока, что, вероятно, имело место в настоящем исследовании. Увеличение количества взятых образцов биопсии может увеличить бактериальную нагрузку в образцах, для которых необходимо пересчитать пороговое значение, и это улучшит специфичность анализа. 31 Кроме того, возможной причиной различий в обнаружении различными методами является топографическое распространение H.pylori в желудке, вызывая систематическую ошибку при отборе проб. Это может повлиять на уровень обнаружения H. pylori в каждом методе 45 и ошибки выборки, которые могут привести к различиям в плотности колонизации. 36 Несколько исследований показали, что эрадикация H. pylori при лечении некоторых желудочно-кишечных заболеваний может зависеть от плотности или локализации бактерий. 50,51

    Пары праймеров и зонды были разработаны для мультиплексного количественного ПЦР для обнаружения двух мишеней точечных мутаций в гене 23S рРНК и одной мишени последовательности дикого типа в образцах биопсии.В этом исследовании мультиплексные анализы требуют проверки и оптимизации, чтобы подтвердить, что результаты, полученные в результате мультиплексной реакции, совпадают с результатами, если реакции проводились по отдельности. Количественная чувствительность мультиплексной количественной ПЦР анализа гена 23S рРНК составляла <10 бактерий на реакционную пробирку, т. е. можно было обнаружить <20 копий гена 23S рРНК (две копии гена 23S рРНК, присутствующие в геноме H. pylori ). . Эти результаты аналогичны ранее опубликованным отчетам. 48,52 Результаты подтверждают, что количественная ПЦР может точно определить плотность H. pylori в слизистой оболочке желудка, в то время как другие традиционные методы не могут дать количественную оценку. Мультиплексная кПЦР анализа гена 23S рРНК является специфичной для обнаружения H. pylori , поскольку не было получено флуоресцентного сигнала от других протестированных видов бактерий, полученного во всех трех цветах флуоресценции, и полоса ПЦР не была амплифицирована. Мультиплексная кПЦР гена 23S рРНК, способная обнаружить два штамма в смеси с наименьшей долей мутантной ДНК, составила 1% (99/1).Этот результат лучше, чем результаты, опубликованные для анализов ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфического скорпиона (5%, 95/5) 53 и с использованием LightCycler (10%). 54–56

    В этом исследовании в общей сложности 35,6% (21/59) штаммов были устойчивы к кларитромицину по Е-тесту. Мультиплексная кПЦР гена 23S рРНК в образцах биопсии позволила выявить устойчивость к кларитромицину в 20,6% (28/136) образцов. Среди этих образцов 75% (21/28) были положительными на H. pylori , обнаруженными как культурой, так и количественной ПЦР.В семи H. pylori -негативных биоптатах с помощью посева КПЦР смогла обнаружить присутствие как одиночного мутантного генотипа, так и смешанного генотипа. Медиана бактериальной нагрузки H. pylori смешанного генотипа (штаммы, несущие мутации как A2142G, так и A2143G) является высокой, с бактериальной плотностью в диапазоне 10 2 бактериальных клеток. Этот результат указывает на то, что анализ qPCR можно использовать для выявления устойчивости H. pylori к кларитромицину и возможно определить количество микроорганизмов, присутствующих в образцах биопсии.Другие методы также полезны для количественного определения бактерий; однако у каждого метода есть слабые места. Культура является только полуколичественной и требует много времени. 49 Гистология также является полуколичественной, но ее точность относительно невысока. 47 Таким образом, метод количественной ПЦР позволяет диагностировать H. pylori и проводить тест на чувствительность к антибиотикам в один и тот же день, что намного быстрее, чем посев, для которого требуется не менее 5–10 дней. Несоответствие результатов между посевом и количественной ПЦР среди штаммов H.pylori -отрицательные биопсии анализировали методом секвенирования. Хотя секвенирование не смогло обнаружить смешанные генотипы на одних и тех же аллелях, оно показывает только мутировавшие генотипы A2142G или A2143G в образцах биопсии, что указывает на то, что этот мутантный штамм может быть инфекционным штаммом. Разумным объяснением могло бы быть то, что штаммы H. pylori несут две копии гена 23S рРНК в хромосомной ДНК с мутацией в одной копии гена, которая, как показано, придает устойчивость к кларитромицину. 57 Семь биоптатов с единичным мутантным (n=1) и смешанным генотипом (n=6) штаммов H. pylori были признаны ложноотрицательными при культивировании. Это может быть связано с низкой концентрацией бактериальной плотности, вероятными мертвыми клетками или снижением жизнеспособности микроорганизмов, присутствующих в образцах, которые не могут быть обнаружены культуральным методом. 58 H. pylori существует в жизнеспособной некультивируемой (коккоидной) форме, не может быть культивирован или обнаружен с помощью экспресс-теста на уреазу или гистологии, однако нежизнеспособная бактериальная ДНК была доступна для ПЦР-амплификации. 36,48,59 Этот результат показывает, что генотипический метод более чувствителен при обнаружении бактериальных популяций в тех же образцах, чем фенотипический метод. 58

    Высокие показатели мультиплексной количественной ПЦР гена 23S рРНК (чувствительность 100%; специфичность 98,7%), полученные в этом исследовании, сравнимы с предыдущими отчетами, которые показали, что диапазон чувствительности и специфичности составляет 90–100% и 92,5–99%. соответственно. 22,49,56,60,61 Потенциальные факторы, которые могут объяснить низкую специфичность, включая отрицательный результат посева, могут быть связаны с низкой плотностью бактериальных клеток и наличием мертвых бактериальных клеток.По сравнению с фенотипической резистентностью к кларитромицину, проверенной с помощью Е-теста, мутации, обнаруженные с помощью количественной ПЦР, продемонстрировали почти идеальное соответствие с Е-тестом, поскольку вся резистентность, обнаруженная с помощью Е-теста, могла быть обнаружена с помощью количественной ПЦР (Каппа = 0,85). Единственным рассматриваемым несоответствием была смесь чувствительных и устойчивых генотипов, которые были обнаружены с помощью количественной ПЦР, а не Е-теста. Такой подход позволяет рекомендовать его использование для выявления резистентности к кларитромицину непосредственно в биоптатах.

    Ожидается, что разработка молекулярного метода для обнаружения мутаций gyrA будет очень полезной для борьбы с H.pylori , эрадикационная терапия схемами, содержащими фторхинолоны. В этом исследовании количественная чувствительность анализа gyrA КПЦР составила <10 бактерий на реакцию, что указывает на то, что КПЦР может точно определить плотность H. pylori в слизистой оболочке желудка. Мультиплексная кПЦР- gyrA способна обнаружить два штамма в смеси с наименьшей долей мутантной ДНК (1%; соотношение 99/1). Доступные коммерческие тесты генотипирования на устойчивость к левофлоксацину у H.pylori не были предназначены для обнаружения мутаций N87 и D91 с помощью тройной gyrA кПЦР. 62 Таким образом, поскольку мутации N87 и D91 были распространены в штаммах, устойчивых к левофлоксацину, протестированных в этом исследовании, невозможность обнаружить эти устойчивые штаммы, вероятно, приведет к неэффективности лечения. 62 Поэтому были разработаны новые праймеры для обнаружения обеих мутаций (N87 и D91) в гене gyrA . Валидационные исследования мультиплексной количественной ПЦР- gyrA показали, что предложенные наборы праймеров привели к специфическому обнаружению мутаций гена gyrA в H.pylori клинических штаммов.

    В этом исследовании резистентность к левофлоксацину наблюдалась в 25,4% (15/59) образцов, что было определено с помощью Е-теста. Однако 11,7% (16/136) были резистентны к левофлоксацину, как определено мультиплексной количественной ПЦР gyrA . Среди этих образцов 93,8% (15/16) были 90 225 H. pylori 90 226 положительными, обнаруженными как культурой, так и количественной ПЦР. В одной H. pylori -негативной биопсии по культуре qPCR смогла обнаружить присутствие смешанного генотипа (D91 дикого типа с мутацией N87K).Интересно, что смеси восприимчивого (D91 дикого типа) и резистентного (N87K) штамма имели высокую бактериальную нагрузку (D91 дикого типа, 10 5 ; N87K, 10 1 бактериальных клеток). Это было подтверждено секвенированием, которое показало наличие обоих генотипов (дикий тип D91 и мутация N87K). Культивирование H. pylori из биопсии желудка часто затруднено и не всегда позволяет восстановить все бактериальные клетки, присутствующие в образце. Это открытие показывает, что генотипический метод более чувствителен, чем фенотипический. 58

    В этом исследовании сообщается об очень высоких показателях мультиплексной количественной ПЦР gyrA (с чувствительностью 100 %; специфичностью 99,8 %) для выявления устойчивости к левофлоксацину. Совпадение между тестами в соответствии с каппа-анализом было почти идеальной степенью (0,97) для количественной ПЦР и Е-теста, что указывает на то, что результат количественной ПЦР показал хорошее соответствие с Е-тестом. Существует только несоответствие относительно того, была ли количественная ПЦР лучше для обнаружения смесей между чувствительными и устойчивыми генотипами, чем Е-тест.Эти результаты показывают, что множественная количественная ПЦР gyrA продемонстрировала высокую эффективность для обнаружения устойчивости H. pylori к левофлоксацину в образцах биопсии.

