25Июл

Фн биохимия: Обнаружено потенциально опасное значение Request.Path, полученное от клиента (%).

Содержание

Синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс при физических нагрузках и введении 17а-метилтестостерона + «

Автореферат диссертации по теме «Синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс при физических нагрузках и введении 17а-метилтестостерона»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Г 6 од

на правах рукописи

Турханова Людмила Владимировна

СИНТЕЗ ПОЛИАМИНОВ В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС ПРИ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗКАХ И ВВЕДЕНИИ 17а-МЕТИЛТЕСТОСТЕРОНА

специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте физической культуры

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор В.А. Рогозкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Михайлов С.С. кандидат биологических наук, доцент Шведова В.Н.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится 30 июня 1998 года в 13 часов на заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат диссертации разослан «Л« 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени известно, что физические нагрузки (ФН) сопровождаются многочисленными биохимическими изменениями в организме, которые зависят от интенсивности и длительности мышечной деятельности [Яковлев, 1974; Меньшиков, Волков, 1986]. Прежде всего эти изменения затрагивают скелетные мышцы — ткань, обеспечивающую двигательную активность организма.

Изучение процессов синтеза белка и путей его регуляции в скелетных мышцах занимает одно из центральных мест в функциональной биохимии. Исследования, проведённые в секторе биохимии СПб НИИ Физической культуры показали, что:

1) в восстановительный период после однократных и систематических ФН в скелетных мышцах происходят изменения, затрагивающие все основные процессы синтеза белка транскрипцию [Зильбер, Рогозкин, 1971; Плискин, 1973; Фельдкорен, 1979], ядерно-цитоплазматический транспорт [Плискин, 1973; Морозов, 1976], трансляцию [Литвинова, Рогозкин, 1970];

2) синтез белков в скелетных мышцах регулируется андрогенами и их синтетическими аналогами [Фельдкорен, 1979; Рогозкин, 1988]. В частности было установлено, что анаболические стероиды регулируют активность фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы I, что в конечном итоге приводит к усиленному синтезу как сократительных, так и энзиматических белков скелетных мышц. Анаболические стероиды привлекают особое внимание исследователей из за их широкого применения в медицинской практике, что связано с выраженным миотропным эффектом аналогов андрогенов [Пивницкий, 1974; Рогозкин, 1988].

В последнее время принимается, что андрогены реализуют свой метаболический эффект через индукцию синтеза некоторых андроген- зависимых ферментов, которые выполняют важные функции в клетках и обеспечивают дальнейшее метаболическое действие андрогенов при стимуляции анаболических процессов. Это предположение было сделано на основании фактов о том, что концентрация тестостерона увеличивается в крови животных практически сразу после выполнения физических нагрузок, то есть

во время выраженных катаболических процессов в скелетных мышцах.

К группе ферментов, активно отвечающих на действие андрогенов во многих органах животных относятся ключевые ферменты синтеза полиаминов — орнитиндекарбоксилаза (ОДК) и S-аденозилметиониндекарбоксилаза (S-АМДК) [Ярыгин, 1987; Seiler, 1996]. Эти ферменты катализируют синтез полиаминов (путресцина, спермидина, спермина), которые активируют РНК-полимеразы [Jacob, Rose, 1978; Abraham, Pihl, 1981], влияют на ацетилирование гистонов и негистоновых белков хроматина [Desiderio et al., 1992], стабилизируют рибосомы и тРНК [Pegg et al., 1982; Rudkin et al., 1984; Tabor, 1984], что в конечном итоге отражается на скорости синтеза белков клеток, их росте и развитии. Было показано, что концентрация полиаминов и активность ферментов ОДК и S-АМДК хорошо коррелирует с интенсивностью анаболических процессов в ткани [Rudkin, 1984; Holtta, 1985; Bolkenius, Seiler, 1987; Matthews, 1993].

В работах Яковлева H.H.[ 1979] было показано, что активность фермента ОДК и содержание полиаминов изменяются в скелетных мышцах в ответ на ФН. Однако, возможные механизмы активации системы синтеза полиаминов андрогенами, концентрация которых увеличивается в восстановительный период после ФН, не были исследованы. Кроме того, в литературе отсутствуют прямые указания на влияние анаболических стероидов на синтез полиаминов в скелетных мышцах.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании эффекта физических нагрузок различной интенсивности и длительности и введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс.

Задачи исследования;

1. Развить метод определения содержания полиаминов в скелетных мышцах крыс с использованием ионообменной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2, Определить условия для измерения активности орнитиндекарбоксилазы и S-аденозилметиониндекарбоксилазы в скелетных мышцах различного функционального профиля.

3. Изучить изменение активностей этих ферментов и содержания полиаминов в скелетных мышцах крыс при выполнении однократных физических нагрузок различной интенсивности и длительности.

4. Исследовать влияние систематической мышечной деятельности различной направленности и состояния тренированности на синтез полиаминов в скелетных мышцах.

5. Изучить влияние однократного и систематического введения 17ос-метилтестостерона на активность ферментов и содержание полиаминов в скелетных мышцах различного функционального профиля.

Научная новизна н практическая значимость исследования.

Данные по исследованию содержания полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) и активности двух ферментов (ОДК и 8-АМДК), осуществляющих синтез полиаминов, в скелетных мышцах в период отдыха после различных ФН, представляют особый интерес, поскольку до настоящего времени практически отсутствуют работы по данной теме. Из отечественной литературы известна лишь одна публикация [Яковлев, 1979], посвященная исследованию активности фермента ОДК и содержания полиаминов в скелетных мышцах после ФН. Однако, представленные в ней результаты несколько отличаются от данных, полученных нами.

В результате экспериментов установлено, что активность ферментов ОДК и Б-АМДК и содержание полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) в скелетных мышцах зависят от типа волокон составляющих мышцу. Значения данных показателей в мышцах, содержащих преимущественно оксидативные волокна в два раза превышали таковые в волокнах гликолитического типа.

Впервые одновременно исследовали изменение активности ферментов ОДК, Б-АМДК, содержания полиаминов в скелетных мышцах и содержания тестостерона в крови животных в различные периоды отдыха после ФН. Повышение содержания в мышцах путресцина в срочный период восстановления (катаболическая фаза) было обусловлено увеличением активности ОДК в это же время. В отставленный период восстановления (анаболическая фаза) повышалось содержание в мышцах спермидина и спермина, вызванное возрастанием активности фермента Б-АМДК. При этом изменение концентрации тестостерона в крови носило фазный

характер и первый пик увеличения концентрации тестостерона совпадал по времени с возрастанием активности ОДК.

Установлено, что однократная анаэробная ФН приводит к большей активации системы синтеза полиаминов в гликолитических, а однократная аэробная ФН — в оксидативных мышечных волокнах, что соответствует представлению о специфичности биохимических процессов адаптации к ФН определенной направленности.

Выполнение систематических ФН преимущественно аэробной направленности сопровождалось снижением содержания полиаминов в смешанных мышечных волокнах. При выполнении систематических ФН анаэробной направленности и аэробной направленности с включением «ускорений» установлено увеличение их содержания в этих мышечных волокнах.

Опыты с введением анаболического стероида 17а-метилтестостерона показали, что синтез полиаминов увеличивается под воздействием этого гормона, но степень увеличения активности ферментов ОДК, Б-АМДК и содержания полиаминов зависела от типа мышечных волокон, составляющих скелетную мышцу.

Выполненная работа имеет преимущественно экспериментальный характер и позволяет судить об особенностях метаболизма индивидуальных ферментов и низкомолекулярных веществ при адаптации мышц к повышенной физической активности и об их гормональной регуляции. Материалы исследования могут быть использованы в курсах общей эндокринологии. Кроме того, показанная в работе взаимосвязь между уровнем андрогенов в крови и активностью системы синтеза полиаминов в скелетных мышцах позволяет использовать этот теоретический материал при оптимизации рационального питания спортсменов на разных уровнях их подготовки и соревнований, а также при оптимизации профилактического питания. Разработанный высокочувствительный метод определения содержания полиаминов и оптимизированные методы измерения активности ферментов ОДК и Б-АМДК могут быть использованы в клиниках для диагностики онкологических заболеваний.

Положения выносимые на защиту. 1. Активности ключевых ферментов синтеза полиаминов ОДК и БАМДК и содержание

полиаминов ( путресцина, спермидина, спермина) зависят от типа мышечных волокон.

2. Увеличение активностей ключевых ферментов в синтезе полиаминов ОДК и S-АМДК и содержания полиаминов после однократной аэробной ФН выражено больше в оксидативных мышечных волокнах, а после анаэробной ФН — в гликолитических мышечных волокнах.

3. Систематические ФН аэробной направленности сопровождаются снижением содержания полиаминов в скелетных мышцах белых крыс. Систематические анаэробные ФН или ФН аэробной направленности с включением «ускорений» приводят к увеличению содержания полиаминов в скелетных мышцах.

4. Однократное и систематическое введение Па-метил-тестостерона приводит к активации системы синтеза полиаминов в скелетных мышцах.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 132 страницах, содержит 13 таблиц и 20 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения. Список использованной литературы включает 175 наименования, в том числе 133 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования проводили на половозрелых беспородных белых крысах, полученных из питомника «Рапполово» и содержащихся в условиях вивария НИИФК на стандартной лабораторной диете [Неменова и соавт., 1968]. Все функциональные эксперименты проводились на крысах-самцах массой 200-260 г. Контрольные серии составляли животные находящиеся на обычном двигательном режиме, а экспериментальные группы животных подвергались воздействиям однократных или систематических нагрузок плаванием в воде оптимальной температуры 30-32°С или получали интраперитонеальные инъекции различных доз стероидов. Характер функциональных и фармакологических воздействий определялся поставленными задачами.

Систематическая мышечная деятельность животных состояла из плавания 5 раз в неделю в течение 4-х недель с дополнительным грузом. Нагрузка, имеющая аэробную направленность,

представляла собой плавание с грузом 4% от массы тела животного с постепенным увеличением длительности плавания от 10 мин в первый день до 40 мин в конце месячного тренировочного цикла (группа 1). Животные второй группы плавали по описанной выше схеме, но интенсификация нагрузки достигалась включением в аэробное плавание коротких (20сек) отрезков максимальной интенсивности с дополнительным грузом 12 % массы тела, сопровождающихся 40 сек интервалами отдыха на 5,15,25,35 минутах тренировочного плавания (группа 2). Этот способ аэробной тренировки условно назовем — ФН с включением «ускорений». Животные третьей группы выполняли ФН высокой интенсивности, заключающиеся в шестикратном повторении одноминутного плавания через полутороминутные интервалы отдыха. Для прогрессивного увеличения интенсивности нагрузки плавание проводили с грузом, возраставшим постепенно от 4 до 12% от массы тела в течение 1 месяца тренировки. Животных исследовали через 48 часов после заключительного тренировочного плавания. Однократная анаэробная ФН составляла 8 разовое плавании с 12%-ым грузом от массы тела в режиме: 1мин плавания, 1,5 мин отдыха. Животных исследовали сразу после ФН, через 2, 8 и 24 часа восстановительного периода. Однократная аэробная ФН представляла собой плавание с 5% грузом до первого пятнадцати секундного погружения в воду. Животных исследовали сразу после ФН и через 2, 8 и 48 часов восстановительного периода.

При изучении влияния андрогенов на синтез полиаминов, 17а-метилтестостерона вводили интраперитонеально в дозе 0,2 мг на 100 г массы тела при однократном введении гормона. Животных исследовали через 2, 8, 24 часа действия 17а-метилтестостерона . При изучении влияния систематического введения 17а-метилтестостерона животным ежедневно вводили интраперитонеально гормон в дозе 0,1 мг на 100 г массы тела в течение месяца. Животных исследовали через 24 часов после последней инъекции гормона.

Исследовали два типа скелетных мышц задней конечности крысы: пяточную, содержащую преимущественно оксидативные волокна, и белую часть четырехглавой мышцы бедра, содержащую в основном гликолитические волокна (Armstrong, Phelps, 1984). Для определения содержания полиаминов в скелетных мышцах ткань (100мг) гомогенизировали в 0,2 М НС104 в соотношении 1:3 (вес/объем). Экстракт центрифугировали (20 мин при 30000- 50000 g) и супернатант использовали для определения содержания

полиаминов. Супернатант сначала подвергали двухступенчатой ионообменной хроматографии по разработанной нами схеме (последовательное применение катионита КРС-8п и анионита ДАУЭКСхЮ). Содержание полиаминов определяли с помощью оптимизированного метода обращенно-фазной ВЭЖХ. За основу был взят метод Hyvonen [1992].

Активность фермента ОДК измеряли по оптимизированной нами методике, взяв за основу методику Persson [1983]. Навеску скелетных мышц гомогенизировали в 10-ти кратном объеме ЮОмМ Трис-HCl буфере, рН 7.0-7.2, содержащем 55мкМ ПФ, 2.5мМ ДТТ. 100 мкл гомогената инкубировали с 35 мкМ (уд.акт. 40-60 mCí/ммоль) 14С-орнитина в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 200мкл 0,6 н НС104. Выделяющийся в ходе реакции 14СОг улавливали с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной 25 мкл 1М Hyamine (Serva, Германия). Фильтр переносили в сцинцилляционную жидкость и мерили радиоактивность на жидкостносцинцилляционном счетчике Mark -III (Delta Medical, Германия). Содержание белка рассчитывали по методу Bradford (1976). Активность ОДК выражали как пмоль ‘»СОг/ мг белка час’1.

Активность фермента S-АМДК измеряли по оптимизированной нами методике, взяв за основу методику Sauro V.S. [1990]. Навеску скелетных мышц гомогенизировали на льду в 10-ти кратном объеме ЮОмМ Трис-HCl буфере, рН 7.0-7.2, содержащем 1,5 мМ путресцина, 2.5мМ ДТТ. 200 мкл гомогената инкубировали с 14C-S-аденозилметионином в конечной концентрации 40 мкМ (уд.акт. 59 mCí/ммоль) в течение 60 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавляя в реакционную среду 200 мкл 0,6 н НСЮ4. Дальнейшая регистрация радиоактивности проводилась по схеме, идентичной для фермента ОДК. Активность S-АМДК выражали как пмоль 14СОг/ мг белка час’1.

Содержание тестостерона в крови определяли методом РИО (Чайковский и соавт., 1983).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне вероятности р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1 Разработка метода определения содержания полиаминов в экстрактах скелетных мышц. При разработке метода определения содержания путресцина, спермидина, спермина в экстрактах скелетных мышц животных за основу был взят метод обращенно-фазной ВЭЖХ с постколоночной дериватизацией полиаминов о-фталевым альдегидом [Hyvonen, 1992]. Для отделения полиаминов от других флуорогенных соединений (в первую очередь от субстрата -орнитина) был разработан метод двухступенчатой ионообменной хроматографии с последовательным использованием катионита КРС — 8п, количественно сорбировавшего соединения, содержащие первичные аминогруппы и, затем, смолы ДАУЭКС 1×10, сорбировавшей количественно соединения, содержащие карбоксильные группы. В результате путресцин отделялся от субстрата (орнитина) и мог быть количественно измерен (рис.1). Разработанный метод достаточно прост, специфичен в отношении полиаминов и обладает высокой чувствительностью (нижний порог чувствительности 1-5 пмоль вещества в пробе). Для определения содержания полиаминов в скелетных мышцах с помощью данного метода было достаточно 100-200 мг ткани.

2 Определение активности ферментов ОДК и SzAMflK в скелетных мышцах. При оптимизации методов измерения активностей ферментов ОДК и S-АМДК в скелетных мышцах за основы были взяты методики Persson [1983] и Sauro V.S. [1990], соответственно. Скелетные мышцы являются тканью, для обработки которой требуется значительно большее время по сравнению с такими органами как печень, почки, мозг. В названных органах активность ферментов ОДК и S-АМДК измеряли в цитозолях. Учитывая короткое время полужизни обоих ферментов [Tabor and Tabor, 1984; Seiler, 1996] и длительность приготовления цитозоля из скелетных мышц, мы определили оптимальные условия для измерения активности ферментов ОДК и S-АМДК в гомогенатах скелетных мышц.

А.

В.

1

Put.

Sm

»4

Sd

JL

1

Put.

I I I I I I I.inmmk

Рис.1. Хроматограммы A. — экстракта скелетных мышц без ионообменной хроматографии, В. — экстракта скелетных мышц после двухступенчатой ионообменной хроматографии.

Учитывая, что ферменты ОДК и S-АМДК находятся в цитозольной фракции клеток, активность этих ферментов соотносили с количеством цитоплазматического белка, измеренного методом Bradford [1976].

Оптимизированные условия проведения реакций подробно описаны в «Материалах и методах исследования». Метод позволяет определить активность ферментов ОДК и S-АМДК в 100 мг скелетных мышц.

3 Значения активностей ферментов ОДК, 5-АМДК и содержания полиаминов в скелетных мышцах разного функционального профиля. Было установлено, что величины активностей ключевых ферментов синтеза полиаминов и содержания полиаминов зависят от типа волокон, составляющих мышцу. Величины данных показателей в скелетных мышцах белых беспородных крыс весом 200-260 г возраста 3-4 месяца представлены в табл.1.

Таблица 1.

Активность ферменов ОДК , Б- АМДК и содержание полиаминов в

скелетных мышцах ( Х±БО, п=5 )

Типы мышечных волокон Активность (пмоль’4С02/мг белка час’1) Содержание (нмоль/мг белка)

ОДК Б-АМДК путресцин спермидин спермин

Оксидативные (У кр«с) Контроль (собств. данные) 8.87+0.50 3.62+0.30 1.03+0.03 2.52+0.04 4.08+0.10

Гликолитические (У крыс) Контроль (собств. данные) 2.42+0.20 1.50+0.30 0.66+0.01 1.56+0.03 3.50+0.10

Скелетные мышцы хомячков (Заиго еЬа!, 1990) 2 недели 30 недель 50,10+3.20 5,50+0.10 20,11+0.90 3,00+0.20 40,25+1.50 2.30+0.80 60,00+11.00 7,50+1.30 50,00+10.00 6,00+0.80

Причина более высоких величин активностей ферментов ОДК, Б-АМДК и, как следствие, содержания полиаминов в икроножной мышце, состоящей преимущественно из оксидативных мышечных волокон, может быть объяснена наличием в этом типе мышечных волокон большего количества рецепторов андрогенов [Фельдкорен, 1996; 1поие, 1994], необходимых для реализации метаболического действия андрогенов. В экспериментах на почках мышей, дефектных по синтезу рецепторов андрогенов, было показано, что активность ОДК и содержание путресцина значительно понижены

по сравнению с интактными животными [Pajunen, 1982]. По-видимому, мышечные волокна оксидативного типа, обладая большим количеством рецепторов андрогенов, являются более чувствительными к метаболическому действию андрогенов, что выражается в большей экспресии генов ОДК и S-АМДК.

В целом, низкие значения как активностей ферментов, так и содержания полиаминов объясняются возрастом животных и уровнем их двигательной активности. Известно, что система синтеза полиаминов особенно активна в развивающемся организме, который характеризуется высокими скоростями анаболических процессов [Ярыгин, 1987; Holtta, 1985; Matthews, 1993]. Это было хорошо продемонстрировано Sauro [1990] в экспериментах на хомячках разного возраста (табл.1). Полученные нами данные в целом находятся в соответствии с данными Sauro [1990]. 4 Исследование влияния однократных анаэробных и аэробных ФН на активность ферментов ОДК. S-АМДК и содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс. Результаты эксперимента представлены в таблицах 2,3 и на рисунках 2,3.

Результаты эксперимента показывают, что в восстановительный период после обоих видов ФН в скелетных мышцах происходит увеличение активностей ферментов ОДК и S-АМДК и, как следствие этого, повышение содержания полиаминов. При этом степень изменения метаболизма полиаминов в функционально различных мышечных волокнах зависела от характера ФН. Однократная анаэробная ФН приводила к большему увеличению активности ферментов ОДК, S-АМДК и содержания полиаминов в мышечных волокнах гликолитического типа: активность ОДК была повышенной на 170% и 250%, 93% и 180% через 2 и 8 часов отдыха в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно и достигала уровня покоя в обоих мышечных волокнах через 24 часа отдыха. Активность S-АМДК была повышена на 60% и 74%, 110% и 160% через 2 и 8 часов отдыха и оставалась повышенной через 24 часа отдыха на 10% и 14% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Содержание полиаминов увеличивалось в соответствии с повышением активностей ферментов. Так, содержание путресцина

Активность

ОДК

пмоль ИС02/ мг белка час’1.

.-1

Активность

в-АМДК пмоль 14С02/ мг белка час’1.

■1У

‘I—

Концентрация тестостерона (нг /мл)

Рис.2 Влияние однократной анаэробной ФН на ферменты синтеза полиаминов в оксидативных(1) и гликолитических(2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс(Х±80, п=8)

повышалось уже после 2 часов отдыха (на 130 % и 200 % в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно), что совпадает по времени с пиком активности ОДК. Содержание спермидина, спермина, образование которых катализирует Б-АМДК, увеличивалось к 8 часу отдыха (на 60% и 80% для спермидина, 40% и 52% для спермина в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно), что соответствовало пику активности Б-АМДК.

Следует отметить, что увеличению активности ОДК к 2 часу отдыха предшествовало повышение (на 100 %) концентрации тестостерона в крови животных. Повышение содержания в скелетных мышцах спермидина, спермина (полиамины, непосредственно участвующие во взаимодействиях с нуклеиновыми кислотами, стабилизирующие процессы транскрипции и трансляции белков) совпадало по времени также с повышенной концентрации тестостерона в крови. Данные результаты находятся в соответствии с положением об андрогенной регуляции ферментов синтеза полиаминов [Ярыгин, 1987; Сгоаг 1992; КоЛисЫ 1993]. Кроме того, повышенное содержание спермидина и спермина к 8 часу отдыха совпадает по времени с анаболическими процессами в скелетных мышцах после ФН, в частности с повышенной скоростью синтеза дРНК и рРНК

хромосомно-ядрышкового комплекса скелетных мышц [Ппискин, 1973]. По данным зарубежных авторов к этому времени увеличивается скорость процессов трансляции белков в скелетных мышцах [Саггаго, 1990; СЬеБку, 1992; Кгаетег, 1995].

Таблица 2.

Содержание полиаминов в скелетных мышцах после однократной анаэробной ФН (нмоль/мг белка, Х±БО, п=8).

Мышечные волокна путресцин спермидин спермин

Оксидативные До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 24ч 1.03±0.03 1.14±0.05 2.34±0.0б * 1.86±0.04 * 1.21 ±0.02 2.52А0.04 2.49±0.03 2.85±0.06 * 4.04±0.10 * 2.75±0.07 * 4.08±0.10 4.16±0.0б 4.50±0.09 * 5.91±0.13 * 4.38±0.08 *

Гликолигические До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых.: 2 ч 8ч 24ч 0.66±0.01 0.72±0.03 1.98±0.08 * 1,42±0.02 * 0.87±0.03 1.56±0.03 1.59±0.05 2.10±0.08* 2.81 ±0.08 * 1.80±0.03 * 3.50±0.09 3.32±0.07 3.96±0.10 * 5.35±0.09 * 4.12±0.06 *

* — различия по отношению к контрольной группе достоверны (р < 0.05)

После выполнения однократной ФН аэробного характера в скелетных мышцах наблюдались схожие процессы в изменение метаболизма полиаминов, но более выраженные в оксидативных мышечных волокнах: активность ОДК повышалась на 300% и 135%, через 2 часа отдыха в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Это сопровождалось увеличением содержания путресцина в оксидативных волокнах на 220%, а в гликолитических мышечных волокнах на 125%. К 8 часу отдыха активность ОДК и содержание путресцина начинали возвращаться к своим исходным величинам. Активность Б-АМДК начинала увеличиваться через 2 часа отдыха и повышалась к 8 часу отдыха на 122% и 93% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно, что вызывало соответствующее повышение содержания спермидина и спермина в этих мышечных волокнах: к 8 часу отдыха содержание спермидина и спермина было

полиаминов в оксидативных(1) и гликолитических(2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс(Х±80, п=8)

Таблица 3.

Содержание полиаминов в скелетных мышцах после однократной аэробной ФН (нмоль/мг белка, Х±БО, п=8).

Мышечные волокна путресцин спермидин спермин

Оксидативные До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 48ч 1.03±0.03 1.20±0.02 3.30±0.05 * 2.63±0.07 * 1.35±0.07 2.52±0.04 2.61±0.06 3.37±0.10 * 4.27±0.10 * 2.95±0.07 * 4.08±0.10 4.10±0.08 4.28±0.10 * 5.43±0.10 * 4.50±0.10 *

Гликолитические До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 48ч 0.66±0.03 0.70±0.02 1.49±0.05 * 1.12±0.02 * 0.82±0.03 1.5б±0.03 1,63±0.03 2.05±0.07 * 2.44±0.08 * 1.80±0.03 3.50±0.09 3.40±0.10 3.78±0.10 * 4.35±0.09 * 3.87±0.06

* — различия по отношению к контрольной группе достоверны ( р < 0.05)

повышенным на 69 % и 33 % в оксидативных, и, на 50 % и 24 % в гликолитических мышечных волокнах. Увеличение активностей ферментов и содержания полиаминов в скелетных мышцах происходило на фоне повышенной концентрации тестостерона в крови.

Полученные данные позволяют заключить, что изменение метаболизма полиаминов после ФН происходит в соответствии со специфичностью биохимических изменений метаболизма в скелетных мышцах, протекающих интенсивнее в функционально более активных мышечных волокнах при выполнении ФН определенной направленности [Яковлев, 1976]. Из полученных результатов по однократным ФН можно заключить, что система синтеза полиаминов участвует в адаптационных процессах, идущих в скелетных мышцах преимущественно на ранних сроках восстановления и это обусловлено повышением в это время концентрации тестостерона в крови.

5 Влияние систематической мышечной деятельности на содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс. Известно, что систематическое выполнение аэробных и анаэробных ФН приводит к разным изменениям концентрации тестостерона в крови [Рогозкин, 1988]. Изменение концентрации тестостерона при систематических аэробных ФН происходит в меньшей степени, чем после систематических анаэробных ФН [Рогозкин, 1988]. Это приводит к тому, что в состоянии покоя у животных, тренированных аэробными ФН, не наблюдается изменения в концентрации тестостерона в крови, в то время как у животных тренированных анаэробными ФН наблюдается его повышение на 50 %. Интересно отметить, что содержание полиаминов в смешанных мышечных волокнах у животных, тренированных анаэробными ФН, в состоянии покоя было значительно повышенным: на 130 %, 100 % и 160 % для путресцина, спермидина, спермина, соответственно. Содержание полиаминов у животных, тренированных аэробными ФН, было пониженным, а у животных, тренированных аэробными ФН с включением «ускорений», содержание путресцина и спермидина было достоверно повышенным на 70% по сравнению с уровнем покоя. При этом данное изменение в синтезе полиаминов у этой группы животных происходило на фоне неизмененной концентрации тестостерона в крови. Эти изменения в синтезе полиаминов, происходящие на фоне неизмененной концентрации тестостерона в крови животных, указывают на их сложную гуморальную регуляцию. Известно, что синтез полиаминов в органах и тканях

регулируется как анаболическими , так и катаболическими факторами, действие которых направлено на поддержание их оптимальной концентрации в клетках [Seiler, 1996].

Таблица 4.

Влияние систематических ФН на содержание полиаминов в смешанных мышечных волокнах (нмоль/мг белка, Х±80, п=8)

Условия опыта Путресцин Спермидин Спермин

Нетренированные 1.20±0.08 3.12±0.10 4.85±0.13

Аэробные ФН — 2.66±0.12 * 3.90±0.10 *

Аэробные с «ускорениями» l.mo.os * 2.75±0.10 * 5.30±0.20 *

Анаэробные ФН 2.35±0.10 * 3.95±0.10 8.43±0.9 *

* — различия по отношению к контрольной группе достоверны (р <0.05)

Таким образом, снижение содержания полиаминов после систематических аэробных ФН может быть обусловлено повышенной чувствительностью скелетных мышц к катаболическим гормонам (глюкокортикоидам), в то время как после систематических аэробных ФН с включением «ускорений», пониженной чувствительностью их к глюкокортикоидам, что приводит к повышению уровня полиаминов в скелетных мышцах. Но данное предположение требует дополнительного экспериментального подтверждения.

6 Влияние однократного и систематического введения Па-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах. Изучение однократного воздействия 17а-метилтестостерона на активность системы синтеза полиаминов было проведено в эксперименте на 4 группах животных, одна из которых служила контролем. Животных оставшихся групп исследовали через 2, 8 и 24 часа после введения. Было установлено, что под воздействием гормона синтез полиаминов в скелетных мышцах увеличивается (рис.4).

Рис.4. Влияние однократного введения 17си-метилтестостерона на ферменты синтеза полиаминов в оксидативных (1) и гликолитических (2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс (X+SD, п=8)

Характер изменений в системе синтеза полиаминов под воздействием 17а-метилтестостерона сходен с таковыми при однократных ФН, то есть происходит на фоне повышенной концентрации тестотстерона в крови. Однако, увеличение активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и их содержания происходит в более отставленный период ( 8 часов). Отставленный во времени эффект 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов можно объяснить более медленным поступлением гормона в клетки, так как известно, что во время ФН проницаемость мембран миоцитов за счет усиления перекисного окисления липидов резко увеличивается [Зезеров и соавт., 1987; Меерсон и соавт., 1988].

Степень изменения метаболизма полиаминов под воздействием 17а-метилтестостерона зависела также от типа мышечных волокон, составляющих скелетную мышцу. Увеличение активности ферментов ОДК и S-АМДК и содержания полиаминов происходило в большей степени в оксидативных мышечных волокнах. Активность ОДК увеличивалась через 2 часа действия гормона на

77% и 53%, а через 8 часов действия гормона на 210% и 130% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Активность Б-АМДК достоверно повышалась на 55% и 40% через 8 часов действия гормона в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Концентрация тестостерона повышалась через 2 часа на 87% и в дальнейшем начинала снижаться к исходному уровню. Увеличение содержания путресцина соответствовало увеличению активности ОДК, а спермидина и спермина увеличению активности Б-АМДК. Содержание путресцина повышалось на 31% и 13% после 2 часа, на 130% и 80% после 8 часов введения гормона в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Содержание спермидина повышалось после 8 часов введения гормона на 36% и 28%, а спермина на 20% и 14% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Через 24 часа действия гормона содержание спермидина и спермина оставалось достоверно повышенным в оксидативных мышечных волокнах на 27% и 10%.

Таблица 5.

Изменение содержания полиаминов в скелетных мышцах при введении 17а-метилтестостерона (нмоль/мг белка, приведены Х±БО, п=5).

Мышечные путресцин спермидин спермин

волокна

Оксидативные

Контроль 1.03±0.03 2.52±0.04 4.08±0.10

После введения

17а-

метилтестостерона

2ч 1.35±0.13 2.77±0.03 4.24±0.13

8ч 2.37±0.17 * 3.45±0.09 * 4.90±0.18 *

24 ч 1.72±0.08 3.2Ш.04 * 4.50±0.10 *

Гликолитические

Контроль 0.66±0.01 1.56±0.03 3.50±0.09

После введения

17а-

метилтестостерона 2ч 0.75±0.09 1.72±0.04 3.75±0.0б

8ч 1.20±0.08 * 2.00±0.03 * 4.00±0.13 *

24 ч 1.07±0.н 1.65±0.03 3.70±0.10

* — различие по сравнению с контролем достоверны (р<0,01)

Изучение воздействия систематического введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах проводили на двух группах животных — контрольной и экспериментальной. Животным экспериментальной группы ежедневно вводили 17а-метилтестостерон в дозе 0.1мг/100 г веса в течение четырёх недель. Животные контрольной группы не подвергались воздействию гормона. Исследование животных проводили через 48 часов после последнего введения 17а-метилтестостерона. Результаты исследования показывают, что систематическое введение 17а-метилтестостерона

приводит к увеличению активностей ферментов синтеза полиаминов (табл. 6) и содержания полиаминов в скелетных мышцах (табл. 8). Данные изменения более выражены для оксидативных мышечных волокон.

Таблица 6.

Влияние систематического введения 17а-метилтестостерона на активности ферментов ОДК и Б-АМДК в скелетных мышцах (пмоль |4С02/ мг белка час’1, п=5)

мышечные волокна ОДК Б-АМДК

контроль гормон контроль гормон

оксидативные 7.95±1.12 10.50±1.22* 3.44±0.30 4.28±0.09*

гликолитические 2.66±0.45 3.14±1.12* 1.50±0.08 1.67±0.10

* — различия по отношению к контролю достоверны( р < 0.05)

Активность ОДК повышалась на 32% и 18%, а активность Б-АМДК на 24% и 11 % в оксидативных и в гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Интересно отметить, что концентрация тестостерона в крови при систематическом введении 17а-метилтестостерона понижалась (табл.). Этот факт свидетельствует об усилении транслокации гормон-рецепторных комплексов в ядро клетки — мишени, где связываясь с промоторным участком ДНК, они вызывают синтез РНК-полимеразы И, а следовательно и синтез новых м РНК. Систематическое воздействие такого рода приводит к адаптивному синтезу структурных и энзиматических белков и именно этим может быть объяснено повышение активности андроген — чувствительных ферментов ОДК и Б-АМДК.