    Настоящее исследование показывает, что присутствие более чем одного генотипа в одном образце биопсии может быть связано либо с множественными штаммами, которые сосуществуют в одном и том же месте слизистой оболочки желудка, либо с наличием мутантных аллелей и аллелей дикого типа одного и того же штамма. 62–64 Kargar et al. 24 выявили, что приобретение устойчивости к антибиотикам может быть вызвано горизонтальным переносом от устойчивых клеток к восприимчивым клеткам того же штамма, что приводит к увеличению популяции устойчивых штаммов.Гетерорезистентность также будет обнаружена неправильно, если не будет использован специальный метод для обнаружения разнообразия последовательностей в генах, связанных с устойчивостью. 65 В этом исследовании с помощью количественной ПЦР удалось обнаружить присутствие смешанных генотипов в H. pylori -отрицательных биоптатах с помощью культуры, и смешанные генотипы все еще дают бактериальную нагрузку (10 1 бактериальных клеток для N87K и 10 5 бактериальных клеток для D91WT). Разумным объяснением может быть то, что эти смешанные последовательности вызваны смешанной инфекцией 27 , потому что присутствует единственная копия гена gyrA в штамме H.pylori геном. 34 Наличие смешанной популяции H. pylori в одном и том же образце, обнаруженном с помощью количественной ПЦР, является преимуществом по сравнению с посевом.

    Анализ генотипа резистентности в различных анатомических участках биоптатов желудка (антрального отдела и тела желудка) показывает наличие у пациентов смешанных генотипов резистентности H. pylori . Мы определили, что штаммы, устойчивые к кларитромицину, преимущественно инфицировали тело тела, в то время как штаммы, устойчивые к левофлоксацину, инфицировали как антральный отдел, так и тело желудка.Кроме того, в антральном отделе выявлен смешанный генотип устойчивости к левофлоксацину (дикий тип и мутантные штаммы). Хотя количество образцов со смешанной инфекцией было небольшим, это подтверждает гипотезу о том, что существование гетерогенных штаммов H. pylori в разных анатомических участках желудка имеет место. 66 Это показывает, что мультиплексный анализ количественной ПЦР в данном исследовании способен выявлять различные генотипы резистентности штаммов H. pylori , которые не могут быть обнаружены культуральным методом.Существует вероятность того, что смешанные генотипы устойчивости к антибиотикам не могут быть обнаружены в одной индивидуальной биопсии и приведут к необнаруженной устойчивости к антибиотикам, если одиночная биопсия будет проанализирована для определения чувствительности к противомикробным препаратам. Неоднородность H. pylori имеет важное клиническое значение и предполагает, что один участок биопсии нельзя считать репрезентативным для профиля чувствительности к противомикробным препаратам. 65 Несколько авторов указали, что для оценки антибиотикорезистентности H.pylori штаммов. 66–69

    В заключение, мы разработали мультиплексный анализ количественной ПЦР, который обеспечивает надежное, точное, быстрое и экономически эффективное обнаружение и может быть легко выполнен и количественно определен инфекции H. pylori непосредственно в биоптатах желудка, а также обеспечивает определение устойчивости к мутациям кларитромицин и левофлоксацин быстро. Тест кПЦР на ureA для обнаружения H. pylori и два оцененных мультиплексных теста кПЦР для обнаружения мутаций в гене 23S рРНК и gyrA могут преодолеть недостатки культивирования и других традиционных методов.Таким образом, результаты настоящего исследования могут иметь важное значение для клинического лечения инфекции. Обнаружение смешанной популяции в одном и том же образце биопсии с помощью количественной ПЦР является преимуществом для преодоления неправильной интерпретации общего профиля чувствительности штамма к антибиотикам. Хорошая эффективность разработанного мультиплексного количественного ПЦР в настоящем исследовании полезна для диагностики инфекции H. pylori и обнаружения мутаций в штаммах, устойчивых к кларитромицину и левофлоксацину.Это поможет улучшить лечение инфекции H. pylori за счет снижения развития вторичной резистентности, которая оказывает негативное влияние на ликвидацию инфекции H. pylori .

    Заявление об обмене данными

    Данные будут переданы и доступны от соответствующего автора по обоснованному запросу.

    Этическое одобрение и информированное согласие

    Исследование одобрено Комитетом по этике медицинских исследований Университета (UKM 1.5.3.5/244/ЭТП-2013-042) и от каждого пациента было получено письменное информированное согласие. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

    Подтверждение

    Мы хотели бы поблагодарить Universiti Kebangsaan Malaysia за предоставление разрешения и условий для проведения и публикации этого исследования. Большое спасибо вспомогательному персоналу кафедры медицинской микробиологии и иммунологии медицинского факультета UKM за их техническую поддержку во время исследования.Мы также хотели бы поблагодарить доктора Бруно С. Лопеса из Университета Абердина, Соединенное Королевство, за критический обзор рукописи. Исследование финансировалось за счет гранта Universiti Kebangsaan Malaysia в рамках Схемы исследовательского фонда программы экономических преобразований (грант № ETP-2013-042).

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

    Каталожные номера

    1. Абади АТБ, Кустерс Дж.Г. Ведение инфекций Helicobacter pylori . ВМС Гастроэнтерол . 2016;16(1):94. дои: 10.1186/s12876-016-0496-2

    2. Suerbaum S, Michetti P. Helicobacter pylori инфекция. N Английский J Med . 2002;347(15):1175–1186. дои: 10.1056/NEJMra020542

    3. Хоутон Дж., Ван Т.С. Helicobacter pylori и рак желудка: новая парадигма эпителиального рака, связанного с воспалением. Гастроэнтерология . 2005;128(6):1567–1578. doi:10.1053/j.gastro.2005.03.037

    4.Боянова Л., Митов И. Географическая карта и эволюция первичной резистентности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. Expert Rev Anti Infect Ther . 2010;8(1):59–70. doi:10.1586/eri.09.113

    5. Cuadrado-Lavín A, Salcines-Caviedes JR, Carrascosa MF, et al. Антимикробная чувствительность Helicobacter pylori к шести антибиотикам, используемым в настоящее время в Испании. J Антимикроб Chemother . 2012;67(1):170–173. doi:10.1093/jac/dkr410

    6.Меграуд Ф. Устойчивость к антибиотикам H. pylori : распространенность, важность и успехи в тестировании. Гут . 2004;53(9):1374–1384. дои: 10.1136/кишка.2003.022111

    7. Chey WD, Leontiadis GI, Howden CW, Moss SF. Клинические рекомендации ACG: лечение инфекции Helicobacter pylori . Am J Гастроэнтерол . 2017;112(2):212–239. doi:10.1038/ajg.2016.563

    8. Liou JM, Chang CY, Sheng WH, et al. Генотипическая резистентность в штаммах Helicobacter pylori коррелирует с тестом на чувствительность и результатами лечения после терапии на основе левофлоксацина и кларитромицина. Антимикробные агенты Chemother . 2011;55(3):1123–1129. doi:10.1128/AAC.01131-10

    9. Нисидзава Т., Судзуки Х. Механизмы устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам и молекулярное тестирование. Фронт Мол Биоски . 2014;1(19). doi:10.3389/fmolb.2014.00019

    10. Гарридо Л., Толедо Х. Новые генотипы в Helicobacter pylori с участием домена V гена 23S рРНК. Хеликобактер . 2007;12(5):505–509. дои: 10.1111/j.1523-5378.2007.00506.x

    11. Thung I, Aramin H, Vavinskaya V, et al. Обзорная статья: глобальное появление устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам. Алимент Фармакол Тер . 2016;43(4):514–533. дои: 10.1111/кв.13497

    12. Сингх П., Джайн А., Диксит П. и др. Распространенность мутаций генов gyrA и B в устойчивых и чувствительных к фторхинолонам клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis и их взаимосвязь с МИК офлоксацина. J Антибиот . 2015;68(1):63–66. doi:10.1038/ja.2014.95

    13. Контрерас М., Гарсия-Амадо М.А., Микеланджели Ф., Контрерас М., Пенья Дж. Точечные мутации в генах gyrA и gyrB левофлоксацин-резистентных изолятов Helicobacter pylori в слизистой оболочке пищевода венесуэльской популяции. Am J Trop Med Hyg . 2018;98(4):1051–1055. doi:10.4269/ajtmh.17-0478

    14. Wang LH, Cheng H, Hu FL, Li J. Распределение мутаций gyrA в устойчивых к фторхинолонам штаммах Helicobacter pylori . World J Гастроэнтерол . 2010;16(18):2272–2277. дои: 10.3748/wjg.v16.i18.2272

    15. Chung JW, Lee GH, Jeong JY, et al. Устойчивость штаммов Helicobacter pylori к антибиотикам в Корее с упором на устойчивость к фторхинолонам. J Гастроэнтерол Гепатол . 2012 г.; 2012;27 :(3):493–497. doi:10.1111/j.1440-1746.2011.06874.x

    16. Саббах П., Мохаммадния-Афроузи М., Джаванян М. и др. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori : идеалы, варианты и ограничения. Eur J Clin Microbiol Infect Dis . 2019;38(1):55–66. doi: 10.1007/s10096-018-3414-4

    17. Сунь Л., Таларико С., Яо Л. и др. Обнаружение резистентности к кларитромицину в изолятах Helicobacter pylori на основе капельной цифровой ПЦР выявляет частую гетерорезистентность. Дж Клин Микробиол . 2018;56(9):e00019–18. doi:10.1128/JCM.00019-18

    18. Бекман Э., Сарачино И., Фиорини Г. и др. Новый ПЦР-тест кала на Helicobacter pylori может прогнозировать резистентность к кларитромицину и эрадикацию инфекции с высокой скоростью. Дж Клин Микробиол . 2017;55(8):2400–2405. doi: 10.1128/JCM.00506-17

    19. Беер-Дэвидсон Г., Хиндие М., Мухсен К. Обнаружение Helicobacter pylori в образцах стула маленьких детей с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Хеликобактер . 2018;23(1):e12450. дои: 10.1111/сл.12450

    20. Лосурдо Г., Джорджио Ф., Приччи М. и соавт. Обнаружение первичной и вторичной генотипической устойчивости Helicobacter pylori к кларитромицину и левофлоксацину в стуле: 4-летний сценарий в Южной Италии. Антибиотики (Базель) . 2020;9(10):723. doi:10.3390/антибиотики23

    21. Пишон М., Пичард Б., Барриоз Т. и др. Диагностическая точность неинвазивного теста для обнаружения Helicobacter pylori и устойчивости к кларитромицину в стуле с помощью амплидиага, H. pylori + ClariR ПЦР в реальном времени. Дж Клин Микробиол . 2020;58(4):e01787–19. doi: 10.1128/JCM.01787-19

    22. Schabereiter-Gurtner C, Hirschl AM, Dragosics B, et al. Новый ПЦР-анализ в реальном времени для обнаружения инфекции Helicobacter pylori и одновременного тестирования чувствительности образцов кала и биопсии к кларитромицину. Дж Клин Микробиол . 2004;42(10):4512–4518. doi: 10.1128/JCM.42.10.4512-4518.2004

    23. Monno R, Giorgio F, Carmine P, Soleo L, Cinquepalmi V, Ierardi E. Устойчивость Helicobacter pylori к кларитромицину, обнаруженная с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени Etest и TaqMan: сравнительное исследование. АПМИС . 2012;120(9):712–717. doi:10.1111/j.1600-0463.2012.02896.x

    24. Kargar M, Doosti A, Ghorbani-Dalini S. Обнаружение четырех точечных мутаций устойчивости к кларитромицину в Helicobacter pylori : сравнение методов ПЦР в реальном времени и ПЦР-ПДРФ. Комп Клин Патол . 2013;22(5):1007–1013. doi:10.1007/s00580-012-1519-1

    25. Jaka H, ​​Rüttgerodt N, Bohne W, et al. Мутации Helicobacter pylori , придающие резистентность к фторхинолонам и кларитромицину у пациентов с диспепсией, посещающих больницу третичного уровня, Танзания. Банка J Гастроэнтерол Гепатол . 2019;2019:7. дои: 10.1155/2019/8481375

    26. Li Y, Lv T, He C и др. Оценка мультиплексной ARMS-ПЦР для обнаружения мутаций Helicobacter pylori , придающих устойчивость к кларитромицину и левофлоксацину. Гат Патог . 2020;12(1):1–12. doi:10.1186/s13099-020-00373-6

    27. Эгли К., Вагнер К., Келлер П.М., Риш Л., Риш М., Бодмер Т. Сравнение диагностической эффективности количественной ПЦР, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования при определении устойчивости к кларитромицину и левофлоксацину у Helicobacter pylori . Front Cell Infect Microbiol . 2020;10:596371. doi:10.3389/fcimb.2020.596371

    28. Альфиза Х., Хасяни Б., Раджа Аффенди Р.А., Иса М.Р., Лопес Б.С.Молекулярная характеристика и распространенность устойчивости к антибиотикам у изолятов Helicobacter pylori в Куала-Лумпуре, Малайзия. Заражение лекарственной устойчивостью . 2019;12:3051–3061. doi: 10.2147/IDR.S219069

    29. Shahamat M, Alavi M, Watts JE, et al. Разработка двух методик на основе ПЦР для выявления спиральной и кокковой форм Helicobacter pylori . Дж. Клин. Микробиол . 2004;42(8):3613–3619. doi: 10.1128/JCM.42.8.3613-3619.2004

    30.Томпсон Д.Д., Хиггинс Д.Г., Гибсон Т.Дж., В.К. Повышение чувствительности прогрессивного множественного выравнивания последовательностей за счет взвешивания последовательностей, штрафов за пробелы для конкретных позиций и выбора матрицы весов. Рез. нуклеиновых кислот . 1994;22(22):4673–4680. doi:10.1093/нар/22.22.4673

    31. Saez J, Belda S, Santibáñez M, et al. ПЦР в реальном времени для диагностики инфекции Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта: сравнение с другими классическими методами диагностики. Дж Клин Микробиол . 2012;50(10):3233–3237. doi: 10.1128/JCM.01205-12

    32. Гангисетти О., Редди Д.С. Оптимизация анализа RT-PCR TaqMan в реальном времени для профилирования транскрипции пластичности субъединиц рецептора GABA-A. Методы J Neurosci . 2009;181(1):58–66. doi:10.1016/j.jneumeth.2009.04.016

    33. Аль-Моаяд Э.Э., Альгалиби С.М., Аль-Шамахи Х.А., Нашер А.Т., Аль-хебши Н.Н. Нормализованная ПЦР в реальном времени для диагностики инфекции H. pylori . Катар Мед J .2014;2:123–129.

    34. Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. Полная последовательность генома желудочного патогена Helicobacter pylori . Природа . 1997;388(6642):539–547. дои: 10.1038/41483

    35. McDaniels A, Wymer L, Rankin C, Haugland R. Оценка количественной ПЦР в реальном времени для измерения Helicobacter pylori при низких концентрациях в питьевой воде. Вода Res . 2005;39(19):4808–4816. doi: 10.1016 / j.waters.2005.09.030

    36. Рибейро М.Л., Экклиссато К.С., Маттос Р.Г., Мендонка С., Педраццоли Дж.Дж. Количественная ПЦР в реальном времени для клинического обнаружения Helicobacter pylori . Генет Мол Биол . 2007;30(2):431–434. дои: 10.1590/S1415-47572007000300022

    37. Hooi JK, Lai WY, Ng WK, et al. Глобальная распространенность инфекции Helicobacter pylori: систематический обзор и метаанализ. Гастроэнтерология . 2017;153(2):420–429. doi:10.1053/j.gastro.2017.04.022

    38.Сасидхаран С., Гаетри Б., Равичандран М. и др. Распространенность инфекции Helicobacter pylori среди пациентов, направленных на эндоскопию: гендерные и этнические различия в Кедахе, Малайзия. Asian Pac J Trop Dis . 2012;2(1):55–59. дои: 10.1016/S2222-1808(12)60013-9

    39. Ю С.Дж., Ян П., Йи Л.И. Распространенность инфекции Helicobacter pylori среди пациентов, посещающих отделение гастроэнтерологической эндоскопии в больнице Серданг. Малайзия J Med Health Sci . 2015;11(1):11–17.

    40.Парих Р., Матай А., Парих С., Сехар Г.К., Томас Р. Понимание и использование чувствительности, специфичности и прогностических значений. Индийский J Офтальмол . 2008;56(1):45. дои: 10.4103/0301-4738.37595

    41. Alfizah H, Rizal A, Isa M, Aminuddin A, Jasmi A, Ramelah M. Четырехлетний анализ инфекции Helicobacter pylori среди пациентов с диспепсией в медицинском центре Universiti Kebangsaan Malaysia. Медицинское Здоровье . 2010;5:13–21.

    42. Хамат Р., Эмран Н.А., Осман М. и соавт.Этнические различия в распространенности, клиническом исходе и профилях вирулентности cag островов патогенности ( cag PAI) штаммов Helicobacter pylori из Малайзии. Pertanika J Trop Agric Sci . 2013; 36: 289–298.

    43. Linke S, Lenz J, Gemein S, Exner M, Gebel J. Обнаружение Helicobacter pylori в биопленках методом ПЦР в реальном времени. Lnt J Hyg Environ Health . 2010;213(3):176–182. doi:10.1016/j.ijheh.2010.03.006

    44.Кумар А., Имран М., Сингх А., Чандел Д., Талвар А. Обнаружение Helicobacter pylori при гастродуоденальных заболеваниях с помощью ПЦР в реальном времени. J Biomed Sci Res . 2010;2(3):170–178.