Таблица 7.

Влияние систематического введения 17а-метилтестостерона на концентрацию тестостерона в крови крыс.

условия опыта концентрация тестостерона (нг/мл)

контроль 1,3 ±0,20

введение 17а-метилтестостерона 0,90 ±0,30

Таблица 8.

Влиние систематического введения 17а-метилтестостерона на содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс ( нмоль/мг белка, Х±8В,п=5)

Тип мышечных волокон Путресцин Спермидин Спермин

контроль гормон контроль гормон контроль гормон

Оксидативные 1.10±0.05 1.33±0.05 * 2.50±0.08 2.88±0.10 * 4.10±0.10 4.64±0.15 *

Гликолитические 0.59±0.03 0.65±0.07 1.44±0.05 1.50±0.08 3.44±0.09 3.40±0.!0

* — различия по отношению к контролю достоверны( р < 0.05)

Достоверные изменения в содержании полиаминов происходили в оксидативных мышечных волокнах. Так, содержание путресцина, спермидина, спермина было повышено на 20%, 15%, 13% соответственно. В гликолитических мышечных волокнах содержание полиаминов не отличалось от уровня контроля.

Таким образом, введение 17а-метилтестостерона в течение четырёх недель приводило к повышению активности ключевых ферментов синтеза полиаминов ОДК и Б-АМДК в скелетных мышцах крыс и повышению содержания полиаминов в большей степени для оксидативных мышечных волокнах и это, по-видимому, связано с их наибольшей андрогенной чувствительностью. Заключение. В ходе проведенных экспериментов было показано, что два различных функциональных воздействия, — ФН и введение 17а-метилтестостерона, приводят к однотипным изменениям в метаболизме полиаминов в скелетных мышцах крыс. Это позволяет предположить, что система синтеза полиаминов в скелетных

мышцах активируется под воздействием андрогенов и, таким образом, участвует в анаболических процессах, идущих в восстановительный период в скелетных мышцах после ФН.

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокочувствительный метод определения полиаминов ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, позволяющий определить содержание полиаминов в 100 мг скелетных мышц. Метод включает предварительную очистку биологического материала с помощью ионообменной хроматографии с использованием сульфокатионита КРС-8п и анионита ДАУЭКС. 2.Оптимизирован метод измерения активностей орнитин-декарбоксилазы и Б- аденозилметиониндекарбоксилазы, основанный на применение радиактивномеченых субстратов ферментативных реакций. Метод имеет высокую специфичность и чувствительность.

3.Однократная аэробная ФН приводила к активации синтеза полиаминов в скелетных мышцах белых крыс, выраженное более в мышечных волокнах оксидативного типа, а однократная анаэробная ФН сопровождалась активацией синтеза полиаминов в большей степени в гликолитических мышечных волокнах. 4.Систематическая мышечная деятельность аэробной направленности сопровождается снижением содержания путресцина, спермидина и спермина в скелетных мышцах. Систематические анаэробные ФН и аэробные ФН с включением «ускорений» и приводили к увеличению содержания полиаминов в скелетных мышцах.

5.Однократное введение животным анаболического стероида 17а-метилтестостерона в дозе 0.2 мг/100 г веса вызывало активацию синтеза полиаминов с достижением пика активности к 8 часу действия гормона. Данное изменение было более выражено в оксидативных мышечных волокнах.

6. Ежедневное введение 17а-метилтестостерона в дозе 0.1мг/100 г веса в течение месяца вызывало достоверное увеличение активностей ОДК и Б-АМДК и содержания полиаминов в большей степени в оксидативных мышечных волокнах.

7. Полученные результаты свидетельствуют об участии полиаминов в процесах адаптации мышечной ткани к ФН и их взаимосвязи с динамикой изменения концентрации тестостерона при различных режимах двигательной активности.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Турханова Jl.В. Влияние разных вариантов систематических физических нагрузок на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс. Тезисы научной конференции НИИФК, СПб, 1995, с.50.

2. Турханова Л.В., Фельдкорен Б.И., Штайн Ю., Рогозкин В.А. Влияние физической нагрузки и введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс. Сб.»Современные проблемы физической культуры и спорта», СПб, 1998, с. 175-180.

3. Turchanowa L. and Rogozkin V.A. The Effect of exercise training on polyamines synthesis in rat skeletal muscle. 10 th International Conferense «Biochemistry of Exercise», Sydney, 1997.

4. Turchanowa L, Rogozkin V.A., Feldkoren B.I., Stein J. Influence of physical exercise and testosterone on ornithine decarboxylase activity and polyamine concentration in the rat skeletal muscle. 32nd Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation, Cracow, Poland, 18 April 1998.

5. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Stein J. Spermidine and spermine synthesis is up-regulated in slow-twitching oxidative fibers of the rat skeletal muscle after physical loading. Experimental Biology (FASEB Annual Meeting), San Francisco, USA, 1998, c.A.951.

6. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Milovic V., Stein J. Polyamine synthesis is up-regulated by physical loading and testosterone in the rat skeletal muscle. COST 917 Symposium «Advances in Polyamine Research», Trento, Italy, 1998.

7. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Milovic V., Stein J. Polyamines Specific metabolic regulators or multi-functional polycations — role of physical exercise and androgens on polyamine metabolism in the rat skeletal muscle. Biochemical Society (UK), Sheffield, UK, 1998.

Биохимия — Тест — Химия 11

11 № п/п Вопрос Эталоны ответов 5. гликогенсинтетаза 6. глюкозо-6-фосфатаза 168. При дефиците … развивается болезнь Мак-Ардля. 1. кислой α-глюкозидазы 2. глюкозо-6-фосфатазы 3. гликогенсинтетазы 4. фосфорилазы мышц 4 169. При дефиците … развивается болезнь Кори. 1. амило-1,6-глюкозидазы 2. фосфорилазы мышц 3.глюкозо-6-фосфатазы 4.гликогенсинтетазы 1 170. При дефиците … развивается агликогеноз. 1. фосфорилазы мышц 2. гликогенсинтетазы 3. галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы 4. амило-1,6-глюкозидазы 2 171. Гликогенфосфорилаза катализирует реакцию:… . 1. (С6Н10О5)n + Н3РО4 —> (С6Н10О5)n-1 + глюкозо-1-фосфат 2. (С6Н10О5)n + h3О —> декстрины —> мальтоза 3. С6Н12О6 + АТФ —> С6Н11О6-PO3h3 + АДФ 4. (С6Н10О5)n + УДФ-глюкоза —> (С6Н10О5)n+1 + УДФ 5. (С6Н10О5)n + h30 —> (С6Н10О5)n-1 + глюкоза 6. (С6Н10О5)n + h3O —> (С6Н10О5)n-2 + мальтоза 1 172. Гликогенсинтетаза катализирует реакцию… . 1. С6Н12О6 + АТФ —> С6Н11О6-PO3h3 + АДФ 2. (С6Н10О5)n + h3O —> (С6Н10О5)n-2 + мальтоза 3. (С6Н10О5)n + h3О —> (С6Н10О5)n-1 + глюкоза 4. (С6Н10О5)n + h3О —> декстрины —> мальтоза 5. (С6Н10О5)n + УДФ-глюкоза —> (С6Н10О5)n+1 + УДФ 5 173. Распад гликогена в печени включает этапы:… . 1. глюкозо-1-фосфат —> глюкозо-6-фосфат 2. глюкозо-6-фосфат + h3O —> глюкоза + Фн 3. гликоген + ФН —>глюкозо-1-фосфат 4. ветвление гликогена 1,2,3 174. … является активатором остатков глюкозы в реакции биосинтеза гликогена. 1. ГТФ 2. НАД 3. ФАД 4. УТФ 5. АДФ 6.УДФ 4 175. Распад гликогена в печени до глюкозы катализируют… . 1. амило-1,6-глюкозидаза 2. фоффорилаза 3. фосфоглюкомутаза 4. гексокиназа 5. альдолаза 1,2,3 176. Формулы … пропущены в последовательности реакций превращения глутамата в оксалоацетат. Nh3-CH-COOH O=C-COOH COOH | | | (Ch3)2 —> (Ch3)2 —> (Ch3)2 —> ….. —> | | | COOH COOH CO-SKoA CH-COOH O=C-COOH —> || —> ….. —> | CH-COOH Ch3-COOH 1. фумарата 2. малата 3. сукцината 4. глутамата 5. α-кетоглутарата 6. сукцинил-КоА 2, 3 177. Необратимые реакции гликолиза – это… . 1. фруктозо-6-фосфат + АТФ —> фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ 2. фосфоенолпируват + АДФ —> пируват + АТФ 3. глюкоза + АТФ —> глюкозо-6-фосфат + АДФ 4. фруктозо-1,6-дифосфат —> ГАФ + ДОАФ 5. 3-фосфоглицерат —> 2-фосфоглицерат 6. пируват —> лактат 1,2,3 178. Реакции субстратного фосфорилирования — это… . 1. глюкозо-6-фосфат + Н2О —> глюкоза + Н3РО4 2. фосфоенолпируват + АДФ —> пируват + АТФ 2,5 docsity.com

Биохимия мышц

 

Большую часть (до 60—65 %) мышечной клетки (волокна) занимают активные сократительные элементы — миофибриллы, которые служат рабочим аппаратом клетки и играют главную роль в двигательной функции организма. На долю белков миофибрилл приходится около 30 % общего белка мышц. Они представлены в основном миозином, актином, актомиозином, тропомиозином, тропонином и некоторыми другими белками. При этом миозин локализован в толстых филаментах миофибрилл, актин, тропонин и тропомиозин — в тонких, а актомиозин представляет собой комплекс актина и миозина. 
На долю миозина приходится около 40 % всех белков мышечной ткани. Он относится к фибриллярным белкам; получен в кристаллическом виде; его молекулярная масса 470 000. По растворимости и высаливаемости он ведет себя как типичный глобулин. Включает полный набор аминокислот, около 70 % которых приходится на дикарбоновые кислоты, что придает белку кислотный характер. Изоэлектрическая точка его находится при pH 5,4. Большое количество полярных групп, а также фибриллярная форма молекулы обусловливают высокую гидратацию миозина. 
Молекула миозина состоит из двух идентичных тяжелых и двух пар легких цепей. Тяжелые цепи (молекулярная масса по 200 000) в форме α-спиралей, скрученных в суперспираль, образуют стержень молекулы и заканчиваются в концевых глобулах (рис. 27). Это самые длинные из известных полипептидных цепей. Они содержат по 1800 аминокислотных остатков. В каждой концевой глобуле находятся еще две легкие цепи (относительная молекулярная масса по 18 000), свернутые в свои собственные глобулы, которые связаны нековалентно с основной.

 
Миозин обладает тремя важными биологическими функциями. Во-первых, при физиологических значениях ионной силы и pH молекулы миозина в растворе спонтанно образуют волокна. Это происходит благодаря возможности нековалентного взаимодействия 300—400 молекул миозина. Так образуется толстая нить миофибрилл мышечной ткани, которая при диаметре 16 нм имеет длину 1500 нм. В сечении нити насчитывается два-три десятка молекул. Молекулы миозина в толстых нитях уложены так, что в середине они стыкуются «хвост к хвосту», образуя зону в 150 нм, далее к обоим концам толстой нити они уже стыкуются «голова к хвосту», причем ТММ-части молекул выступают наружу (рис. 28). Стыковка молекул к тому же ступенчатая, как в коллагене. В результате этого выступающие части располагаются на толстой нити по спирали. Соединение «хвост к хвосту» обеспечивается так называемым легким меромиозином (ЛMM).

 
Во-вторых, миозин гидролизует АТФ по схеме:

 
где АТФ — аденозиндифосфат; АДФ — аденозинтрифосфат; Фн — неорганический фосфор. 
Эта реакция является непосредственным источником свободной энергии, необходимой для мышечного сокращения. 

 

В-третьих, миозин связывает полимеризованную форму актина (фибриллярный актин) — основной компонент тонких нитей миофибрилл. Именно это взаимодействие играет ключевую роль в генерировании силы, обеспечивающей смещение толстых и тонких нитей миофибрилл относительно друг друга.

 
Актин может существовать в двух формах: Г-форме — глобулярной, Ф-форме — фибриллярной. Он составляет 10—15% всех мышечных белков. В растворах с низкой ионной силой актин существует в виде мономера с молекулярной массой 47000. При повышении ионной силы раствора до физиологического уровня Г-актин полимеризуется в Ф-актин, очень похожий на нить. Г-актин представляет собой одну полипептидную цепочку, сложенную в глобулу. Его концевая аминокислотная последовательность такова: N-ацетил-Asp-Gly-Trp. В состав актина также входят редко встречающаяся аминокислота ξ-N-метиллизин, большое количество остатков пролина и семь остатков цистина. 
Молекула Г-актина может связать одну молекулу АТФ. Присоединение АТФ приводит к полимеризации в Ф-актин с одновременным расщеплением АТФ до АДФ и выделением Фн (неорганический фосфор), при этом АДФ остается связанным с Г-актино-выми субъединицами (рис. 29).

 
Быстрая полимеризация актина происходит также при добавлении ионов Mg2+. При этом образуется двухнитчатая спираль, в которой каждая составляющая напоминает нить бус, закрученных одна вокруг другой. Диаметр спирали — около 70 А. Структура состоит из повторяющихся участков длиной 360 А по оси спирали. Каждая спираль состоит из 200—300 отдельных глобул-бусинок. Относительная молекулярная масса Ф-актина находится в пределах 150 000. Актин не обладает АТФ-азной активностью, но значительно увеличивает гидролиз АТФ миозином. Так, число ферментативных циклов миозина увеличивается в 200 раз (от 0,05 до 10 с-1). Собственно гидролиз АТФ под действием одного миозина идет очень быстро, но продукты реакции — АДФ и Фн — высвобождаются медленно. Актин увеличивает АТФ-азную активность миозина, присоединяясь к комплексу АДФ-Фн-миозин, и ускоряет высвобождение АДФ и Фн (рис. 30).

 
После гидролиза актомиозин связывается с АТФ, что приводит к его диссоциации. В результате вновь образуется комплекс АТФ-миозин, входящий в новый каталитический цикл. Эти реакции идут с участием Mg2+. Важнейшая особенность процесса состоит в том, что актин обладает высоким сродством к миозину и комплексу АДФ-Фн-миозин, но низким сродством к комплексу АТФ-миозин. Вследствие этого актин то присоединяется к миозину, то высвобождается из него в зависимости от гидролиза АТФ. 
Именно это явление лежит в основе генерирования силы при мышечном сокращении. 

 

Актомиозин — это сложный комплекс, который образуется при добавлении раствора актина к раствору миозина. При этом молекулы миозина прикрепляются своими головками к бусинкам актина через SH-группы миозина и ОН-группы актина. Поскольку цепь Ф-актина содержит много молекул Г-актина, каждая нить Ф-актина может связывать большое число молекул миозина. Формирование этого комплекса сопровождается увеличением вязкости раствора. Вязкость возрастает при добавлении АТФ или в присутствии ионов Mg2+. Так было выявлено, что АТФ вызывает диссоциацию актомиозина на актин и миозин. При погружении актомиозиновых нитей в раствор, содержащий АТФ, K+ и Mg2+, они сокращаются. В тех же условиях нити, образованные из одного миозина, не сокращаются. Таким образом, мышечное сокращение возникает в результате взаимодействия актина, миозина и АТФ.

 
Тропомиозин постоянно присутствует в структуре тонких (актиновых) филаментов, имеет относительную молекулярную массу около 70000, палочковидную форму, длину примерно 40 нм и толщину 2 нм. Тропомиозин состоит из двух неидентичных α-спиральных полипептидных цепей, закрученных относительно друг друга. Эта сравнительно жесткая молекула располагается в желобке специальной цепочки Ф-актина (рис. 31). Протяженность тропомиозина соответствует семи Г-актиновым мономерам, а контактирует лишь с одной из двух цепей Ф-актина. Чистый тропомиозин легко присоединяется к Ф-актиновым филаментам.

 
Роль тропомиозина сводится к регулированию взаимодействия актина и миозина в процессе мышечного сокращения. 
Содержание тропомиозина составляет 10—12% всех белков миофибрилл или 2,5 % белков мышц. Растворим в воде, но из мышечной ткани водой не извлекается. Изоэлектрическая точка его лежит при pH 5,1.