    45. Ramirez-Lazaro MJ, Lario S, Casalots A, et al. ПЦР в реальном времени улучшает обнаружение Helicobacter pylori у пациентов с кровотечением из пептической язвы. PLoS One . 2011;6(5):e20009. doi:10.1371/journal.pone.0020009

    46. Дэн Л, Хэ XY, Тан Б, Сян Ю, Юэ Дж.Дж. Усовершенствованная технология количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для обнаружения Helicobacter pylori в ткани желудка и ценность ее применения в клинических испытаниях точности. БМС Биотехнолог . 2020;20(1):33. дои: 10.1186/s12896-020-00624-z

    47. Абади АТБ. Диагностика Helicobacter pylori с использованием инвазивных и неинвазивных подходов. Дж Патог . 2018;

  • 52. дои: 10.1155/2018/
  • 52

    48. Он К., Ван Д.П., Осато М., Лахман Л.Б. Количественная ПЦР в реальном времени для обнаружения Helicobacter pylori . Дж Клин Микробиол . 2002;40(10):3720–3728. doi: 10.1128/JCM.40.10.3720-3728.2002

    49.Ласколс С., Ламарк Д., Коста Дж. М. и др. Быстрое и точное количественное определение Helicobacter pylori и идентификация мутаций устойчивости к кларитромицину в изолятах H. pylori из образцов биопсии желудка с помощью ПЦР в реальном времени. Дж Клин Микробиол . 2003;41(10):4573–4577. doi:10.1128/JCM.41.10.4573-4577.2003

    50. Леодольтер А., Волле К., Малфертейнер П. Текущие стандарты диагностики инфекции Helicobacter pylori . Dig Dis .2001;19(2):116–122. дои: 10.1159/000050665

    51. Вайра Д., Вакил Н., Менегатти М. и соавт. Анализ кала на антиген Helicobacter pylori после эрадикационной терапии. Энн Интерн Мед . 2002;136(4):280–287. дои: 10.7326/0003-4819-136-4-200202190-00007

    52. Шукла С., Прасад К., Трипати А., Гошал У., Кришнани Н., Нужат Х. Количественное определение гена Helicobacter pylori ureC и его сравнение с различными диагностическими методами и гистопатологией желудка. J Микробиологические методы . 2011;86(2):231–237. doi:10.1016/j.mimet.2011.05.012

    53. Burucoa C, Garnier M, Silvain C, Fauchère JL. Квадруплексный анализ ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфических праймеров скорпионов для обнаружения мутаций, придающих устойчивость к кларитромицину Helicobacter pylori . Дж Клин Микробиол . 2008;46(7):2320–2326. дои: 10.1128/JCM.02352-07

    54. Элвисс Н.К., Лоусон А.Дж., Оуэн Р.Дж. Применение ПЦР с 3′-несовпадающими обратными праймерами по сравнению с ПЦР в реальном времени и ПЦР-ПДРФ для быстрого обнаружения мутаций 23S рДНК, связанных с устойчивостью к кларитромицину, у Helicobacter pylori . Противомикробные агенты Int J . 2004;23(4):349–355. doi:10.1016/j.ijantimicag.2003.09.015

    55. Francesco VD, Margiotta M, Zullo A, et al. Первичная устойчивость к кларитромицину в Италии оценивалась на последовательностях ДНК Helicobacter pylori с помощью полимеразной цепной реакции TaqMan в реальном времени. Алимент Фармакол Тер . 2006;23(3):429–435. doi:10.1111/j.1365-2036.2006.02769.x

    56. Олеастро М., Менар А., Сантос А. и др. ПЦР в реальном времени для быстрого и точного обнаружения точечных мутаций, придающих устойчивость к кларитромицину в Helicobacter pylori . Дж Клин Микробиол . 2003;41(1):397–402. doi:10.1128/JCM.41.1.397-402.2003

    57. Биньямин Д., Пастух Н., Он А., Парицкий М., Перец А. Фенотипическая и генотипическая корреляция, выраженная в устойчивости Helicobacter pylori к кларитромицину и фторхинолонам. Гат Патог . 2017;9(1):48. doi:10.1186/s13099-017-0198-5

    58. Agudo S, Alarcón T, Urruzuno P, Martínez MJ, López-Brea M. Обнаружение Helicobacter pylori и устойчивости к кларитромицину в биоптатах желудка у детей с использованием коммерчески доступной полимеразной цепной реакции в реальном времени после полуавтоматической ДНК NucliSens. добыча. Диагностика Microbiol Infect Dis . 2010;67(3):213–219. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2010.02.021

    59. Аткинс К.Л., Аткинсон Р.М., Шанкс А., Парвин К.А., Данн В.М., Гросс Г. Оценка полимеразной цепной реакции для обнаружения стрептококка группы В с использованием усовершенствованного метода культивирования. Акушерство Гинекол . 2006;108(3):488–491. doi:10.1097/01.AOG.0000228961.42272.31

    60. Bilgilier C, Stadlmann A, Makristathis A, et al. Проспективное многоцентровое клиническое исследование меж- и внутрипациентной генетической изменчивости устойчивости к противомикробным препаратам Helicobacter pylori . Clin Microbiol Infect . 2018;24(3):267–272. doi:10.1016/j.cmi.2017.06.025

    61. Чисхолм С.А., Оуэн Р.Дж. Частота и молекулярные характеристики устойчивых к ципрофлоксацину и рифампицину Helicobacter pylori при желудочных инфекциях в Великобритании. J. Med. Микробиол . 2009;58(10):1322–1328. doi:10.1099/jmm.0.011270-0

    62. Треспаласиос А.А., Римбара Э., Отеро В., Редди Р., Грэм Д.Ю. Усовершенствованные аллель-специфические ПЦР-анализы для обнаружения устойчивых к кларитромицину и фторхинолонам Helicobacter pylori в биоптатах желудка: идентификация мутации N87I в gyrA . Диагностика Microbiol Infect Dis . 2015;81(4):251–255. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2014.12.003

    63. Ногучи Н., Римбара Э., Като А. и др. Обнаружение смешанных устойчивых и чувствительных к кларитромицину Helicobacter pylori с помощью вложенной ПЦР и прямого секвенирования ДНК, выделенной из фекалий. Дж Мед Микробиол . 2007;56(9):1174–1180. doi:10.1099/jmm.0.47302-0

    64. Van Der Ende A, Van Doorn LJ, Rooijakkers S, Feller M, Tytgat G, Dankert J. Кларитромицин-чувствительные и устойчивые H.pylori с идентичными случайно амплифицированными полиморфными генотипами ДНК-ПЦР, культивированными из отдельных образцов биопсии желудка до лечения антибиотиками. Дж Клин Микробиол . 2001;39(7):2648–2651. doi:10.1128/JCM.39.7.2648-2651.2001

    65. Cohen T, van Helden PD, Wilson D, et al. Инфекции, вызванные смешанными штаммами Mycobacterium tuberculosis , и их значение для лечения и контроля туберкулеза. Clin Microbial Rev . 2012;25(4):708–719. doi:10.1128/CMR.00021-12

    66. Pichon M, Tran CT, Motillon G, et al. Где делать биопсию для выявления Helicobacter pylori и сколько биопсий необходимо для выявления устойчивости к антибиотикам в желудке человека. Дж Клин Мед . 2020;9(9):2812. дои: 10.3390/jcm

    12

    67. Mi M, Wu F, Zhu J, et al. Гетерогенность штаммов Helicobacter pylori , выделенных от пациентов с желудочными заболеваниями в Гуйяне, Китай. Заражение лекарственной устойчивостью . 2021; 14: 535–545. дои: 10.2147/IDR.S287631

    68. Сато К., Кимура К., Танигути Ю. и др. Места биопсии, подходящие для диагностики инфекции Helicobacter pylori и оценки степени атрофического гастрита. Am J Гастроэнтерол . 1998;93(4):569–573. doi:10.1111/j.1572-0241.1998.166_b.x

    69. Масуда Х., Хияма Т., Йошихара М. и др. Необходимость множественных биопсий желудка из разных мест для выявления устойчивых к кларитромицину штаммов Helicobacter pylori . Scand J Гастроэнтерол . 2003;38(9):942–946. дои: 10.1080/00365520310004731

    KoreaMed Synapse

    1. Suerbaum S, Michetti P. Инфекция Helicobacter pylori. N Engl J Med. 2002 г.; 347 (15): 1175–1186. PMID: 12374879.
    2. Данн Б.Э., Коэн Х., Блазер М.Дж. Хеликобактер пилори. Clin microbiol Rev. 1997; 10(4):720–741. PMID: 9336670.
    3. Warren JR, Marshall B. Неидентифицированные изогнутые бациллы на эпителии желудка при активном хроническом гастрите. Ланцет. 1983 год; 1 (8336): 1273–1275.PMID: 6134060.
    4. Бассет С., Холтон Дж., Вайра Д. Хеликобактер: изменение парадигмы язвенной болезни и многое другое? прог. 2002 г.; 85 (часть 1): 13–31. PMID: 11969117.
    5. Линц Б., Баллу Ф., Мудли Й., Маника А., Лю Х., Руманьяк П., Фалуш Д., Стамер С., Пруньолле Ф., ван дер, Ямаока Й., Грэм Д.Ю., Перес-Траллеро Э., Вадстром Т., Суэрбаум С., Ахтман M. Африканское происхождение тесной связи между людьми и Helicobacter pylori. Природа. 2007 г.; 445 (7130): 915–918. PMID: 17287725.
    6.Пак Д.У., Ли К.Дж., Джин С.Х., Ли Д.Х., Мин Д.С., Пак С.Х., Ю Х.Дж., Банг Х.И., Ли Ч.И. Фенотипические различия рака желудка в зависимости от инфекции Helicobacter pylori у корейских пациентов. J Рак желудка. 2010 г.; 10(4):168–174. PMID: 22076182.
    7. Уэмура Н., Окамото С., Ямамото С., Мацумура Н., Ямагути С., Ямакидо М., Танияма К., Сасаки Н., Шлемпер Р.Дж. Инфекция Helicobacter pylori и развитие рака желудка. N Engl J Med. 2001 г.; 345 (11): 784–789. PMID: 11556297.
    8. Полк Д.Б., Пик Р.М. мл.Helicobacter pylori: рак желудка и не только. Нат Рев Рак. 2010 г.; 10(6):403–414. PMID: 20495574.

    9. Международное агентство по изучению рака (IARC). Шистосомы, печеночные сосальщики и Helicobacter pylori. Монографии IARC по оценке канцерогенных рисков для человека. 1994. Женева, Швейцария: Всемирная организация здравоохранения; с. 177–220.

    10. Пак Д.У., Ли К.Дж., Джин С.Х., Ли Д.Х., Мин Д.С., Пак С.Х., Ю Х.Дж., Банг Х.И., Ли Д.И. Фенотипические различия рака желудка в зависимости от инфекции Helicobacter pylori у корейских пациентов.J Рак желудка. 2010 г.; 10(4):168–174. PMID: 22076182.
    11. Анвар М.М., Юссеф А.И., Шета М.И., Заки А., Бернаба Н.Р., Эль-Тухи М.А. Оценка специфических биохимических показателей Helicobacter pylori-ассоциированного рака желудка в Египте. East Mediterr Health J. 2012; 18(5):501–507. PMID: 22764438.
    12. Ху Л.Т., Мобли Х.Л. Очистка и N-концевой анализ уреазы Helicobacter pylori. Заразить иммун. 1990 г.; 58(4):992–998. PMID: 2318539.
    13. Итон К.А., Брукс К.Л., Морган Д.Р., Краковка С.Существенная роль уреазы в патогенезе гастрита, вызванного Helicobacter pylori, у гнотобиотических поросят. Заразить иммун. 1991 год; 59(7):2470–2475. PMID: 2050411.
    14. Mégraud F. Наиболее важные методы диагностики Helicobacter pylori в настоящее время и в будущем. Eur J Гастроэнтерол Гепатол. 2012 г.; 9 (Приложение 1): S13–S15. PMID: 22498901.
    15. Leal YA, Flores LL, Fuentes-Pananá EM, Cedillo-Rivera R, Torres J. Дыхательный тест с 13C-мочевиной для диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей: систематический обзор и метаанализ.Хеликобактер. 2011 г.; 16(4):327–337. PMID: 21762274.
    16. Nyan DC, Welch AR, Dubois A, Coleman WG Jr. Разработка неинвазивного метода обнаружения и мониторинга динамики инфекции Helicobacter pylori. Заразить иммун. 2004 г.; 72 (9): 5358–5364. PMID: 15322033.
    17. Falsafi T, Favaedi R, Mahjoub F, Najafi M. Применение теста ПЦР кала для диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей. Мир J Гастроэнтерол. 2009 г.; 15(4):484–488. PMID: 155.
    18. Сантос А.М., Лопес Т., Олеастро М., Чавес П., Кордейро Р., Феррейра М., Перейра Т., Мачадо Дж., Геррейро А.С.Роль 13C-уреазного дыхательного теста в экспериментальной модели инфекции Helicobacter pylori у мышей. Хеликобактер. 2011 г.; 16(4):320–326. PMID: 21762273.
    19. Hirayama F, Takagi S, Yokoyama Y, Iwao E, Ikeda Y. Установление желудочной инфекции Helicobacter pylori у монгольских песчанок. J Гастроэнтерол. 1996 год; 31 (Приложение 9): 24–28. PMID: 8959513.
    20. Чжан С., Мосс С.Ф. Модели инфекции, воспаления и заболевания Helicobacter на грызунах. Методы Мол Биол. 2012 г.; 921:89–98. PMID: 23015495.
    21.Гьяра П., Росси М., Маркетти М., Ди Томмазо А., Виндиньи С., Чамполини Ф., Коваччи А., Телфорд Дж.Л., Де Магистрис М.Т., Пицца М., Раппуоли Р., Дель Джудиче Г. Терапевтическая внутрижелудочная вакцинация против Helicobacter pylori у мышей уничтожает в противном случае хронической инфекции и обеспечивает защиту от повторного заражения. Заразить иммун. 1997 год; 65 (12): 4996–5002. PMID: 9393788.
    22. Крэбтри Дж. Э. Эрадикация хронической инфекции Helicobacter pylori с помощью терапевтической вакцинации. Кишка. 1998 год; 43(1):7–8. PMID: 9771398.
    23. Гомес-Дуарте О.Г., Буманн Д., Мейер Т.Ф. Подход к аттенуированной вакцине против сальмонеллы для борьбы с заболеваниями, связанными с Helicobacter pylori. вакцина. 1999 г.; 17 (13-14): 1667–1673. PMID: 10194821.
    24. Ruiz-Bustos E, Sierra-Beltran A, Romero MJ, Rodriguez-Jaramillo C, Ascencio F. Защита мышей BALB/c от экспериментальной инфекции Helicobacter pylori путем пероральной иммунизации белками, связывающими гепарансульфат H. pylori, связанными с бета-холерным токсином. -субъединица. J Med Microbiol. 2000 г.; 49(6):535–541.PMID: 10847207.
    25. Wang X, Hirmo S, Willén R, Wadström T. Ингибирование инфекции Helicobacter pylori гликоконъюгатами коровьего молока на модели мышей BAlb/cA. J Med Microbiol. 2001 г.; 50(5):430–435. PMID: 11339250.
    26. Wada T, Aiba Y, Shimizu K, Takagi A, Miwa T, Koga Y. Терапевтический эффект бычьего лактоферрина у хозяина, инфицированного Helicobacter pylori. Scand J Гастроэнтерол. 1999 г.; 34(3):238–243. PMID: 10232866.

    27. Lee HA, Hong S, Oh HG, Park SH, Kim YC, Park H, Jeong GS, Kim O.Антибактериальная активность Sanguisorba officinalis в отношении Helicobacter pylori. Лаборатория Аним Рез. 2010 г.; 26(3):257–263.

    28. Варбанова М., Малфертейнер П. Бактериальная нагрузка и степень воспаления слизистой оболочки желудка при инфекции Helicobacter pylori. Копать Дис. 2011 г.; 29(6):592–599. PMID: 22179216.
    29. Graham DY, Fischbach L. Лечение Helicobacter pylori в эпоху повышения устойчивости к антибиотикам. Кишка. 2010 г.; 59(8):1143–1153. PMID: 20525969.
    30. Гисберт Дж. П., Пахарес Дж. М. Лечение инфекции Helicobacter pylori: прошлое и будущее.Европейский J Стажер Мед. 2010 г.; 21(5):357–359. PMID: 20816583.
    31. Vaira D, Holton J, Menegatti M, Ricci C, Landi F, Ali’ A, Gatta L, Acciardi C, Farinelli S, Crosatti M, Berardi S, Miglioli M. Новые иммунологические тесты для диагностики инфекции Helicobacter pylori. Кишка. 1999 г.; 45 (Приложение 1): I23–I27. PMID: 10457032.
    32. Хошина С., Кан С.М., Цзян В., Грин П.Х., Ной Х.К., Чин Н., Моротоми М., ЛоГерфо П., Вайнштейн И.Б. Прямое обнаружение и амплификация сегментов рибосомного гена 16S Helicobacter pylori из желудочной эндоскопической биопсии.Диагностика Microbiol Infect Dis. 1990 г.; 13(6):473–479. PMID: 1703940.
    33. Каземи С., Тавакколи Х., Хабизаде М.Р., Эмами М.Х. Диагностическое значение диагностических тестов на Helicobacter pylori: тест на антиген в кале, дыхательный тест с мочевиной, экспресс-тест на уреазу, серология и гистология. J Res Med Sci. 2011 г.; 16(9):1097–1104. PMID: 22973378.

    Диагностическая точность метода на основе ПЦР с использованием четырех генных праймеров для выявления инфекции Helicobacter pylori в тканях желудка: Отчет из Ирана

    Хоссейн Khedmat 1 , 2 , Али Кары 2 , 3 , Захра Safiri 2 , 3 , Мохсен Амини 1 , 2 , Али Bakhtiari 2 , Ашраф Karbasi 1 , 2 , Мойгано, Jayhounian 2 , 4 , Хамидрез Джалалян 5 , Саид Taheri 6
    Baqiyatallah научно-исследовательский центр гастроэнтерологии и заболевания печени 1 & медицинские науки 2 ,
    Центр биологических исследований 3 ,
    Отделение патологии 4 и медицины 5 ,
    Группа медицинских исследований доктора Тахери 6 ,
    Тегеран, Иран

    Автор-корреспондент
    : Др.Хоссейн Хедмат
    Электронная почта: [email protected]

    ДОИ : http://dx.doi.org/

    Точное обнаружение инфекции H. pylori важно как для клинической практики, так и для исследовательских целей, и в настоящее время доступно несколько инвазивных и неинвазивных тестов для диагностики H. pylori .Посев долгое время был методом выбора для обнаружения инфекционных агентов. Тем не менее, культура имеет некоторые ограничения в быстром обнаружении, поскольку H.pylori является очень медленно растущими бактериями.[1] Чувствительность и специфичность различных диагностических тестов для обнаружения H. pylori сильно различаются.[2] Кроме того, серология не может определить клиренс H. pylori , а анализы уреазы могут давать неспецифические результаты из-за присутствия других уреазо-положительных бактерий, а также сообщалось о ложноотрицательных результатах у лиц, принимающих ингибиторы протонной помпы.[3,4] Методы, основанные на молекулярной биологии, считаются высокоспецифичными и чувствительными тестами, и многие анализы на основе ПЦР были разработаны для обнаружения ДНК H. pylori в биоптатах желудка, образцах слюны и стула.[5,6] Однако , этот метод способен обнаруживать определенные фрагменты, но не жизнеспособные бактерии, и его чувствительность также зависит от нескольких факторов.

     

    Недавно мы внедрили в нашем учреждении основанный на ПЦР метод обнаружения Helicobacter pylori .Таким образом, настоящее исследование было направлено на определение чувствительности и специфичности праймеров ПЦР для диагностики инфекции Helicobacter pylori.