 
Тропонин представляет собой сферическую молекулу с относительной молекулярной массой 76000, состоящую из трех различных субъединиц — полипептидных цепей, получивших свое название в соответствии с выполняемыми функциями: тропомиозинсвязывающая субъединица (ТнТ), ингибирующая (TнI) и кальцийсвязывающая (ТнС). Все компоненты связаны между собой и Ф-актином нековалентно. 
TнT имеет относительную молекулярную массу 37000, образована одиночной полипептидной цепью, содержащей 259 аминокислотных остатков, последовательность которых установлена. Эта субъединица имеет избыточный положительный заряд, в связи с этим изоэлектрическая точка находится при pH 8,8. ТнТ прочно связывается тропомиозином (см. рис. 31) и тропомиозин-Ф-актиновым комплексом, благодаря чему происходит присоединение TнI и TнC к комплексу Ф-актин-тропомиозин. 
Цепь ThI состоит из 179 остатков. Ее функция заключается в предотвращении взаимодействия миозиновых головок с актином. В результате блокируется как связывание, так и АТФ-азная активность миозина. 
Кальцийсвязывающая субъединица (ТнС) с относительной молекулярной массой 18 ООО образована полипептидной цепью, состоящей из 159 остатков аминокислот. ТнС — единственная из трех субъединица, несущая центр связывания Ca2+. 
Тропониновые комплексы (ТнТ, ThI и ТнС) располагаются на тонких нитях на расстоянии 385 А друг от друга, причем этот интервал задается длиной тропомиозина. Связываясь с одной молекулой тропомиозина, тропониновый комплекс регулирует активность примерно семи мономеров актина. 
В отсутствие Ca2+ тропонин и тропомиозин ингибируют взаимодействие актина и миозина. При этом тропомиозин стерически блокирует участки связывания S1 на актине (см. рис. 27). Ионы Ca2+, высвобождаемые из саркоплазматического ретикулума, связываются ТнС-компонентом тропонина, что вызывает конформационные сдвиги, передающиеся на тропомиозин и затем на актин. В частности, тропомиозин передвигается к центру длинной впадины, спирально расположенной вдоль тонкой нити. Это допускает взаимодействие головок миозина с актиновыми единицами тонких нитей. Возникает сила сокращения, и одновременно гидролизуется АТФ. Далее происходит удаление Ca2+ и тропомиозин вновь блокирует доступ актина к головкам миозина. Таким образом Ca2+ регулирует мышечное сокращение по аллостерическому механизму со следующей цепью передачи информации:

Ca2+ → Тропонин → Тропомиозин → Актин → Миозин

 
Современные методы биохимии, электронной микроскопии, дифракции рентгеновских лучей позволяют представить основные этапы механизма мышечного сокращения как конформационные переводы белковых компонентов миофибрилл, которые тесно связаны с этапами гидролиза АТФ (см. рис. 30). 

В состоянии покоя S1-головки миозина не связаны с тонкими актиновыми нитями и проявляют АТФ-азную активность. Миозин активно гидролизует АТФ до продуктов, которые прочно удерживаются в комплексе АДФ-Фн-миозин (рис. 32).

 
В этом физиологическом состоянии головки миозина располагаются вокруг толстой нити по спирали биполярно. 
Таким образом, система актин-миозин-тропонин представляет собой уникальный тип химического двигателя, поскольку она осуществляет непосредственное преобразование химической энергии в механическую при постоянных температуре и давлении. Ни одна из созданных человеком машин к подобному преобразованию энергии не способна. 
В послеубойный период свойства всех тканей животного организма значительно изменяются, особенно свойства мышечной ткани. Вследствие прекращения доступа кислорода, регулирования обмена веществ и энергии в тканях обратимые жизненные процессы становятся необратимыми, при этом распад клеточных веществ превалирует над синтезом. Затем под действием гидролитических ферментов начинается самораспад тканей. Наступает автолиз. 
Состояние автолиза тканей легко определяется по внешним признакам визуально. Сразу после убоя мышечная ткань расслаблена, поскольку в клетках содержится АТФ, уровень которого поддерживается в результате ряда хаотично протекающих реакций. Затем через несколько часов ранее расслабленные мышцы теряют свою гибкость, эластичность и становятся твердыми и непрозрачными. Наступает посмертное окоченение, которое сохраняется в течение 24—48 ч. 
Скорость развития окоченения и его глубина зависят от видовых особенностей животного и внешних физико-химических факторов. Так, например, при температуре, близкой к нулю, окоченение наступает для сырья из крупного рогатого скота через 18—24 ч, свиней 16—18 ч, кур 2—4 ч. Окоченение развивается вдвое быстрее при 15—18 °С, а при 37 °С — в четыре раза. При быстром охлаждении туш после убоя окоченение менее интенсивно; в мышцах молодых животных окоченение протекает быстрее, чем старых; упитанность мышц также влияет на глубину и скорость окоченения, которое протекает медленнее при высокой упитанности. Процесс посмертного окоченения зависит также и от состояния здоровья животного при жизни. 
Окоченение мышц связано с изменением состояния мышечных волокон, которые остаются напряженными. 

Механизм сокращения мышечных волокон в период окоченения сходен с механизмом их сокращения при жизни, однако имеются и существенные различия. Вместо организованного и регулируемого сокращения групп волокон под влиянием нервного импульса они беспорядочно сокращаются по всему объему мышцы. Процесс протекает несинхронно, отдельные волокна находятся в разной стадии сокращения. Неравномерность перехода в сокращенное состояние обнаруживается даже по длине одного и того же волокна: одна часть его может быть расслаблена, в то время как другая — сокращена. В структуре волокон развивается большое напряжение, которое выражается в появлении признаков их внутреннего строения. Число сокращенных волокон нарастает и достигает максимума в момент наиболее интенсивного посмертного окоченения. 
Молекулярная основа процесса такова: поперечные связи между филаментами актина и миозина сохраняются и не могут разорваться из-за отсутствия АТФ. Активный транспорт Ca2+ в саркоплазма-тический ретикулум оказывается невозможным, так же, как и переход миозина в активированное состояние, т. е. в конформацию АДф-Фн-миозин. По этой причине продукты гидролиза АТФ (АДФ-Фн) удаляются не вследствие образования комплекса АДФ-Фн-актин-миозин, а за счет диффузии. При этом не происходят соответствующие конформационные переходы в рабочих элементах клетки, а следовательно, взаимодействие актин-миозин остается. Актомиозиновый комплекс можно разрушить, приложив внешнюю силу, но восстановить потом нельзя. 
Для периода мышечного окоченения характерно накопление веществ небелковой природы, которые в совокупности сильно сдвигают pH саркоплазмы клетки в кислотную область. Это обстоятельство усиливает агрегационные процессы и создает фон для интенсивного окоченения мышц. При этом в значительной степени изменяются свойства белков, резко снижается их экстрагируемость, растворимость и водоудерживающая способность. В период максимального окоченения эти показатели минимальны, что связано с изоэлектрическим состоянием основных рабочих белков клетки (область pH около 5,5). При дальнейшем снижении или повышении pH гидратационная способность белков восстанавливается. По истечении 24—48 ч наступает период разрешения от мышечного окоченения, при котором все более заметными становятся признаки разрушения клеточных структур: ядра сморщиваются, появляются поперечные разрывы мышечных волокон. 
Современные представления о механизме автолитических процессов базируются на ферментативной природе посмертных изменений мышечной ткани, установленных еще в 1930-х годах И.А. Смородинцевым. Наиболее важное значение здесь отводится двум основным ферментным системам. Одна из них, очевидно, связана с функцией движения и регулирует сокращение — расслабление, другая катализирует непрерывный распад главных структурных элементов мышечного волокна по типу гидролиза. Роль каждой из этих двух систем в развитии этапов автолиза различна, но их функции тесно связаны между собой. 
Автолитические превращения белков наряду с другими биополимерами являются причиной формирования специфического вкуса и аромата. Основными компонентами являются аминокислоты и амиды (гистидин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глутамин, глицин, треонин, фенилаланин, лейцин и др.). Эти вещества накапливаются в процессе автолиза при распаде белков, а также пептидов, относящихся к экстрактивным веществам мышечной ткани. 
В миофибриллах мышечных клеток обнаружено небольшое количество других белков. В частности, известно, что белки актинины (α- и β-актинины) выполняют регуляторную роль в процессе сокращения, а также участвуют в образовании поперечных связей между тонкими нитями в саркомерах. 

Том 7, № 3 (2017)

Аннотация

Цель исследования: оценка влияния физических упражнений разной структуры (бег, передвижение на лыжах, плавание) на показатели коэффициента здоровья, физическую подготовленность, физическое состояние и работоспособность студентов в процессе занятий физической культурой. Материалы и методы: в исследовании принимали участие 45 студентов (юношей), средний возраст которых составил 19,46±1,51 года. Исследования проводились на базе Новокузнецкого института (филиала) ФГБОУ ВО Кемеровский государственный университет, в течение трех лет обучения студентов, по дисциплине «Физическая культура». Оценку физической работоспособности оценивали по Гарвардскому степ-тесту и вычислению индекса Гарвардского степ-теста (ИГСТ), который заключается в контроле за частотой сердечных сокращений (ЧСС) в восстановительный период после выполнения испытуемым дозированной физической нагрузки. Для определения физической подготовленности исследуемых студентов использовались контрольные тесты, выявляющие степень развития основных физических качеств. В качестве критерия адаптационных возможностей организма определяли коэффициент здоровья (КЗ), который вычисляли по частоте пульса (ЧП), артериальному давлению (САД, ДАД), массе тела (МТ), росту (Р) и возрасту (В): КЗ=0,01ЧП+0,01САД+0,008ДАД+0, 014В+0,009МТ-0,009Р-0,27. Оценивали физическое состояние (проводили морфофункциональные исследования, результаты определяли по таблице экспресс-оценке Г.Л. Апанасенко, Р.Г. Науменко). Провели сравнительную оценку влияния различных физических упражнений на показатели коэффициента здоровья, физическую подготовленность, физическое состояние и работоспособность студентов в процессе занятий физической культурой. А также использовали метод математической статистики. Обработка и анализ данных проводились общепринятыми статистическими методами с учетом пола и возраста студентов. Рассчитывали среднюю арифметическую (X), среднеквадратическое отклонение (а). Достоверность различий статистических оценок определяли по t-критерию Стьюдента. В таблицах приведены значения стандартного отклонения. Результаты: все физические упражнения разной структуры (бег, передвижение на лыжах, плавание), оказывают оздоровительный эффект на организм человека. Тем не менее, эффективность от лыжных прогулок немного выше, чем от плавания и легкоатлетического бега. Выводы: развитие физических качеств имеет положительную динамику во всех группах. Динамика физического состояния и работоспособности во всех исследуемых группах положительная. Наиболее эффективными физическими упражнениями, оказались те, которые используются на занятиях оздоровительным бегом на лыжах.

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

21222324252627

28293031   

       

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Апр

Май

Июн

Июл

Авг

Сен

Окт

Ноя

Дек

Метки

Настройки
для слабовидящих

Место образования в клетке атф. Строение и функции атф

АТФ или по полной расшифровке аденозинтрифосфорная кислота, является «аккумулятором» энергии в клетках организма. Ни одна биохимическая реакция не проходит без участия АТФ. Молекулы АТФ находятся в ДНК и РНК.

Состав АТФ

Молекула АТФ имеет три составляющих: три остатка фосфорной кислоты, аденин и рибоза. То есть, АТФ имеет строение нуклеотида и относится к нуклеиновым кислотам. Рибоза-это углевод,а аденин-азотистое основание. Остатки кислоты объединены друг с другом неустойчивыми энергетическими связями. Энергия появляется при отщеплении молекул кислоты. Отделение происходит благодаря биокатализаторам. После отъединения, молекула АТФ уже превращается в АДФ (если отщепилась одна молекула) или в АМФ (если отщепились две молекулы кислоты). При отделении одной молекулы фосфорной кислоты выходит 40 кДж энергии.

Роль в организме

АТФ играет не только энергетическую роль в организме,но и ряд других:

  • является результатом синтезирования нуклеиновых кислот.
  • регулирование многие биохимических процессов.
  • сигнального вещества в других взаимодействиях клеток.

Синтез АТФ

Получение АТФ проходит в хлоропластах и митохондриях. Важнейший процесс в синтезировании молекул АТФ — это диссимиляции. Диссимиляция — это разрушение сложного до более простого.

Синтез АТФ проходит не в один этап, а в три этапа:

  1. Первый этап — подготовительный. Под действием ферментов в пищеварении происходит распад того, что мы поглотили. При этом жиры разлагаются до глицерина и жирных кислот, белки до аминокислот, а крахмал до глюкозы. То есть, всё подготавливается для дальнейшего использования. Выделяется тепловая энергия
  2. Второй этап — это гликолиз (безкислородный). Вновь происходит распад, но здесь распаду подвергается ещё и глюкоза. Так же участвуют ферменты. Но 40 % энергии остаются в АТФ, а остальное расходуется в тепло.
  3. Третий этап — гидролиз (кислородный). Он происходит уже в самих митохондриях. Здесь участие принимает и кислород, который мы вдыхаем, и ферменты. После полной диссимиляции выделяется энергия для образования АТФ.

В любой клетке нашего организма протекают миллионы биохимических реакций. Они катализируются множеством ферментов, которые зачастую требуют затрат энергии. Где же клетка ее берет? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть строение молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.

АТФ — универсальный источник энергии

АТФ расшифровывается как аденозинтрифосфат, или аденозинтрифосфорная кислота. Вещество является одним из двух наиболее важных источников энергии в любой клетке. Строение АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций может протекать только при участии молекул вещества, особенно это касается Однако АТФ редко непосредственно участвует в реакции: для протекания любого процесса нужна энергия, заключенная именно в аденозинтрифосфата.

Строение молекул вещества таково, что образующиеся связи между фосфатными группами несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи также называются макроэргическими, или макроэнергетическими (макро=много, большое количество). Термин впервые ввел ученый Ф. Липман, и он же предложил использовать значок ̴ для их обозначения.

Очень важно для клетки поддерживать постоянный уровень содержания аденозинтрифосфата. Особенно это характерно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и для выполнения своих функций нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата.

Строение молекулы АТФ

Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков

Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз. Это значит, что в составе рибозы 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с аденином β-N-гликозидной связь на 1-ом атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-ом атоме углерода.

Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединяется к рибозе, выделяют также ГТФ (гуанозинтрифосфат), ТТФ (тимидинтрифосфат), ЦТФ (цитидинтрифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат). Все эти вещества схожи по строению с аденозинтрифосфатом и выполняют примерно такие же функции, однако они встречаются в клетке намного реже.

Остатки фосфорной кислоты . К рибозе может присоединиться максимально три остатка фосфорной кислоты. Если их два или только один, то соответственно вещество называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между фосфорными остатками заключены макроэнергетические связи, после разрыва которых высвобождается от 40 до 60 кДж энергии. Если разрываются две связи, выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. При разрыве связи между рибозой и фосфорным остатком выделяется всего лишь 13,8 кДж, поэтому в молекуле трифосфата только две макроэргические связи (Р ̴ Р ̴ Р), а в молекуле АДФ — одна (Р ̴ Р).

Вот каковы особенности строения АТФ. По причине того, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, строение и функции АТФ связаны между собой.

Строение АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата

Кроме энергетической, АТФ может выполнять множество других функций в клетке. Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами трифосфат участвует в построении нуклеиновый кислот. В этом случае АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и УТФ являются поставщиками азотистых оснований. Это свойство используется в процессах и транскрипции.

Также АТФ необходим для работы ионных каналов. Например, Na-K канал выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и вкачивает 2 молекулы калия в клетку. Такой ток ионов нужен для поддержания положительного заряда на наружной поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать. То же касается протонных и кальциевых каналов.

АТФ является предшественником вторичного мессенжера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами мембраны клетки, но и является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Так, циклический аденозинтрифосфат ингибирует синтез фермента, который катализирует расщепление лактозы в клетках бактерии.

Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором. Причем в подобных процессах антагонистом АТФ выступает АДФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат затормаживает, и наоборот. Таковы функции и строение АТФ.

Как образуется АТФ в клетке

Функции и строение АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Поэтому синтез трифосфата — это важный процесс образования энергии в клетке.

Выделяют три наиболее важных способа синтеза аденозинтрифосфата:

1. Субстратное фосфорилирование.

2. Окислительное фосфорилирование.

3. Фотофосфорилирование.

Субстратное фосфорилирование основано на множественных реакциях, протекающих в цитоплазме клетки. Эти реакции получили название гликолиза — анаэробный этап В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется две молекулы которые дальше используются для получения энергии, и также синтезируются два АТФ.