     

    Методы

    Пациенты

     

    В анализ были последовательно включены все пациенты, обратившиеся в поликлинику гастроэнтерологии с диспепсией и прошедшие диагностическое эндоскопическое обследование с биопсией с марта 2005 г. по март 2006 г.Всего было оценено 664 образца от 166 пациентов (по четыре биопсии у каждого). У пациентов брали биопсию из антрального отдела желудка для экспресс-теста на уреазу, гистопатологического исследования и анализа ДНК. Три образца были отправлены на экспресс-тест на уреазу и гистопатологию, а оставшийся образец был заморожен для ПЦР-анализа.

     

    Поскольку культивирование H. pylori из образцов биопсии в нашем исследовании не проводилось, любой образец, положительный при гистологическом исследовании, а также при быстром уреазном тесте, считался золотым стандартом для определения чувствительности и специфичности методов ПЦР.

     

    Гистологическое исследование

     

    Срезы тканей, залитые парафином, окрашивали гематоксилином и эозином, а тяжесть гастрита оценивали по Сиднейской системе.[7] Окрашивание по Гимзе использовали для обнаружения H. pylori .

     

    Экспресс-тест на уреазу

     

    Один биоптат антрального отдела желудка вводили стерильной иглой в полутвердый 2% мочевинный агар и инкубировали при комнатной температуре.Результаты регистрировались в течение 4 часов после инокуляции.[8]

     

    Подготовка образцов для ПЦР-амплификации

     

    Геномные ДНК были извлечены из всех штаммов по методу Marais et al. [9]. Экстрагированные ДНК растворяли в воде, готовили растворы и использовали на протяжении всего исследования. Вкратце, образцы биопсии измельчали ​​и центрифугировали в течение 5 минут при 10 000×g. После удаления супернатантов образцы биопсии ресуспендировали в буфере для экстракции (20 ммоль/л трис-HCl, pH 8.0; 0,5% Tween 20) и протеиназу К (конечная концентрация 0,5 мг/мл). Смесь инкубировали при 56°С в течение одного часа, после чего фермент инактивировали кипячением в течение 10 мин.

     

    Используя наш вложенный анализ, мы смогли обнаружить специфических последовательностей H. pylori при предполагаемой концентрации 20 пикомолей. В качестве матрицы для каждой ПЦР использовали пять мкл ДНК. Каждый образец исследовали с помощью четырех разных ПЦР. В этом исследовании использовались праймеры из 16S рРНК (п.о.: 521), уреазы А (п.о.: 411), Cag A (п.о.: 400), 26 кДа (п.о.: 303).Последовательности праймеров и условия ПЦР перечислены в Таблице 1 .

     

    Статистический анализ

     

    Для анализа данных использовалось программное обеспечение

    SPSS (Statistical Product and Services Solutions, версия 13.0, SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс, США). Статистические различия между подгруппами пациентов оценивали с помощью критерия хи-квадрат, точного критерия Фишера для пропорций и t-критерия для непрерывных данных.Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

     

    Результаты

     

    Полные данные для этого исследования были получены на 166 пациентах (78 мужчин, 88 женщин; возраст: 41,7±15,7 года). Из них всего 55 (33%) пациентов дали положительные результаты хотя бы по одному из использованных методов ПЦР и любым методам (включая ПЦР) соответственно. Тридцать семь образцов (22%) были положительными как при экспресс-тесте на уреазу, так и при вложенной ПЦР.Восемьдесят девять биопсий были положительными при гистологическом окрашивании (48,7%), из которых 49 дали отрицательные результаты при ПЦР.

     

    Образцы пациентов считались положительными в отношении H. pylori с помощью ПЦР-амплификации, если в реакции наблюдалась любая из полос 521 п.н., 411 п.н., 400 п.н., 303 п.н. Из 55 ПЦР-положительных образцов 23 (41,8%) показали полосу 400 п.н., 31 (56,4%) представили полосу 303 п.н., 20 (36,4%) показали полосу 521 п.н. и 23 (41,8) представили полосу 411 п.н.

     

    32 (19%) образца были положительными как при ПЦР, так и при патологической оценке, а 49 (29.5%) патологически положительных субъектов были отрицательными по ДНК H. pylori с помощью методов ПЦР, а 23 (13,9%) ПЦР-положительных образцов были отрицательными по патологии. Девять образцов были отрицательными по патологии, но положительными как по экспресс-тесту на уреазу, так и по методам ПЦР; 41 случай был отрицательным для оценки ПЦР, в то время как они были положительными как для быстрого уреазного теста, так и для патологии; кроме того, только 4 случая, которые были положительными как при ПЦР, так и при патологии, были отрицательными при быстром уреазном тесте.

     

    Степень гастрита, основанная на патологических оценках с использованием Сиднейской системы, не была связана с положительным результатом ПЦР на H.pylori (р>0,1). Однако пациенты с положительным быстрым уреазным тестом имели значительно более высокую степень гастрита (средняя степень гастрита ± SD: 2,3 ± 1,3 против 0,3 ± 0,8; соответственно; p <0,0001).

     

    На основании золотого стандарта у 37 пациентов, обследованных в рамках данного исследования (22,3%), был диагностирован H. pylori инфицированных. В таблице 2 показаны различные переменные исследования по отношению к результату золотого стандарта исследования. Вычисленная чувствительность для полос 521bp, 411bp, 400bp, 303bp для обнаружения H.Pylori и исключение отрицательных случаев в этом исследовании составили 41%, 46%, 38% и 32% соответственно; приписываемая специфичность для каждого из методов ПЦР составляла 85%, 86%, 84% и 83% соответственно (, таблица 3, ).

     

    Обсуждение

     

    Соответствующие диагностические инструменты для диагностики вероятной инфекции H. pylori у пациентов с диспепсией имеют первостепенное значение как для врачей, так и для пациентов.Экспресс-тест с уреазой является наиболее часто используемым диагностическим тестом для диагностики инфекции H. pylori у больных хроническим гастритом в гастроэнтерологических клиниках. Этот метод диагностики имеет несколько преимуществ, включая получение быстрого результата на инфекцию H. pylori еще до того, как пациент покинет клинику, высокую точность диагностики, а также низкую экономическую нагрузку как на пациентов, так и на систему здравоохранения [10,11, 12] Гистологический диагноз инфекции H. pylori является зарезервированным методом, особенно для пациентов с отрицательным быстрым уреазным тестом и высоким подозрением на инфекцию или для исключения злокачественного новообразования.

     

    Общая концепция состоит в том, что ПЦР является наиболее чувствительным методом обнаружения микроорганизмов, таких как H. pylori . Обнаружение H. pylori в образцах биопсии желудка с помощью ПЦР было оценено несколькими исследователями, демонстрирующими высокую чувствительность и специфичность, обычно более 95% по сравнению с другими инвазивными методами [13,14,15,16].

     

    В этом исследовании мы изучили эффективность методов ПЦР при обнаружении четырех штаммов H.pylori распознает аллели. Мы обнаружили, что ПЦР имеет очень низкую мощность для обнаружения инфекции H.pylori среди наших пациентов. Для этого может быть несколько причин; во-первых, это низкие технические возможности сотрудников нашей лаборатории; во-вторых, не используются для этой цели надлежащие материалы или методы; кроме того, наши патологоанатомы жаловались, что образцы биопсии слишком малы для надлежащей оценки методом ПЦР; хотя общее предположение состоит в том, что ПЦР может обнаружить инфекцию даже в образцах крайне ограниченного объема.В идеале ингибиторы протонной помпы должны быть прекращены перед эндоскопией; [12,18] было продемонстрировано, что после 4 недель лечения омепразолом гистологическая плотность H. pylori в антральном отделе и теле тела была снижена, а на дне увеличилась. .[19] С подозрением на высокий уровень самолечения среди наших пациентов мы предполагаем, что лекарства могут оказывать неблагоприятное влияние на точность результатов ПЦР-теста.

     

    В нескольких предыдущих исследованиях оценивалась чувствительность и специфичность методов ПЦР для обнаружения нескольких праймеров в H.pylori локусы генов. Результаты были очень разными в разных отчетах. Лу и др. [20] в своем исследовании, сравнивающем эффективность пяти различных методов ПЦР для обнаружения ДНК H. pylori в тканях желудка пациентов с хроническим гастритом, обнаружили, что чувствительность методов ПЦР не является удовлетворительной при обнаружении H. pylori ; в конце концов они пришли к выводу, что это наблюдение может быть связано с полиморфизмом последовательностей в указанных локусах. Смит и др. [21] в своем исследовании методов ПЦР для диагностики H.pylori в тканях желудка также сообщили о низкой чувствительности 56% для гена glmM, но они обнаружили чувствительность 100% для праймера гена 26 кДа и специфичность 44% для ureA. Они также обнаружили, что 68% биопсий, которые показали положительную амплификацию всех трех генов, были положительными для гена cagA, в то время как в нашем исследовании эта доля составляла всего 43%. С другой стороны, Lage и др. [13] сообщили, что в их исследовании не было ложноположительных или отрицательных результатов биопсии, амплифицированных glmM. В этом исследовании, однако, мы достигли чувствительности 32% для 26 кДа и специфичности 83% для праймера гена ureA и сопоставимых результатов для всех других исследованных праймеров гена.

     

    Большое количество ложноотрицательных результатов, о которых сообщалось в этом исследовании, не может быть объяснено исключительно полиморфизмом генов; хотя можно утверждать, что критерии золотого стандарта, используемые в этом исследовании для определения положительных и отрицательных случаев, могут быть недостаточно точными, наша причина для использования этих критериев заключалась в том, что они ранее сообщались как методы с высокой чувствительностью и специфичностью и также использовались. в качестве критерия золотого стандарта для той же цели предыдущими исследователями.[22] ПЦР является трудоемкой и дорогостоящей процедурой, требующей высококвалифицированного персонала для ее выполнения. В развивающихся странах преимущества использования ПЦР для выявления микроорганизмов, таких как H. pylori , могут быть утрачены из-за нехватки средств на здравоохранение, а также нехватки хорошо подготовленных специалистов. Наше исследование показало, что использование методов ПЦР для обнаружения Helicobacter pylori не имеет высокой диагностической точности.

     

    Каталожные номера

    1.Suerbaum S, Michetti P. Инфекция Helicobacter pylori. N Английский J Med . 2002 г.; 347 :1175 86. 2.     Хо С.А., Хойл Дж.А., Льюис Ф.А., Секер А.Д., Кросс Д., Мапстоун Н.П. и соавт. Прямая полимеразная цепная реакция для выявления Helicobacter pylori у людей и животных. Дж Клин Микробиол . 1991 год; 29 :2543 9. 3.     Mobley HL, Hu LT, Foxal PA. Уреаза Helicobacter pylori: свойства и роль в патогенезе. Scand J Gastroenterol Suppl .1991 год; 187 :39 46. 4.     Грэм Д.Ю. Инфекция Helicobacter pylori является основной причиной рака желудка. J Гастроэнтерол . 2000 г.; 35 :90 7. 5.     Li C, Ha T, Ferguson DA Jr, Chi DS, Zhao R, Patel NR, et al. Недавно разработанный ПЦР-анализ H. pylori в биопсии желудка, слюне и фекалиях. Доказательства высокой распространенности H. pylori в слюне подтверждают пероральную передачу инфекции. Научные раскопки . 1996 год; 41 :2142 9.6.     Пачеко Н., Маго В., Гомес И., Гено П., Гельруд М., Рейес Н. и соавт. Сравнение ПЦР и общих клинических тестов для диагностики H. pylori у больных диспепсией. Диагностика Microbiol Infect Dis . 2001 г.; 39 :207 10. 7.     Цена AB. Сиднейская система: гистологическое разделение. J Гастроэнтерол Гепатол . 1991 год; 6 :209 22. 8.     Делтенр М., Глупчински Ю., Де Пре С., Нист Дж. Ф., Бюретт А., Лаббе М. и соавт. Надежность уреазных тестов, гистологии и культуры в диагностике инфекции Campylobacter pylori. Scand J Gastroenterol Suppl . 1989 год; 160 :19 24. 9.     Marais A, Monteiro L, Occialini M, Pina M, Lamouliatte H, Megraud F. Прямое выявление устойчивости Helicobacter pylori к макролидам с помощью полимеразной цепной реакции/иммуноферментного анализа ДНК в образцах биопсии желудка. Гут . 1999 г.; 44 :463 7. 10. Саид Р.М., Чеа П.Л., Чин С.К., Гох К.Л. Оценка нового уреазного теста биопсии: Pronto Dry для диагностики инфекции Helicobacter pylori. Eur J Гастроэнтерол Гепатол . 2004 г.; 16 :195 9. 11. Шнелл Г.А., Шуберт Т.Т., Барнс В.Г., Рупани М.К.: Сравнение уреазы, H & E и культуральных тестов на Helicobacter pylori. Гастроэнтерология (реферат) . 1998 год; 94 :410. 12. Якуб Дж., Джафри В., Абид С., Джафри Н., Аббас З., Хамид С. и др. Роль быстрого уреазного теста и гистопатологии в диагностике инфекции Helicobacter pylori в развивающихся странах. ВМС Гастроэнтерол .2005 г.; 5 :38. 13. Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A, Burette A, Butzler JP, Bollen A, et al. Диагностика инфекции Helicobacter pylori с помощью ПЦР: сравнение с другими инвазивными методами и обнаружение гена cagA в образцах биопсии желудка. Дж Клин Микробиол . 1995 год; 33 :2752 6. 14. Бассо Д., Навалья Ф., Кассаро М., Скригнер М., Тома А., Дал Бо Н. и соавт. Полимеразная цепная реакция желудочного сока: альтернатива гистологии в диагностике инфекции Helicobacter pylori. Хеликобактер . 1996 год; 1 :159 64. 15. Лин С.Ю., Дженг Ю.С., Ван С.К., Ко Ф.Т., Лин К.И., Ван С.С. и др. Диагностика методом полимеразной цепной реакции Helicobacter pylori при гастродуоденальных заболеваниях: сравнение с культуральным и гистологическим исследованиями. J Гастроэнтерол Гепатол . 1996 год; 11 :286 9. 16. Тийс Дж. К., ван Цвет А. А., Тийс В. Дж., Оей Х. Б., Карренбельд А., Стеллаард Ф. и соавт. Диагностические тесты на Helicobacter pylori: проспективная оценка их точности без выбора одного теста в качестве золотого стандарта. Am J Гастроэнтерол . 1996 год; 91 :2125 9. 17. Розендал Р., Куйперс Э.Дж., ван ден Брюле А.Дж., Пенья А.С., Уйтерлинде А.М., Уолбумерс Дж.М. и соавт. Важность процедуры очистки оптоволоконного эндоскопа для обнаружения Helicobacter pylori в образцах биопсии желудка методом ПЦР. Дж Клин Микробиол . 1994 год; 32 :1123 6. 18. Дики В., Кенни Б.Д., МакКоннелл Дж.Б. Влияние ингибиторов протонной помпы на обнаружение Helicobacter pylori в биоптатах желудка. Алимент Фармакол Тер . 1996 год; 10 :289 93. 19. Логан Р.П., Уокер М.М., Мисевич Дж.Дж., Гуммет П.А., Карим К.Н., Барон Дж.Х. Изменения внутрижелудочного распределения Helicobacter pylori на фоне лечения омепразолом. Гут . 1995 год; 36 :12 6. 20.   Лу Дж. Дж., Пернг С.Л., Шью Р.Ю., Чен Ч., Лу К., Чонг СКФ и др. Сравнение пяти методов ПЦР для обнаружения ДНК Helicobacter pylori в тканях желудка. Дж Клин Микробиол .1999 г.; 37 :772 4. 21. Смит С.И., Ойедеджи К.С., Аригбабу А.О., Канте Ф., Меграуд Ф., Оджо О.О. и соавт. Сравнение трех методов ПЦР для обнаружения ДНК Helicobacter pylori и обнаружения гена cagA в образцах биопсии желудка. World J Гастроэнтерол . 2004 г.; 10 :1958 60. 22. Винетт К.М., Гибни К.М., Пруджански Р., Фосетт П.Т. Сравнение ПЦР и клинико-лабораторных тестов для диагностики инфекции H. pylori у детей. ВМС Микробиол . 2004 г.; 4 :5.

    Обнаружение Helicobacter pylori с помощью ПЦР в реальном времени для 16s рРНК в кале неинфицированных здоровых детей с использованием теста ELISA Antigen Stool Test в качестве золотого стандарта

    Резюме/Обзор

    Исходные данные Ранее мы выявили инфекцию Helicobacter pylori с помощью анализа ELISA на антиген в стуле у 33–41% бессимптомных чилийских детей в возрасте 2–3 лет, из которых 11–20% имели транзиторную инфекцию, а 21–22% — персистентную инфекцию.В общей сложности 88% ELISA-положительных образцов были также положительными по rtPCR, в то время как 37/133 (33%) ELISA-отрицательных образцов стула были положительными по rtPCR. Значение ELISA-отрицательного/rtPCR-положительного образца требует уточнения. Мы стремились определить, способна ли rtPCR обнаруживать персистирующие инфекции, не обнаруженные с помощью ELISA. Материалы и методы Мы отобрали 36 детей с ELISA-отрицательным/rtPCR-положительным образцом стула, из которых 25 никогда не были инфицированы H. pylori согласно ELISA, а 11 имели транзиторную инфекцию с ELISA-положительным образцом до или после дискордантного образца.По крайней мере два дополнительных последовательных ELISA-отрицательных образца от каждого ребенка были протестированы в двух повторностях с помощью rtPCR на ген 16s рРНК. Результаты. В общей сложности 14 из 78 (17,9%) rtPCR-реакций были положительными, но только 4/78 (5,1%) были положительными в обоих повторах, что составляет в общей сложности 3/36 (8,3%) детей с дополнительным rtPCR-положительным образцом. только один из них был устойчиво отрицательным с помощью ELISA. У одного ребенка с транзиторной инфекцией было две положительные реакции rtPCR, несмотря на отрицательные образцы ELISA.Выводы. У детей, не инфицированных или временно инфицированных H. pylori, по данным ИФА кала дополнительные ИФА-отрицательные/отрицательные по ПЦР образцы стула были обнаружены у 8,3% детей, но возможная персистирующая инфекция была выявлена ​​только у 2,7% детей. Таким образом, характеристика динамики инфекции у детей не искажается при использовании ИФА кала. Кроме того, rtPCR существенно не улучшает динамическую характеристику.