  • С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн —> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

Дыхание клетки

Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем передачи электронов по электронно-транспортной цепи мембраны. В результате такой передачи формируется градиент протонов на одной из сторон мембраны и с помощью белкового интегрального комплекта АТФ-синтазы идет построение молекул. Процесс протекает на мембране митохондрий.

Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс под названием дыхание. После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.

Фотофосфорилирование

Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование лишь с одним отличием: реакции фотофосфорилирования протекают в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется во время световой стадии фотосинтеза — основного процесса получения энергии у зеленых растений, водорослей и некоторых бактерий.

В процессе фотосинтеза все по той же электронно-транспортной цепи проходят электроны, в результате чего формируется протонный градиент. Концентрация протонов на одной из сторон мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется посредством фермента АТФ-синтазы.

В среднестатистической клетке содержится 0,04% аденозинтрифосфата от всей массы. Однако самое большое значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.

В клетке около 1 млрд молекул АТФ.

Каждая молекула живет не больше 1 минуты.

Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется в день 2000-3000 раз.

В сумме за сутки организм человека синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.

Заключение

Строение АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в процессах жизнедеятельности, ведь в макроэргических связях между фосфатными остатками содержится огромное количество энергии. Аденозинтрифосфат выполняет множество функций в клетке, и поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию вещества. Распад и синтез идут с большой скоростью, т. к. энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество любой клетки организма. Вот, пожалуй, и все, что можно сказать о том, какое строение имеет АТФ.

Продолжение. См. № 11, 12, 13, 14, 15, 16/2005

Расширенное планирование, 10 класс

Урок 19. Химическое строение и биологическая роль АТФ

Оборудование: таблицы по общей биологии, схема строения молекулы АТФ, схема взаимосвязи пластического и энергетического обменов.

I. Проверка знаний

Проведение биологического диктанта «Органические соединения живой материи»

Учитель читает тезисы под номерами, учащиеся записывают в тетрадь номера тех тезисов, которые подходят по содержанию их варианту.

Вариант 1 – белки.
Вариант 2 – углеводы.
Вариант 3 – липиды.
Вариант 4 – нуклеиновые кислоты.

1. В чистом виде состоят только из атомов С, Н, О.

2. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и обычно S.

3. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и Р.

4. Обладают относительно небольшой молекулярной массой.

5. Молекулярная масса может быть от тысяч до нескольких десятков и сотен тысяч дальтон.

6. Наиболее крупные органические соединения с молекулярной массой до нескольких десятков и сотен миллионов дальтон.

7. Обладают различными молекулярными массами – от очень небольшой до весьма высокой, в зависимости от того, является ли вещество мономером или полимером.

8. Состоят из моносахаридов.

9. Состоят из аминокислот.

10. Состоят из нуклеотидов.

11. Являются сложными эфирами высших жирных кислот.

12. Основная структурная единица: «азотистое основание–пентоза–остаток фосфорной кислоты».

13. Основная структурная единица: «аминокислот».

14. Основная структурная единица: «моносахарид».

15. Основная структурная единица: «глицерин–жирная кислота».

16. Молекулы полимеров построены из одинаковых мономеров.

17. Молекулы полимеров построены из сходных, но не вполне одинаковых мономеров.

18. Не являются полимерами.

19. Выполняют почти исключительно энергетическую, строительную и запасающую функции, в некоторых случаях – защитную.

20. Помимо энергетической и строительной выполняют каталитическую, сигнальную, транспортную, двигательную и защитную функции;

21. Осуществляют хранение и передачу наследственных свойств клетки и организма.

Вариант 1 – 2; 5; 9; 13; 17; 20.
Вариант 2 – 1; 7; 8; 14; 16; 19.
Вариант 3 – 1; 4; 11; 15; 18; 19.
Вариант 4 – 3; 6; 10; 12; 17; 21.

II. Изучение нового материала

1. Строение аденозинтрифосфорной кислоты

Кроме белков, нуклеиновых кислот, жиров и углеводов в живом веществе синтезируется большое количество других органических соединений. Среди них важнуую роль в биоэнергетике клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). АТФ содержится во всех клетках растений и животных. В клетках чаще всего аденозинтрифосфорная кислота присутствует в виде солей, называемых аденозинтрифосфатами . Количество АТФ колеблется и в среднем составляет 0,04% (в клетке в среднем находится около 1 млрд молекул АТФ). Наибольшее количество АТФ содержится в скелетных мышцах (0,2–0,5%).

Молекула АТФ состоит из азотистого основания – аденина, пентозы – рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, т.е. АТФ – особый адениловый нуклеотид. В отличие от других нуклеотидов АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты. АТФ относится к макроэргическим веществам – веществам, содержащим в своих связях большое количество энергии.

Пространственная модель (А) и структурная формула (Б) молекулы АТФ

Из состава АТФ под действием ферментов АТФаз отщепляется остаток фосфорной кислоты. АТФ имеет устойчивую тенденцию к отделению своей концевой фосфатной группы:

АТФ 4– + Н 2 О ––> АДФ 3– + 30,5 кДж + Фн,

т.к. это приводит к исчезновению энергетически невыгодного электростатического отталкивания между соседними отрицательными зарядами. Образовавшийся фосфат стабилизируется за счет образования энергетически выгодных водородных связей с водой. Распределение заряда в системе АДФ + Фн становится более устойчивым, чем в АТФ. В результате этой реакции высвобождается 30,5 кДж (при разрыве обычной ковалентной связи высвобождается 12 кДж).

Для того, чтобы подчеркнуть высокую энергетическую «стоимость» фосфорно-кислородной связи в АТФ, ее принято обозначать знаком ~ и называть макроэнергетической связью. При отщеплении одной молекулы фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорная кислота), а если отщепляются две молекулы фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфорная кислота). Отщепление третьего фосфата сопровождается выделением всего 13,8 кДж, так что собственно макроэргических связей в молекуле АТФ только две.

2. Образование АТФ в клетке

Запас АТФ в клетке невелик. Например, в мышце запасов АТФ хватает на 20–30 сокращений. Но ведь мышца способна работать часами и производить тысячи сокращений. Поэтому наряду с распадом АТФ до АДФ в клетке должен непрерывно идти обратный синтез. Существует несколько путей синтеза АТФ в клетках. Познакомимся с ними.

1. Анаэробное фосфорилирование. Фосфорилированием называют процесс синтеза АТФ из АДФ и низкомолекулярного фосфата (Фн). В данном случае речь идет о бескислородных процессах окисления органических веществ (например, гликолиз – процесс бескислородного окисления глюкозы до пировиноградной кислоты). Примерно 40% выделяемой в ходе этих процессов энергии (около 200 кДж/моль глюкозы), расходуется на синтез АТФ, а остальная часть рассеивается в виде тепла:

С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн ––> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

2. Окислительное фосфорилирование – это процесс синтеза АТФ за счет энергии окисления органических веществ кислородом. Этот процесс был открыт в начале 1930-х гг. XX в. В.А. Энгельгардтом. Кислородные процессы окисления органических веществ протекают в митохондриях. Примерно 55% выделяющейся при этом энергии (около 2600 кДж/моль глюкозы) превращается в энергию химических связей АТФ, а 45% рассеивается в виде тепла.

Окислительное фосфорилирование значительно эффективнее анаэробных синтезов: если в процессе гликолиза при распаде молекулы глюкозы синтезируется всего 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования образуется 36 молекул АТФ.

3. Фотофосфорилирование – процесс синтеза АТФ за счет энергии солнечного света. Этот путь синтеза АТФ характерен только для клеток, способных к фотосинтезу (зеленые растения, цианобактерии). Энергия квантов солнечного света используется фотосинтетиками в световую фазу фотосинтеза для синтеза АТФ.

3. Биологическое значение АТФ

АТФ находится в центре обменных процессов в клетке, являясь связующим звеном между реакциями биологического синтеза и распада. Роль АТФ в клетке можно сравнить с ролью аккумулятора, так как в ходе гидролиза АТФ выделяется энергия, необходимая для различных процессов жизнедеятельности («разрядка»), а в процессе фосфорилирования («зарядка») АТФ вновь аккумулирует в себе энергию.

За счет выделяющейся при гидролизе АТФ энергии происходят почти все процессы жизнедеятельности в клетке и организме: передача нервных импульсов, биосинтез веществ, мышечные сокращения, транспорт веществ и др.

III. Закрепление знаний

Решение биологических задач

Задача 1. При быстром беге мы часто дышим, происходит усиленное потоотделение. Объясните эти явления.

Задача 2. Почему на морозе замерзающие люди начинают притопывать и подпрыгивать?

Задача 3. В известном произведении И.Ильфа и Е.Петрова «Двенадцать стульев» среди многих полезных советов можно найти и такой: «Дышите глубже, вы взволнованы». Попробуйте обосновать этот совет с точки зрения происходящих в организме энергетических процессов.

IV. Домашнее задание

Начать подготовку к зачету и контрольной работе (продиктовать вопросы зачета – см. урок 21).

Урок 20. Обобщение знаний по разделу «Химическая организация жизни»

Оборудование: таблицы по общей биологии.

I. Обобщение знаний раздела

Работа учащихся с вопросами (индивидуально) с последующими проверкой и обсуждением

1. Приведите примеры органических соединений, в состав которых входят углерод, сера, фосфор, азот, железо, марганец.

2. Как по ионному составу можно отличить живую клетку от мертвой?

3. Какие вещества находятся в клетке в нерастворенном виде? В какие органы и ткани они входят?

4. Приведите примеры макроэлементов, входящих в активные центры ферментов.

5. Какие гормоны содержат микроэлементы?

6. Какова роль галогенов в организме человека?

7. Чем белки отличаются от искусственных полимеров?

8. Чем отличаются пептиды от белков?

9. Как называется белок, входящий в состав гемоглобина? Из скольких субъединиц он состоит?

10. Что такое рибонуклеаза? Сколько аминокислот входит в ее состав? Когда она была синтезирована искусственно?

11. Почему скорость химических реакций без ферментов мала?

12. Какие вещества транспортируются белками через клеточную мембрану?

13. Чем отличаются антитела от антигенов? Содержат ли вакцины антитела?

14. На какие вещества распадаются белки в организме? Сколько энергии выделяется при этом? Где и как обезвреживается аммиак?

15. Приведите пример пептидных гормонов: как они участвуют в регуляции клеточного метаболизма?

16. Какова структура сахара, с которым мы пьем чай? Какие еще три синонима этого вещества вы знаете?

17. Почему жир в молоке не собирается на поверхности, а находится в виде суспензии?

18. Какова масса ДНК в ядре соматической и половой клеток?

19. Какое количество АТФ используется человеком в сутки?

20. Из каких белков люди изготавливают одежду?

Первичная структура панкреатической рибонуклеазы (124 аминокислоты)

II. Домашнее задание.

Продолжить подготовку к зачету и контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 21. Зачетный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение устного зачета по вопросам

1. Элементарный состав клетки.

2. Характеристика органогенных элементов.

3. Структура молекулы воды. Водородная связь и ее значение в «химии» жизни.

4. Свойства и биологические функции воды.

5. Гидрофильные и гидрофобные вещества.

6. Катионы и их биологическое значение.

7. Анионы и их биологическое значение.

8. Полимеры. Биологические полимеры. Отличия периодических и непериодических полимеров.

9. Свойства липидов, их биологические функции.

10. Группы углеводов, выделяемые по особенностям строения.

11. Биологические функции углеводов.

12. Элементарный состав белков. Аминокислоты. Образование пептидов.

13. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

14. Биологические функция белков.

15. Отличия ферментов от небиологических катализаторов.

16. Строение ферментов. Коферменты.

17. Механизм действия ферментов.

18. Нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды и их строение. Образование полинуклеотидов.

19. Правила Э.Чаргаффа. Принцип комплементарности.

20. Образование двухцепочечной молекулы ДНК и ее спирализация.

21. Классы клеточной РНК и их функции.

22. Отличия ДНК и РНК.

23. Репликация ДНК. Транскрипция.

24. Строение и биологическая роль АТФ.

25. Образование АТФ в клетке.

II. Домашнее задание

Продолжить подготовку к контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 22. Контрольный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение письменной контрольной работы

Вариант 1

1. Имеются три вида аминокислот – А, В, С. Сколько вариантов полипептидных цепей, состоящих из пяти аминокислот, можно построить. Укажите эти варианты. Будут ли эти полипептиды обладать одинаковыми свойствами? Почему?

2. Все живое в основном состоит из соединений углерода, а аналог углерода – кремний, содержание которого в земной коре в 300 раз больше, чем углерода, встречается лишь в очень немногих организмах. Объясните этот факт с точки зрения строения и свойств атомов этих элементов.

3. В одну клетку ввели молекулы АТФ, меченные радиоактивным 32Р по последнему, третьему остатку фосфорной кислоты, а в другую – молекулы АТФ, меченные 32Р по первому, ближайшему к рибозе остатку. Через 5 минут в обеих клетках померили содержание неорганического фосфат-иона, меченного 32Р. Где оно окажется значительно выше?

4. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 18% – на урацил, 28% – на цитозин и 20% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Вариант 2

1. Жиры составляют «первый резерв» в энергетическом обмене и используются, когда исчерпан резерв углеводов. Однако в скелетных мышцах при наличии глюкозы и жирных кислот в большей степени используются последние. Белки же в качестве источника энергии всегда используются лишь в крайнем случае, при голодании организма. Объясните эти факты.

2. Ионы тяжелых металлов (ртути, свинца и др.) и мышьяка легко связываются сульфидными группировками белков. Зная свойства сульфидов этих металлов, объясните, что произойдет с белком при соединении с этими металлами. Почему тяжелые металлы являются ядами для организма?

3. В реакции окисления вещества А в вещество В освобождается 60 кДж энергии. Сколько молекул АТФ может быть максимально синтезировано в этой реакции? Как будет израсходована остальная энергия?

4. Исследования показали, что 27% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 15% – на урацил, 18% – на цитозин и 40% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Продолжение следует

В основе всех живых процессов лежит атомно-молекулярное движение. Как дыхательный процесс, так и клеточное развитие, деление невозможны без энергии. Источником энергетического снабжения является АТФ, что это такое и как образуется рассмотрим далее.

Перед изучением понятия АТФ необходима его расшифровка. Данный термин означает нуклеозидтрифосфат, который существенно значим для энергетического и вещественного обмена в составе организма.

Это уникальный энергетический источник, лежащий в основе биохимических процессов. Данное соединение является основополагающим для ферментативного образования.

АТФ был открыт в Гарварде в 1929 году. Основоположниками стали ученые Гарвардской медицинской школы. В их число вошли Карл Ломан, Сайрус Фиске и Йеллапрагада Суббарао. Они выявили соединение, которое по строению напоминало адениловый нуклеотид рибонуклеиновых кислот.

Отличительной особенностью соединения было содержание трех остатков фосфорной кислоты вместо одного. В 1941 году ученый Фриц Липман доказал, что АТФ имеет энергетический потенциал в пределах клетки. Впоследствии был обнаружен ключевой фермент, который получил название АТФ-синтаза. Его задача – образование в митохондриях кислотных молекул.

АТФ – это энергетический аккумулятор в клеточной биологии, является обязательным для успешного осуществления биохимических реакций.

Биология аденозинтрифосфорной кислоты предполагает ее образование в результате энергетического обмена. Процесс состоит из создания 2 молекул на второй стадии. Остальные 36 молекул появляются на третьем этапе.

Скопление энергии в структуре кислоты происходит в связующей части между остатками фосфора. В случае отсоединения 1 фосфорного остатка происходит энергетическое выделение 40 кДж.

В результате кислота превращается в аденозиндифосфат (АДФ). Последующее фосфатное отсоединение способствует появлению аденозинмонофосфата (АМФ).

Следует отметить, цикл растений предусматривает повторное использование АМФ и АДФ, в результате которого происходит восстановление этих соединений до состояния кислоты. Это обеспечивается процессом .

Строение

Раскрытие сущности соединения возможно после изучения того, какие соединения входят в состав молекулы АТФ.

Какие соединения входят в состав кислоты:

  • 3 остатка фосфорной кислоты. Кислотные остатки объединяются друг с другом посредством энергетических связей неустойчивого характера. Встречается также под названием ортофосфорной кислоты;
  • аденин: Является азотистым основанием;
  • рибоза: Представляет собой пентозный углевод.

Вхождение в состав АТФ данных элементов присваивает ей нуклеотидное строение. Это позволяет относить молекулу к категории нуклеиновых кислот.

Важно! В результате отщепления кислотных молекул происходит высвобождение энергии. Молекула АТФ содержит 40 кДж энергии.