    Индексация

    Артикул публикации ISI

    (PDF) Роль ПЦР в диагностике и исследовании Helicobacter pylori

    268

    Postepy Hig Med Dosw (онлайн), 2013; том 67: 261-268

    [5] Бардхан П.К.: Эпидемиологические особенности инфекции Helicobacter pylori

    в развивающихся странах. клин. Заразить. дис., 1997; 25: 973-978

    [6] Бартник В.: Клинические аспекты заражения Helicobacter pylori. пол.

    Арх. Мед. Wewn., 2008; 118: 426-430

    [7] Bosch J.A., Turkenburg M., Nazmi K., Veerman E.C., De Geus E.J.,

    Amerongen A.V.: Стресс как детерминанта опосредованной слюной адгезии и коадгезии оральных и неоральные микроорганизмы.Psy-

    чосом. Мед., 2003; 65: 604-612

    [8] Brailo V., Vuéiaeeviae-Boras V., Alajbeg I.Z., Alajbeg I., Lukenda

    J., Aeurkoviae M.: Симптомы жжения во рту и синдром жжения во рту

    drome-signi Вероятность различных переменных у 150 пациентов. Мед. Орал

    Патол. Устный Цирк. Букал, 2006; 11: E252-E255

    [9] Браун Л.М.: Helicobacter pylori: эпидемиология и пути передачи

    . Эпидемиол. Изд., 2000; 22: 283-297

    [10] Кан Ф., Карахан С., Долапци И., Демирбилек М., Текели А., Арслан

    H.: Активность уреазы и секвенирование гена мочевины коккоидных форм H.

    pylori, индуцированных различными факторами. Курс. Микробиолог., 2008; 56: 150-155

    [11] Cellini L., Del Vecchio A., Di Candia M., Di Campli E., Favaro M.,

    Donelli G.: Обнаружение свободных и связанных с планктоном Helicobacter

    pylori в морской воде. Дж. Заявл. Микробиолог., 2004; 97: 285-292

    [12] Челлини Л., Гранде Р., Artese L., Marzio L.: Обнаружение Helicobacter-

    ter pylori в слюне и пищеводе. Новая микробиол., 2010; 33: 351-357

    [13] Чен Т.С.: Является ли коккоидная форма Helicobacter pylori жизнеспособной и

    трансмиссивной? Дж. Чин. Мед. доц., 2004; 67: 547-548

    [14] Chisholm S.A., Owen R.J., Teare E.L., Saverymuttu S.:

    диагностика инфекции Helicobacter pylori на основе ПЦР и определение резистентности к кларитромицину в режиме реального времени непосредственно из биопсии желудка человека

    пробы.Дж. Клин. Микробиолог., 2001; 39: 1217-1220

    [15] Dowsett S.A., Kowolik M.J.: Оральный Helicobacter pylori: можем ли мы сто-

    сделать это? крит. Преподобный Орал Биол. Мед., 2003; 14: 226-233

    [16] Gościniak G., Przondo-Mordarska A., Iwańczak B., Blitek A.:

    Występowanie antygenów helicobacter pylori w kale dzieci cho-

    rychlekle-zaplerżo-zaplekłe-zaple пол. Меркур.

    Лекарский, 2002; 12: 104-107

    [17] Хультен К., Энрот Х., Nyström T., Engstrand L.: Присутствие ДНК видов He-

    licobacter в шведской воде. Дж. Заявл. Микробиолог., 1998;

    85: 282-286

    [18] Кабир С.: Обнаружение Helicobacter pylori в фекалиях культуральным методом,

    ПЦР и иммуноферментным анализом. Дж. Мед. Микробиолог., 2001; 50: 1021-1029

    [19] Li C., Musich P.R., Ha T., Ferguson D.A.Jr., Patel N.R., Chi D.S.,

    Thomas E.: Высокая распространенность Helicobacter pylori в слюне продемонстрирована

    новым методом ПЦР.Дж. Клин. патол., 1995; 48: 662-666

    [20] Лукеш П., Павлик Э., Потужникова Б., Плзак Й., Нартова Э., Доседел

    Й., Катра Р., Стерзл И., Бетка Й., Астл Й .: Сравнение генотипов Helicobacter py-

    lori, полученных из ротоглотки и желудка

    одних и тех же людей – экспериментальное исследование. Прага Мед. Респ., 2012; 113: 231-239

    [21] Малфертейнер П., Меграуд Ф., О’Морейн К., Баззоли Ф., Эль-Омар Э.,

    Грэм Д., Хант Р., Роккас Т., Вакил Н. ., Kuipers E.J.: Текущие концепции

    в лечении инфекции Helicobacter pylori: Маастрихтский отчет

    III о консенсусе. Гут, 2007; 56: 772-781

    [22] Мапстоун Н.П., Линч Д.А., Льюис Ф.А., Аксон А.Т., Томпкинс Д.С.,

    Диксон М.Ф., Квирк П.: Идентификация ДНК Helicobacter pylori в

    ртах и ​​желудках пациентов при гастрите с помощью ПЦР. Дж. Клин.

    Патология, 1993; 46: 540-543

    [23] Маршалл Б.Дж., Уоррен Дж.Р.: Неидентифицированные изогнутые палочки в

    желудке больных гастритом и язвенной болезнью. Ланцет,

    1984; 323: 1311-1315

    [24] Mishra S., Singh V., Rao G.R., Jain A.K., Dixit V.K., Gulati A.K.,

    Nath G.: Обнаружение Helicobacter pylori в образцах стула: com-

    параметрическая оценка вложенной ПЦР и обнаружения антигена. Дж. Заразить.

    Дев. Попытки., 2008; 2: 206-210

    [25] Момтаз Х., Суод Н., Дабири Х., Саршар М.: Изучение статуса генотипа Helico-

    бактериальных пилори в образцах слюны, зубных бляшек, стула и

    желудочной биопсии. World J. Gastroenterol., 2012; 18: 2105-2111

    [26] Наяк А.К., Роуз Дж.Б.: Обнаружение Helicobacter pylori в сточных водах

    и воде с использованием нового количественного метода ПЦР с SYBR green.

    Дж. Заявл. Микробиолог., 2007; 103: 1931-1941

    [27] Пэрриш К.Д., Гринберг Е.П.: Быстрый метод выделения и очистки ДНК из зубного налета.заявл. Окружающая среда. микробиол.,

    1995; 61: 4120-4123

    [28] Патель Д., Сима Х., Кале А.: Роль ингибитора лейкоцитарной протеазы слюны

    в прогрессировании заболеваний пародонта. Дж. Индийская соц. Перио-

    донтол., 2010; 14: 109-113

    [29] Керальт Н., Бартоломе Р., Араужо Р.: Обнаружение ДНК Helicobacter

    pylori в фекалиях человека и воде с разным восток Испании. Дж. Заявл. микробиол., 2005;

    98: 889-895

    [30] Shahamat M., Alavi M., Watts J.E., Gonzalez J.M., Sowers K.R.,

    Maeder D.W., Robb F.T.: Разработка двух ПЦР-методов

    для обнаружения helical и кокковидные формы Helicobacter pylori. Дж.

    Клин. Микробиолог., 2004; 42: 3613-3619

    [31] She F.F., Lin J.Y., Liu J.Y., Huang C., Su D.H.: Вирулентность индуцированного водой

    коккоида Helicobacter pylori и его экспериментальная инфекция

    у мышей.World J. Gastroenterol., 2003; 9: 516-520

    [32] Сильва Д.Г., Тиноко Э.М., Роча Г.А., Роча А.М., Герра Дж.Б., Са-

    Раива И.Е., Кейрос Д.М.: Helicobacter pylori транзиторно во рту

    может участвовать в передаче инфекции . Мем. Инст. Освальдо

    Круз, 2010 г.; 105: 657-660

    [33] Sisto F., Brenciaglia M.I., Scaltrito M.M., Dubini F.: Helicobacter

    pylori: экспрессия ureA, cagA и vacA во время преобразования в коккоидную форму

    .Междунар. Дж. Антимикроб. Агенты, 2000; 15: 277-282

    [34] Сонг К., Ланге Т., Шпар А., Адлер Г., Боде Г.: Характерный

    характер распространения Helicobacter pylori в зубном налете и са-

    живом организме, обнаруженном с гнездами ПЦР. Дж. Мед. Микробиолог., 2000; 49: 349-353

    [35] Souto R., Colombo A.P.: Обнаружение Helicobacter pylori с помощью поли-

    полимеразной цепной реакции в поддесневой биопленке и слюне

    пародонтальных пациентов без диспепсии.Ж. Пародонтология, 2008; 79: 97-103

    [36] Sugimoto M., Wu J.Y., Abudayyeh S., Hofiman J., Brahem H., Al-

    -Khatib K., Yamaoka Y., Graham D.Y.: Ненадежность результатов ПЦР

    обнаружение Helicobacter pylori в клинических пробах или пробах окружающей среды

    . Дж. Клин. Микробиолог., 2009; 47: 738-742

    [37] Suzuki R., Shiota S., Yamaoka Y.: Молекулярная эпидемиология, популяционная генетика и патогенная роль Helicobacter pylori. Заразить.

    Ген.Эволюция, 2012; 12: 203-213

    [38] Tankovic J., Chaumette-Planckaert M.T., Deforges L., Launay

    N., Le Glaunec J.M., Soussy C.J., Delchier J.C.: Рутинное использование real-ti-

    me PCR для выявления мутаций устойчивости Helicobacter pylori и кларитромицина

    . Гастроэнтерол. клин. биол., 2007; 31: 792-795

    [39] Vinette K.