Образование

Формирование молекулы происходит в митохондриях и хлоропластах. Основополагающий момент в молекулярном синтезе кислоты – диссимиляционный процесс. Диссимиляция – процесс перехода сложного соединения до относительно простого за счет разрушения.

В рамках синтеза кислоты принято выделять несколько стадий:

  1. Подготовительная. Основа расщепления – пищеварительный процесс, обеспечивается за счет ферментативного действия. Распаду подвергается пища, попавшая в организм. Происходит жировое разложение до жирных кислот и глицерина. Белки распадаются до аминокислот, крахмал – до образования глюкозы. Этап сопровождается выделением энергии теплового характера.
  2. Бескислородная, или гликолиз. В основе лежит процесс распада. Происходит глюкозное расщепление с участием ферментов, при этом 60% выделяемой энергии превращается в тепло, остальная часть остается в составе молекулы.
  3. Кислородная, или гидролиз; Осуществляется внутри митохондрий. Происходит с помощью кислорода и ферментов. Участвует выдыхаемый организмом кислород. Завершается полной . Подразумевает энергетическое выделение для формирования молекулы.

Существуют следующие пути молекулярного образования:

  1. Фосфорилирование субстратного характера. Основано на энергии веществ в результате окисления. Превалирующая часть молекулы формируется в митохондриях на мембранах. Осуществляется без участия ферментов мембраны. Совершается в цитоплазматической части посредством гликолиза. Допускается вариант образования за счет транспортировки фосфатной группы с иных макроэргических соединений.
  2. Фосфорилирование окислительного характера. Происходит за счет окислительной реакции.
  3. Фотофосфорилирование у растений в ходе фотосинтеза.

Значение

Основополагающее значение молекулы для организма раскрывается через то, какую функцию выполняет АТФ.

Функционал АТФ включает следующие категории:

  1. Энергетическую. Обеспечивает организм энергией, является энергетической основой физиологических биохимических процессов и реакций. Происходит за счет 2 высокоэнергетических связей. Подразумевает мышечное сокращение, формирование трансмембранного потенциала, обеспечение молекулярного переноса сквозь мембраны.
  2. Основу синтеза. Считается исходным соединением для последующего образования нуклеиновых кислот.
  3. Регулятивную. Лежит в основе регуляции большинства процессов биохимического характера. Обеспечивается за счет принадлежности к аллостерическому эффектору ферментативного ряда. Воздействует на активность регуляторных центров путем их усиления или подавления.
  4. Посредническую. Считается вторичным звеном в передаче гормонального сигнала в клетку. Является предшественником образования циклического АДФ.
  5. Медиаторную. Является сигнальным веществом в синапсах и иных взаимодействиях клеточного характера. Обеспечивается пуринергическая сигнальная передача.

Среди вышеперечисленных моментов главенствующее место отводится энергетической функции АТФ.

Важно понимать , независимо от того, какую функцию выполняет АТФ, ее значение универсально.

Полезное видео

Подведем итоги

В основе физиологических и биохимических процессов лежит существование молекулы АТФ. Основная задача соединений – энергетическое обеспечение. Без соединения невозможна жизнедеятельность как растений, так и животных.

Вконтакте

Важнейшим веществом в клетках живых организмов является аденозинтрифосфорная кислота или аденозинтрифосфат. Если ввести аббревиатуру этого названия, то получим АТФ (англ. ATP). Это вещество относится к группе нуклеозидтрифосфатов и играет ведущую роль в процессах метаболизма в живых клетках, являясь для них незаменимым источником энергии.

Вконтакте

Первооткрывателями АТФ стали учёные-биохимики гарвардской школы тропической медицины — Йеллапрагада Суббарао, Карл Ломан и Сайрус Фиске. Открытие произошло в 1929 году и стало главной вехой в биологии живых систем. Позднее, в 1941 году, немецким биохимиком Фрицем Липманом было установлено, что АТФ в клетках является основным переносчиком энергии.

Строение АТФ

Эта молекула имеет систематическое наименование, которое записывается так: 9-β-D-рибофуранозиладенин-5′-трифосфат, или 9-β-D-рибофуранозил-6-амино-пурин-5′-трифосфат. Какие соединения входят в состав АТФ? Химически она представляет собой трифосфорный эфир аденозина — производного аденина и рибозы . Это вещество образуется путём соединения аденина, являющегося пуриновым азотистым основанием, с 1′-углеродом рибозы при помощи β-N-гликозидной связи. К 5′-углероду рибозы затем последовательно присоединяются α-, β- и γ-молекулы фосфорной кислоты.

Таким образом, молекула АТФ содержит такие соединения, как аденин, рибозу и три остатка фосфорной кислоты. АТФ — это особое соединение, содержащее связи, при которых высвобождается большое количество энергии. Такие связи и вещества называются макроэргическими. Во время гидролиза этих связей молекулы АТФ происходит выделение количества энергии от 40 до 60 кДж/моль, при этом данный процесс сопровождается отщеплением одного или двух остатков фосфорной кислоты.

Вот как записываются эти химические реакции :

  • 1). АТФ + вода→АДФ + фосфорная кислота + энергия;
  • 2). АДФ + вода→АМФ + фосфорная кислота + энергия.

Энергия, высвобожденная в ходе указанных реакций, используется в дальнейших биохимических процессах, требующих определённых энергозатрат.

Роль АТФ в живом организме. Её функции

Какую функцию выполняет АТФ? Прежде всего, энергетическую. Как уже было выше сказано, основной ролью аденозинтрифосфата является энергообеспечение биохимических процессов в живом организме. Такая роль обусловлена тем, что благодаря наличию двух высокоэнергетических связей, АТФ выступает источником энергии для многих физиологических и биохимических процессов, требующих больших энергозатрат. Такими процессами являются все реакции синтеза сложных веществ в организме. Это, прежде всего, активный перенос молекул через клеточные мембраны, включая участие в создании межмембранного электрического потенциала, и осуществление сокращения мышц.

Кроме указанной, перечислим ещё несколько, не менее важных, функций АТФ , таких, как:

Как образуется АТФ в организме?

Синтез аденозинтрифосфорной кислоты идёт постоянно , т. к. энергия организму для нормальной жизнедеятельности нужна всегда. В каждый конкретный момент содержится совсем немного этого вещества — примерно 250 граммов, которые являются «неприкосновенным запасом» на «чёрный день». Во время болезни идёт интенсивный синтез этой кислоты, потому что требуется много энергии для работы иммунной и выделительной систем, а также системы терморегуляции организма, что необходимо для эффективной борьбы с начавшимся недугом.

В каких клетках АТФ больше всего? Это клетки мышечной и нервной тканей, поскольку в них наиболее интенсивно идут процессы энергообмена. И это очевидно, ведь мышцы участвуют в движении, требующем сокращения мышечных волокон, а нейроны передают электрические импульсы, без которых невозможна работа всех систем организма. Поэтому так важно для клетки поддерживать неизменный и высокий уровень аденозинтрифосфата.

Каким же образом в организме могут образовываться молекулы аденозинтрифосфата? Они образуются путём так называемого фосфорилирования АДФ (аденозиндифосфата) . Эта химическая реакция выглядит следующим образом:

АДФ + фосфорная кислота + энергия→АТФ + вода.

Фосфорилирование же АДФ происходит при участии таких катализаторов, как ферменты и свет, и осуществляется одним из трёх способов:

Как окислительное, так и субстратное фосфорилирование использует энергию веществ, окисляющихся в процессе такого синтеза.

Вывод

Аденозинтрифосфорная кислота — это наиболее часто обновляемое вещество в организме. Сколько в среднем живёт молекула аденозинтрифосфата? В теле человека, например, продолжительность её жизни составляет менее одной минуты, поэтому одна молекула такого вещества рождается и распадается до 3000 раз за сутки. Поразительно, но в течение дня человеческий организм синтезирует около 40 кг этого вещества! Настолько велики потребности в этом «внутреннем энергетике» для нас!

Весь цикл синтеза и дальнейшего использования АТФ в качестве энергетического топлива для процессов обмена веществ в организме живого существа представляет собой саму суть энергетического обмена в этом организме. Таким образом, аденозинтрифосфат является своего рода «батарейкой», обеспечивающей нормальную жизнедеятельность всех клеток живого организма.

АТФ (аденозинтрифосфорная кислота)

Живые организмы представляют собой термодинамически неустойчивые системы. Для их формирования и функционирования необходимо непрерывное поступление энергии в форме, пригодной для многопланового использования. Для получения энергии практически все живые существа на планете приспособились подвергать гидролизу одну из пирофосфатных связей АТФ. В связи с этим одна из главных задач биоэнергетики живых организмов это восполнение использованных АТФ из АДФ и АМФ.

АТФ — нуклеозидтрифосфат, состоит из гетероциклического основания — аденина, углеводного компонента — рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, соединенных последовательно друг с другом. В молекуле АТФ имеются три макроэнергетические связи.

АТФ содержится в каждой клетке животных и растений — в растворимой фракции цитоплазмы клетки — митохондриях, и ядрах. Она служит главным переносчиком химической энергии в клетки и играет важную роль в ее энергетике.

АТФ образуется из АДФ (аденозиндифосфорной) кислоты и неорганического фосфата (Фн) за счет энергии окисления в специфических реакциях фосфорилирования, происходящих в процессах гликолиза, внутримышечного дыхания и фотосинтеза. Эти реакции протекают в мембранах фторопластов и митохондрий, а также в мембранах фотосинтезирующих бактерий.

При химических реакциях в клетке потенциальная химическая энергия, запасенная в макроэнергетических связях АТФ, может переходить во вновь образующиеся фосфорилированные соединения: АТФ + D-глюкоза= АДФ + D — глюкозо-6-фосфат.

Она преобразуется в энергию тепловую, лучистую, электрическую, механическую и т.п., то есть служит в организме для теплообразования, свечения, накопления электричества, выполнения механической работы, биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, сложных углеводов, липидов.

В организме АТФ синтезируется путём фосфорилирования АДФ:

АДФ + h4PO4 + энергия → АТФ + h3O.

Фосфорилирование АДФ возможно двумя способами: субстратное фосфорилирование и окислительное фосфорилирование (используя энергию окисляющихся веществ). Основная масса АТФ образуется на мембранах митохондрий в ходе окислительного фосфорилирования H-зависимой АТФ-синтазой. Субстратное фосфорилирование АТФ не требует участия мембранных ферментов, оно происходит в процессе гликолиза или путём переноса фосфатной группы с других макроэргических соединений.

Реакции фосфорилирования АДФ и последующего использования АТФ в качестве источника энергии образуют циклический процесс, составляющий суть энергетического обмена.

В организме АТФ является одним из самых часто обновляемых веществ, так у человека продолжительность жизни одной молекулы АТФ менее 1 мин. В течение суток одна молекула АТФ проходит в среднем 2000—3000 циклов ресинтеза (человеческий организм синтезирует около 40 кг АТФ в день), то есть запаса АТФ в организме практически не создаётся, и для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянно синтезировать новые молекулы АТФ.

АТФ — единый универсальный источник энергии для функциональной деятельности клетки.

Внимание!

Если вам нужна помощь в написании работы, то рекомендуем обратиться к профессионалам. Более 70 000 авторов готовы помочь вам прямо сейчас. Бесплатные корректировки и доработки. Узнайте стоимость своей работы.

Поможем написать любую работу на аналогичную тему

Получить выполненную работу или консультацию специалиста по вашему учебному проекту

Узнать стоимость

Фибронектин — обзор | ScienceDirect Topics

Фибронектин

Фибронектины представляют собой крупные белки, состоящие из двух полипептидов с молекулярной массой приблизительно 235 кДа, связанных дисульфидными связями вблизи их С-концов (рис. 29.14). На электронных микрофотографиях фибронектин выглядит как V-образная пара длинных гибких стержней, соединенных на одном конце. В растворе молекула, вероятно, более компактна. Каждый полипептид представляет собой линейный массив трех типов доменов, называемых FN-I, FN-II и FN-III (для фибронектина-I, -II и -III).Все три типа доменов фибронектина состоят из антипараллельных β-цепей с консервативными остатками в их гидрофобных ядрах. Две дисульфидные связи стабилизируют домены FN-I и FN-II, тогда как домены FN-III не имеют дисульфидных связей. Домены FN-I и FN-II состоят примерно из 45 остатков; Домены FN-III в два раза больше. Домены FN-I и FN-II присутствуют в нескольких других белках, тогда как геном человека содержит около 170 генов с доменами FN-III, включая белки внеклеточного матрикса (Приложение 29.3), на поверхности клеток (рецептор гормона роста человека; см. рис. 24.6) и внутри клеток (титин; см. рис. 39.7).

Фибронектин связывается с различными лигандами, включая рецепторы клеточной поверхности, коллаген, протеогликаны и фибрин (еще один адгезивный белок). Таким образом, он способствует адгезии клеток к внеклеточному матриксу, направляет сборку коллагенов и фибриллинов, а также может сшивать молекулы матрикса. Последовательность RGD, которая способствует связыванию интегринов, находится на открытой петле домена 10 FN-III, но некоторые сайты связывания открываются только тогда, когда белок растягивается.Вариабельно сплайсированный V-домен, включенный в фибронектин плазмы, имеет второй сайт связывания интегрина. Глава 30 содержит дополнительные сведения об интегринах.

Два пула фибронектина имеют разные свойства распределения и растворимости. Тканевой фибронектин образует нерастворимые фибриллы в соединительных тканях по всему телу, особенно в эмбрионах и заживающих ранах. Фибробласты используют интегрин-зависимый процесс для сборки димеров фибронектина в фибриллярные агрегаты, достаточно большие, чтобы их можно было визуализировать с помощью световой микроскопии (рис.29.15). Для растворения этих фибрилл необходимы денатурирующие агенты и восстановление дисульфидов. Фибронектиновые фибриллы, по-видимому, связывают клетки более эффективно, чем растворимый фибронектин, и могут иметь дополнительную активность, важную для биологических функций.

Растворимый фибронектин плазмы димеры циркулируют в жидкостях организма. Белок отличается от тканевого фибронектина в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК). В тромбах фермент трансглутаминаза ковалентно связывает фибронектин плазмы с фибрином, образуя временную матрицу для заживления ран (см.32.11).

Ранние эмбрионы формируют исходный внеклеточный матрикс из фибронектина, который по мере созревания эмбриона заменяется коллагеном. Эмбриональные клетки, такие как клетки нервного гребня (предшественники пигментных клеток, симпатических нейронов и клеток мозгового вещества надпочечников), мигрируют по дорожкам во внеклеточном, богатом фибронектином матриксе. Антитела или фрагменты фибронектина, препятствующие адгезии клеток к фибронектину, ингибируют миграцию клеток нервного гребня, гаструляцию и образование многих эмбриональных структур, происходящих из мезенхимальных клеток.

Удивительно, но мышиные эмбрионы без фибронектина могут развиваться почти нормально примерно до 8-го дня (когда основной план тела уже определен). После этого гомозиготные нуль-мутантные мыши погибают от дефектов мезодермальных структур, включая хорду, мышцы, сердце и кровеносные сосуды. Мыши с нулевыми мутациями в основном рецепторе фибронектина, интегрине α 5 , имеют сходные, но немного более мягкие дефекты. Другие адгезивные гликопротеины и рецепторы должны компенсировать фибронектин в течение первых нескольких дней развития.

Фибронектин способствует направленной персистенции миграции фибробластов за счет взаимодействия как с его клеточно-связывающим, так и с гепарин-связывающим доменами

  • Петри, Р. Дж., Дойл, А. Д. и Ямада, К. М. Случайная миграция клеток по сравнению с направленно персистирующей миграцией клеток. Nat Rev Mol Cell Biol 10 , 538–549 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Беар, Дж.E. & Haugh, JM Направленная миграция мезенхимальных клеток: где встречаются передача сигналов и цитоскелет. Курс. мнение Клеточная биол. 30 , 74–82 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Парсонс, Дж. Т., Хорвиц, А. Р. и Шварц, М. А. Клеточная адгезия: интеграция динамики цитоскелета и клеточного напряжения. Nat Rev Mol Cell Biol 11 , 633–643 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Миссирлис, Д. и др. . Субстратное вовлечение интегринов α5β1 и αvβ3 необходимо, но недостаточно для высоконаправленной персистенции миграции на фибронектине. науч. Репутация 6 , 23258 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Джордж Э.L., Georges-Labouesse, E.N., Patel-King, R.S., Rayburn, H. & Hynes, RO. Дефекты мезодермы, развития нервной трубки и сосудов у эмбрионов мышей, лишенных фибронектина. Разработка 119 , 1079–1091 (1993).

    КАС пабмед Google ученый

  • Сингх П., Каррахер К. и Шварцбауэр Дж. Э. Сборка внеклеточного матрикса фибронектина. год. Преподобный Cell Dev.биол. 26 , 397–419 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Моу, Дж. К., Оу, Г. и Уивер, В. М. Сборка внеклеточного матрикса: многомасштабная деконструкция. Nat Rev Mol Cell Biol 15 , 771–785 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Банейкс, Г., Baugh, L. & Vogel, V. Сосуществующие конформации фибронектина в клеточной культуре, визуализированные с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции. Проц. Натл. акад. науч. США 98 , 14464–14468 (2001).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Чжун, К. и др. . Rho-опосредованная сократимость обнажает криптический сайт в фибронектине и индуцирует сборку матрикса фибронектина. J. Cell Biol. 141 , 539–551 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hynes, R. O. Внеклеточный матрикс: не просто красивые фибриллы. Наука 326 , 1216–1219 (2009).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ван, К., Seo, B.R., Fischbach, C. & Gourdon, D. Механобиология фибронектина регулирует онкогенез. Цел. Мол. биоинж. 9 , 1–11 (2016).

    Артикул КАС Google ученый

  • Фивер, Р. Э., Гельфанд, Б. Д., Ван, К., Шварц, М. А. и Блэкман, Б. Р. Атеропроновая гемодинамика регулирует отложение фибронектина для создания положительной обратной связи, которая поддерживает эндотелиальное воспаление. Обр. Рез. 106 , 1703–1711 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Альтрок, Э. и др. . Ингибирование отложения фибронектина улучшает экспериментальный фиброз печени. J. Гепатол. 62 , 625–633 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Панков Р.и Ямада, К. М. Фибронектин с первого взгляда. J. Cell Sci. 115 , 3861–3863 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Аота, С., Номидзу, М. и Ямада, К. М. Короткая аминокислотная последовательность Pro-His-Ser-Arg-Asn в человеческом фибронектине усиливает клеточно-адгезивную функцию. Дж. Биол. хим. 269 , 24756–24761 (1994).

    КАС пабмед Google ученый

  • Плау Э. Ф., Хаас Т. А., Чжан Л., Лофтус Дж. и Смит Дж. В. Связывание лиганда с интегринами. Дж. Биол. хим. 275 , 21788 (2000).

    Артикул Google ученый

  • Веннерберг, К. и др. . Бета-1-интегрин-зависимая и -независимая полимеризация фибронектина. J. Cell Biol. 132 , 227–238 (1996).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Pierschbacher, MD, Hayman, E.G. & Ruoslahti, E. Расположение места прикрепления клеток в фибронектине с помощью моноклональных антител и протеолитических фрагментов молекулы. Сотовый 26 , 259–267 (1981).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Катлер, С.М. и Гарсия, А. Дж. Инженерные адгезивные поверхности клеток, которые направляют связывание интегрина альфа5бета1 с использованием рекомбинантного фрагмента фибронектина. Биоматериалы 24 , 1759–1770 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Mostafavi-Pour, Z. и др. . Интегрин-специфические сигнальные пути, контролирующие формирование фокальной адгезии и миграцию клеток. Дж.Клеточная биол. 161 , 155–167 (2003).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Clark, R.A.F., An, J.-Q., Greiling, D., Khan, A. & Schwarzbauer, J.E. Миграция фибробластов на фибронектин требует трех различных функциональных доменов. Дж. Инвест. Дерматол. 121 , 695–705 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Мартино, М.М. и др. . Разработка микроокружения фактора роста с доменами фибронектина для ускорения заживления ран и костной ткани. науч. Перевод Мед. 3 , 100ra89–100ra89 (2011).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ пабмед Статья КАС Google ученый

  • Мартино, М. М. и Хаббелл, Дж. А. 12–14 повторы типа III фибронектина функционируют как домен, связывающий фактор роста с высокой беспорядочностью. ФАСЭБ Дж. 24 , 4711–4721 (2010).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Nishiya, N., Kiosses, W. B., Han, J. & Ginsberg, M. H. Комплекс α4 интегрин-паксиллин-Arf-GAP ограничивает активацию Rac передним краем мигрирующих клеток. Nat Cell Biol 7 , 343–352 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Голдфингер Л.E., Han, J., Kiosses, WB, Howe, A.K. & Ginsberg, MH. Пространственное ограничение фосфорилирования альфа4-интегрина регулирует ламеллиподиальную стабильность и альфа4бета1-зависимую миграцию клеток. J. Cell Biol. 162 , 731–741 (2003).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Лим, К. Дж. и др. . Интегрин-опосредованная активация протеинкиназы А на переднем крае мигрирующих клеток. Мол. биол. Сотовый 19 , 4930–4941 (2008 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Kim, S., Harris, M. & Varner, J.A. Регуляция опосредованной интегрином альфа vbeta 3 миграции эндотелиальных клеток и ангиогенеза с помощью интегрина альфа5бета1 и протеинкиназы A. J. Biol. хим. 275 , 33920–33928 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Дэвис, С.П., Редди, Х., Кайвано, М. и Коэн, П. Специфичность и механизм действия некоторых широко используемых ингибиторов протеинкиназы. Биохим. Дж. 351 , 95–105 (2000).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Эльфенбейн, А.& Simons, M. Сигнализация Syndecan-4 с первого взгляда. J. Cell Sci. 126 , 3799–3804 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Басс, доктор медицины и др. . Синдекан-4-зависимая регуляция Rac1 определяет направленную миграцию в ответ на внеклеточный матрикс. J. Cell Biol. 177 , 527–538 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Басс, доктор медицинских наук и др. . p190RhoGAP представляет собой точку схождения сигналов адгезии от альфа-5-бета-1 интегрина и синдекана-4. J Cell Биол 181 , 1013–1026 (2008 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Вудс, А., Longley, R.L., Tumova, S. & Couchman, J.R. Связывание синдекана-4 с высокоаффинным гепарин-связывающим доменом фибронектина стимулирует образование фокальной адгезии в фибробластах. Арх. Биохим. Биофиз. 374 , 66–72 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Довас, А., Йонеда, А. и Кучман, Дж. Р. PKC-бета-зависимая активация RhoA синдеканом-4 во время формирования фокальной адгезии. J. Cell Sci. 119 , 2837–2846 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ву Чжан, А. X. и Ньютон, А. С. Фармакология протеинкиназы С: усовершенствование инструментария. Биохим. Дж. 452 , 195–209 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Легг, Дж.W., Lewis, C.A., Parsons, M., Ng, T. & Isacke, C.M. Новый механизм, регулируемый PKC, контролирует ассоциацию CD44 с эзрином и направленную подвижность клеток. Nat Cell Biol 4 , 399–407 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Zhu, J. & Clark, R. A. F. Фибронектин в определенных местах связывает несколько факторов роста и усиливает их активность: расширение совместной парадигмы ECM-GF. Дж. Инвест. Дерматол. 134 , 895–901 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Капила И. и Линхардт Р. Дж. Взаимодействие гепарина с белком. Анжю. хим. Междунар. Эд. англ. 41 , 391–412 (2002).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Кохно М. и др. . Гепарин ингибирует миграцию гладкомышечных клеток коронарных артерий человека. Метаб. клин. Эксп. 47 , 1065–1069 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Макабе Т. и др. . Модуляция гаптотактической миграции метастатических клеток меланомы за счет взаимодействия гепарина и гепарин-связывающего домена фибронектина. Дж. Биол.хим. 265 , 14270–14276 (1990).

    КАС пабмед Google ученый

  • Сайки И., Мурата Дж., Накадзима М., Токура С. и Адзума И. Ингибирование инвазии сульфатированными производными хитина через внеклеточный матрикс и ферментативная деградация метастатическими клетками меланомы. Рак Res. 50 , 3631–3637 (1990).

    КАС пабмед Google ученый

  • Мици, М., Форстен-Уильямс, К., Гопалакришнан, М. и Ньюджент, М.А. Каталитическая роль гепарина во внеклеточном матриксе. Дж. Биол. хим. 283 , 34796–34807 (2008 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Угарова Т. П. и др. . Конформационные переходы в клеточно-связывающем домене фибронектина. Биохимия 34 , 4457–4466 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Mitsi, M., Hong, Z., Costello, C.E. & Nugent, M.A. Опосредованные гепарином конформационные изменения в фибронектине обнажают сайты связывания фактора роста эндотелия сосудов. Биохимия 45 , 10319–10328 (2006 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хаббард Б., Бучек-Томас, Дж. А., Наджент, М. А. и Смит, М. Л. Гепарин-зависимая регуляция конформации матрикса фибронектина. Матрица Биол. 34 , 124–131 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Smith, E. M., Mitsi, M., Nugent, M. A. & Symes, K. Взаимодействие PDGF-A с фибронектином показывает критическую роль гепарансульфата в направленной миграции клеток во время гаструляции Xenopus. Проц. Натл. акад. науч. США 106 , 21683–21688 (2009 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Халкиадаки, Г. и др. . Гепарин играет ключевую регулирующую роль посредством p53/FAK-зависимой передачи сигналов в адгезии и миграции клеток меланомы. ИУБМБ Лайф 63 , 109–119 (2011).

    КАС пабмед Google ученый

  • Рехенмахер, Ф. и др. . Функционализация αvβ3- или α5β1-селективных антагонистов интегрина для покрытия поверхности: метод различения подтипов интегрина In Vitro . Анжю. хим. Междунар. Эд. 52 , 1572–1575 (2012).

    Артикул КАС Google ученый

  • Katz, B.Z. и др. . Физическое состояние внеклеточного матрикса регулирует структуру и молекулярный состав клеточно-матриксных спаек. Мол. биол. Сотовый 11 , 1047–1060 (2000).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Zajaczkowski, M.B., Cukierman, E., Galbraith, C.G. & Yamada, K.M. Адгезии клеточного матрикса на гидрогелях из поли(винилового спирта). Ткань Eng. 9 , 525–533 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Кирнан, Дж.A. Формальдегид, формалин, параформальдегид и глутаровый альдегид: что это такое и что они делают. Микроскопия сегодня (2000).

  • Сюй, Дж. и др. . Отображение участков клеточной поверхности для сборки фибронектина модулируется адгезией клеток к (1)F3 и С-концевым модулям фибронектина. ПЛОС ОДИН 4 , e4113 (2009 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ пабмед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Бэ, Э., Sakai, T. & Mosher, D.F. Сборка экзогенного фибронектина фибронектин-нулевыми клетками зависит от адгезивного субстрата. Дж. Биол. хим. 279 , 35749–35759 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Томасини-Йоханссон, Б. Р. и др. . Пептид из 49 остатков адгезина F1 Streptococcus pyogenes ингибирует сборку матрикса фибронектина. Дж. Биол. хим. 276 , 23430–23439 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Слэк-Дэвис, Дж. К. и др. . Клеточная характеристика нового ингибитора киназы фокальной адгезии. Дж. Биол. хим. 282 , 14845–14852 (2007 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Шобер М. и др. . Киназа фокальной адгезии модулирует передачу сигналов напряжения, чтобы контролировать динамику актина и фокальной адгезии. J. Cell Biol. 176 , 667–680 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Митра, С.К., Хэнсон, Д.А. и Шлепфер, Д.Д. Киназа фокальной адгезии: управление и контроль подвижности клеток. Nat Rev Mol Cell Biol 6 , 56–68 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хортон, Э. Р. и др. . Модуляция сигналов адгезии FAK и Src происходит независимо от состава комплекса адгезии. J Cell Биол 212 , 349–364 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Хувенирс, С.и Danen, EHJ. Передача сигналов адгезии — перекрестные помехи между интегринами, Src и Rho. J. Cell Sci. 122 , 1059–1069 (2009).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Вультур, А. и др. . SKI-606 (бозутиниб), новый ингибитор киназы Src, подавляет миграцию и инвазию клеток рака молочной железы человека. Мол. Рак Тер. 7 , 1185–1194 (2008).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Thevathasan, J. V. и др. . Небольшая GTPase HRas формирует локальные сигналы PI3K посредством положительной обратной связи и регулирует постоянное растяжение мембраны в мигрирующих фибробластах. Мол. биол. Сотовый 24 , 2228–2237 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Вельф, Э.С., Ахмед С., Джонсон Х. Э., Мелвин А. Т. и Хо Дж. М. Мигрирующие фибробласты переориентируют направленность с помощью метастабильного PI3K-зависимого механизма. J Cell Биол 197 , 105–114 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Панков Р. и др. . Переключатель Rac регулирует случайную и направленную постоянную миграцию клеток. Дж.Клеточная биол. 170 , 793–802 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Клемке, Р. Л. и др. . Регуляция подвижности клеток митоген-активируемой протеинкиназой. J. Cell Biol. 137 , 481–492 (1997).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Слэк-Дэвис, Дж.К. и др. . PAK1 фосфорилирование MEK1 регулирует активацию MAPK, стимулируемую фибронектином. J. Cell Biol. 162 , 281–291 (2003).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Stähle, M. и др. . Механизмы индуцированной LPA миграции опухолевых клеток: критическая роль фосфорилированной ERK. J. Cell Sci. 116 , 3835–3846 (2003).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Danson, C.M., Pocha, S.M., Bloomberg, G.B. & Cory, G.O. Фосфорилирование WAVE2 киназами MAP регулирует постоянную миграцию и полярность клеток. J. Cell Sci. 120 , 4144–4154 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Виджелат, Э.С. и др. . Домен гепарина-II фибронектина представляет собой домен, связывающий фактор роста эндотелия сосудов: усиление биологической активности VEGF за счет особого синергизма фактора роста/матриксного белка. Обр. Рез. 99 , 853–860 (2006).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Kim, J., Han, I., Kim, Y., Kim, S. & Oh, ES С-концевой гепарин-связывающий домен фибронектина регулирует интегрин-опосредованное распространение клеток, но не активацию митоген-активируемых протеинкиназа. Биохим. Дж. 360 , 239–245 (2001).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Саончелла, С. и др. . Syndecan-4 сигнализирует совместно с интегринами Rho-зависимым образом при сборке фокальных адгезий и актиновых стрессовых волокон. Проц. Натл. акад. науч. США 96 , 2805–2810 (1999).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Вудс А., Кучман Дж. Р., Йоханссон С. и ХУК М. Адгезия и цитоскелетная организация фибробластов в ответ на фрагменты фибронектина. EMBO J. 5 , 665–670 (1986).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Басс М.Д. и др. . Триггер волос синдекан-4 инициирует заживление ран посредством эндоцитоза интегрина, регулируемого кавеолином и RhoG. Дев. Сотовый 21 , 681–693 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Huveneers, S., Truong, H., Fässler, R., Sonnenberg, A. & Danen, E.H.J. Связывание растворимого фибронектина с интегрином альфа5 бета1 — связь с перераспределением фокальной адгезии и сократительной формой. J. Cell Sci. 121 , 2452–2462 (2008 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Морган, М. Р. и др. . Фосфорилирование синдекана-4 является контрольной точкой рециркуляции интегрина. Дев. Сотовый 24 , 472–485 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мартино М.М., Брикес П.С., Маруяма К. и Хаббелл Дж.А. Системы доставки фактора роста на основе внеклеточного матрикса для регенерации кости. Доп. Наркотик Делив. Ред. 94 , 41–52 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Лин, Ф. и др. . Домены, связывающие фактор роста фибронектина, необходимы для выживания фибробластов. Дж. Инвест. Дерматол. 131 , 84–98 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Льопис-Эрнандес, В. и др. . Управляемая материалом сборка фибронектина для высокоэффективной презентации факторов роста. науч. Дополнение 2 , e1600188 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Бриззи, М.Ф., Тароне Г. и Дефилиппи П. Внеклеточный матрикс, интегрины и факторы роста как портные для ниши стволовых клеток. Курс. мнение Клеточная биол. 24 , 645–651 (2012).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Baugh, L. & Vogel, V. Структурные изменения фибронектина, адсорбированного на модельных поверхностях, исследованные с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции. Дж. Биомед.Матер. Рез. 69A , 525–534 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Кеселовски Б.Г., Коллард Д.М. и Гарсия А.Дж. Химия поверхности модулирует конформацию фибронектина и направляет связывание и специфичность интегрина для контроля клеточной адгезии. J Biomed Mater Res A 66 , 247–259 (2003).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Алтанков Г., Гриннелл Ф. и Грот Т. Исследования биосовместимости материалов: реорганизация фибронектина, связанного с субстратом, фибробластами на поверхностях с различной смачиваемостью. Дж. Биомед. Матер. Рез. 30 , 385–391 (1996).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гарсия, А. Дж., Вега, М. Д. и Боеттигер, Д. Модуляция клеточной пролиферации и дифференцировки посредством субстрат-зависимых изменений в конформации фибронектина. Мол. биол. Сотовый 10 , 785–798 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Миссирлис, Д. и Спатц, Дж. П. Комбинированное воздействие эластичности гидрогеля ПЭГ и клеточно-адгезивного покрытия на адгезию фибробластов и постоянную миграцию. Биомакромолекулы 15 , 195–205 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Карраер, К.Л. и Шварцбауэр, Дж. Э. Регуляция сборки матрикса посредством конформационных изменений фибронектина, зависящих от жесткости. Дж. Биол. хим. 288 , 14805–14814 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hocking, D.C. & Chang, C.H. Полимеризация фибронектина в матрице регулирует миграцию эпителиальных клеток мелких дыхательных путей. утра. Дж. Физиол.Мол.клеток легких. Физиол. 285 , L169–79 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Серрес, Э. и др. . Экспрессия фибронектина в глиобластомах способствует слипанию клеток, коллективной инвазии базальной мембраны in vitro и росту ортотопической опухоли у мышей. Онкоген 33 , 3451–3462 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Чех, Б. и др. . Аутокринный фибронектин направляет сборку матрикса и взаимодействие между клеточным матриксом и межклеточной адгезией в эндотелиальных клетках сосудов. J. Cell Sci. 123 , 3989–3999 (2010).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Амин А. и др. . Иригенин, новое ведущее вещество из западно-гималайского хемиома, ингибирует индуцированное фибронектином-доменом А метастазирование в клетках рака легких. Наука . Респ. . 1–13, doi: 10.1038/srep37151 (2016).

  • Сунг Б. Х., Кетова Т., Хошино Д., Зейлстра А. и Уивер А. М. Направленное движение клеток через ткани контролируется секрецией экзосом. Нац. коммун. 6 , 1–14 (2015).

    Google ученый

  • Бенеш, Э.С. и др. . Bves и NDRG4 регулируют направленную миграцию эпикардиальных клеток посредством аутокринного отложения внеклеточного матрикса. Мол. биол. Сотовый 24 , 3496–3510 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мана, Г. и др. . PPFIA1 управляет активной рециркуляцией интегрина α5β1 и контролирует фибриллогенез фибронектина и сосудистый морфогенез. Нац. коммун. 7 , 13546 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Райнеро, Э. и др. . Занятая лигандом интернализация интегрина связывает передачу сигналов питательных веществ с инвазивной миграцией. Отчеты о ячейках 10 , 398–413 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Пол, Н.R., Jacquemet, G. & Caswell, PT. Эндоцитарный трафик интегринов при миграции клеток. Карр Биол 25 , R1092–105 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Краузе, М. и Готро, А. Управление миграцией клеток: динамика ламеллиподия и регуляция направленного сохранения. Nat Rev Mol Cell Biol 15 , 577–590 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Уорт, округ Колумбия и др. . Интегрин Alpha v beta3 пространственно регулирует VASP и RIAM, чтобы контролировать динамику адгезии и миграцию. J Cell Биол 189 , 369–383 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мендоса, М.С. и др. . ERK-MAPK управляет выпячиванием ламеллиподий, активируя регуляторный комплекс WAVE2. Мол. Сотовый 41 , 661–671 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Танимура, С. и др. . Передача сигналов ERK способствует подвижности клеток, индуцируя локализацию миозина 1E на кончиках ламеллиподов. J Cell Биол 214 , 475–489 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Фулен, Дж. и др. . Полноразмерный фибронектин стимулирует накопление фибробластов на поверхности коллагеновых микротканей во время клеточно-индуцированного морфогенеза тканей. ПЛОС ОДИН 11 , e0160369 (2016).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Севилья, К.A., Dalecki, D. & Hocking, D.C. Фибронектин внеклеточного матрикса стимулирует самосборку микротканей на гелях нативного коллагена. Tissue Eng Часть A 16 , 3805–3819 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Нокс, П., Крукс, С. и Риммер, К.С. Роль фибронектина в миграции фибробластов в сгустки плазмы. Дж.Клеточная биол. 102 , 2318–2323 (1986).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гетц, Дж. Г. и др. . Биомеханическое ремоделирование микроокружения стромальным кавеолином-1 способствует инвазии и метастазированию опухоли. Сотовый 146 , 148–163 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кауконен Р. и др. . Нормальная строма подавляет пролиферацию раковых клеток посредством механочувствительной регуляции транскрипции, опосредованной JMJD1a. Нац. коммун. 7 , 12237 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ohashi, T. & Erickson, H. P. Пересматривая тайну мультимеров фибронектина: матрикс фибронектина состоит из димеров фибронектина, сшитых нековалентными связями. Матрица Биол. 28 , 170–175 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Sens, C. и др. . Фибронектины, содержащие экстрадомен А или В, усиливают дифференцировку остеобластов посредством различных интегринов. Дж. Биол. Химия . doi:10.1074/jbc.M116.739987 (2017).

    ПабМед Google ученый

  • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    EDA ось фибронектин-TLR4 поддерживает рост мегакариоцитов и воспаление при фиброзе костного мозга | Журнал экспериментальной медицины

    Фибронектин (FN) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 220 кДа, мРНК которого имеет три альтернативных сайта сплайсинга (называемые дополнительным доменом A [EDA], дополнительным доменом B [EDB] и IIICS или EIIIA, EIIIB и V), которые позволяют образовывать 20 различных изоформ. мРНК FN (White et al., 2008). В циркулирующем плазменном ФН (pFN) отсутствуют сегменты EDA и EDB, и он представляет собой растворимую форму, секретируемую гепатоцитами, в то время как клеточный FN (cFN) содержит различные пропорции сегментов EDA и EDB и организован в виде фибрилл в тканевом матриксе (Moretti et al., 2007). Внеклеточные индукторы альтернативно сплайсированных FN относительно неизвестны. В связи с этим было доказано, что TGF-β1 влияет на альтернативный сплайсинг экзона EDA посредством индуцированной экспрессии факторов сплайсинга SRp40, SRp20 или ASF/SF2 (Borsi et al., 1990; Хан и др., 2007). FN, содержащий сегмент EDA, обладает уникальными биохимическими свойствами по сравнению с изоформой, не содержащей этого домена. Было показано, что EDA, содержащий FN, активирует TLR4 во врожденном иммунном ответе (Okamura et al., 2001). Недавно мы продемонстрировали, что мыши с конститутивным включением экзона EDA (EIIIA +/+ ) или нокаутом экзона EDA (EIIIA -/- ) демонстрируют регулярный гемопоэтический гомеостаз, хотя тканеспецифические компенсации в количестве FN и в была обнаружена экспрессия рецепторов ФН (Malara et al., 2016). Несмотря на это знание, на сегодняшний день экспрессия и функция изоформ cFN при фиброзе костного мозга (BM) не исследованы.

    Фиброз BM возникает вторично по отношению к нескольким гематологическим и негематологическим заболеваниям (Kuter et al., 2007). Патофизиология, лежащая в основе фиброза костного мозга, остается неясной, несмотря на интенсивные исследования при отсутствии специфической терапии (Kuter et al., 2007). Фиброз костного мозга характеризуется увеличением числа стромальных клеток, усиленным неоангиогенезом и гиперклеточностью костного мозга (Cervantes et al., 2009). Кроме того, у пациентов с фиброзом БМ повышен уровень белков внеклеточного матрикса (ECM), особенно ретикулина, волокон FN и, в некоторых случаях, волокон коллагена. Фиброз BM также связан с увеличением числа и аномальными функциями в линии мегакариоцитов (Mk). Аберрантный мегакариопоэз является отличительной чертой миелопролиферативных новообразований (МПН), группы клональных гематологических злокачественных новообразований, происходящих из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), что приводит к увеличению количества зрелых клеток крови в периферической крови (Tefferi et al., 2007). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицирует MPN как единую группу; однако они включают три клинически определяемых нарушения, вызванных измененной передачей сигналов JAK/STAT, называемых истинной полицитемией (PV), эссенциальной тромбоцитемией (ET) и первичным миелофиброзом (PMF; Vannucchi et al., 2009; Vardiman et al., 2009). К настоящему времени были описаны три мутации драйвера, ограниченные MPN, в том числе в JAK2, кальретикулине и вирусе миелопролиферативного лейкоза (James et al., 2005; Pardanani et al., 2006; Klampfl и др., 2013; Нангалия и др., 2013). Среди МПН ПМФ представляет собой патологическое состояние, характеризующееся глубоким изменением структуры костного мозга и состава матрикса. У пациентов с этой патологией наблюдается большое количество атипичных Mk в костном мозге и прогрессирующее накопление ретикулина и коллагена, что ухудшает прогноз пациента (Kuter et al., 2007). Предполагается, что Mk представляют собой подтип неопластических клеток, который преимущественно заставляет фибробласты продуцировать внеклеточные матриксы при заболевании посредством неконтролируемой продукции и высвобождения нескольких цитокинов, таких как трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1), тромбоцитарный фактор роста или основной фактор роста фибробластов (Malara et al., 2015). Более трех десятилетий назад сообщалось о снижении уровня ФН в плазме у пациентов с ПМФ, в то время как аномальная форма ФН, обозначенная как ФН-С, была обнаружена в семи образцах плазмы пациентов с ПМФ с помощью иммуноанализа (Norfolk et al., 1983; Vellenga). и др., 1985). Совсем недавно ФН был вовлечен в аберрантные взаимодействия между стромальным и гемопоэтическим компартментами в нише костного мозга у пациентов с ПМФ, поскольку повышенный синтез ФН был обнаружен как в мезенхимальных стволовых клетках, происходящих из костного мозга (МСК), так и у пациентов с префибротическим и явным фиброзным ПМФ. а также в остеобластах, полученных от пациентов с ПМФ (Schneider et al., 2014; Аббонанте и др., 2016b; Аванзини и др., 2018). Напротив, экспрессия и функция изоформ cFN у пациентов с ПМФ до настоящего времени не исследовались.

    Исходя из этого, в этом исследовании мы оценили потенциальное влияние альтернативного сплайсинга EDA FN на развитие и прогрессирование фиброза костного мозга.

    Дезоксихолатное фракционирование фибронектина (ФН) и анализ биотинилирования для измерения рециклированных фибрилл ФН в эпителиальных клетках — BIO-PROTOCOL

    Аннотация

    Фибронектин (FN) представляет собой белок внеклеточного матрикса, который секретируется многими типами клеток и связывается преимущественно с рецептором интегрина α5β1 на клеточной поверхности.Связывание интегрина α5β1 инициирует поэтапную сборку FN в фибриллы, процесс, называемый фибриллогенезом. Мы и несколько других продемонстрировали критические эффекты фибриллогенеза на миграцию клеток и метастазирование. В то время как методы иммуноокрашивания и микроскопии помогают визуализировать включение ФН в фибриллы, при этом каждая фибрилла имеет длину не менее 3 мкм, первое исследование, в котором был разработан метод биохимического фракционирования ФН для количественного определения включенного в фибриллы ФН, было опубликовано группой Жана Шварцбауэра в 1996 году.Наш протокол был адаптирован из оригинальной публикации и был протестирован на нескольких типах клеток, в том числе, как показано здесь, на эпителиальных клетках молочной железы MCF10A и эпителиальных клетках рака почки Caki-1. Используя две экстракции детергентом, клеточный ФН разделяют на нерастворимый в детергенте или включенный в фибриллы ФН и растворимый ФН или не включенные фракции. Чтобы определить, использует ли фибриллогенез переработанный пул FN, мы использовали анализ рециркуляции меченого биотином FN (FN-биотин), который был модифицирован по сравнению с предыдущим исследованием.Используя комбинацию методов анализа рециркуляции и дезоксихолатного фракционирования, можно количественно продемонстрировать степень фибриллогенеза в клетках в различных экспериментальных условиях и определить источник ФН для фибриллогенеза.

    Ключевые слова: фибронектин (ФН), фибриллогенез, внеклеточный матрикс, рециклинг, эндоцитоз

    История вопроса

    Фибронектин (ФН) представляет собой повсеместно продуцируемый компонент внеклеточного матрикса (ВКМ) (Uitto et al., 1989; Мао и Шварцбауэр, 2005). Пулы фибронектина генерируются транскрипционно, что может быть увеличено несколькими факторами роста, такими как TGF-β1 (Yokoi et al. , 2002; Mimura et al. , 2004; Tang et al. , 2007). Поэтапный процесс фибриллогенеза, включающий взаимодействие рецептора клеточной поверхности Integrin α5β1 с димерным FN, управляет процессом фибриллогенеза в клетках (Yang and Hynes, 1996). Регуляция интегрина α5β1 посредством циклов активации/инактивации рецепторов, эндоцитоза и рециркуляции рецепторов влияет на фибриллогенез (Gao et al., 2000; Белый и др. , 2007; Касвелл и др. , 2008) с FN, способствующим чистой скорости эндоцитоза интегринов в активных конформациях (Arjonen et al. , 2012). Актуальность фибриллогенеза ФН для клеточного исхода была продемонстрирована многочисленными исследованиями, изучающими специфические для фибрилл функции белка ФН. Например, полимерная форма фибронектина или «супер-фибронектин» проявляет антиметастатические и антиангиогенные свойства в отношении различных типов опухолей (Pasqualini et al., 1996; Йи и Руослахти, 2001). В отсутствие матрицы FN, как это наблюдается при синдроме фон Хиппеля Линдау, рак почки характеризуется мутацией или потерей белка фон Хиппеля Линдау (VHL) (Ohh et al. , 1998; Hoffman et al. , 2001), введение мутанта VHL , не способного образовывать фибронектиновый матрикс, недостаточно для подавления образования опухолей у мышей SCID (Stickle et al. , 2004). Все болезненные мутанты гена VHL при раке почки также не формируют матрицу FN (Hoffman et al., 2001). Таким образом, анализ фибрилл по сравнению с растворимым ФН может быть важен для исследований, изучающих вклад матрикса ФН в клеточный ответ. Для изучения фибриллогенеза успешно использовались анализы конечной точки и в реальном времени (Pankov et al. , 2000; Mao and Schwarzbauer, 2005). Оба исследования основаны на подходах, основанных на микроскопии, для определения фибриллогенеза в клетках. Биохимическая фракция ФН представляет собой количественный подход, дополняющий методы на основе микроскопии для определения уровней фибрилл, включенных из растворимого ФН.Использование анализа фракционирования в сочетании с анализом рециркуляции позволяет нам определить, рециркулируется ли ФН, включенный в матрицу, из существующего пула ФН в клетке или из автономных источников клетки. Анализ рециркуляции FN-биотина проще, чем классические анализы переключения температуры, которые исследуют рециркуляцию рецепторов (Roberts et al. , 2001). Кроме того, анализы с переключением температуры количественно определяют рециркуляцию белка по снижению скорости эндоцитоза белка; требующие дополнительных лизосомных или протеасомных ингибиторов в анализе.Наш анализ рециркуляции может быть адаптирован ко многим различным белкам, локализующимся внутри клетки и на клеточной мембране. При выполнении нашего протокола фракционирования FN мы обнаружили интегрин β1 в растворимой и нерастворимой фракциях. Это наблюдение можно распространить на рециркуляцию интегринов с использованием интегрина, конъюгированного с биотином, или любого интересующего белка. В качестве альтернативы также можно провести эксперименты по иммунопреципитации рециркулированной белковой фракции, чтобы определить, взаимодействуют ли определенные белки предпочтительно с двумя фракциями FN.Этот протокол может помочь ответить на несколько вопросов, связанных с кинетикой переноса белков, взаимодействующими белками-партнерами и новыми функциональными характеристиками, основанными на связывании белков в различных фракциях.

    Материалы и реагенты

    1. Коническая пробирка 15 мл (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 339650)
    2. Наконечник пипетки
      1250 мкл (USA Scientific, TipOne, каталожный номер: 1112-1720)
      200 мкл (USA Scientific, TipOne, каталожный номер: 1110-1700)
      20 мкл (USA Scientific, TipOne, каталожный номер: 1123-1710)
      10 мкл (USA Scientific, TipOne, каталожный номер: 1111-3700)
    3. Алюминиевая фольга (Walmart, 551605957)
    4. Стакан (100 мл, WWR, каталожный номер: 8

      -200)


    5. Фильтровальная бумага (GE Healthcare, каталожный номер: 1001-929)
    6. Колба T75 (Corning, каталожный номер: 353824)
    7. Планшеты для культур тканей с шестью лунками (Corning, каталожный номер: 3506)
    8. Подъемник клеток (Fisher Scientific, Fisherbrand TM , каталожный номер: 08-100-240)
    9. Игла 23 G (BD, Precision Glide, каталожный номер: 305193)
    10. Микроцентрифужные пробирки (Eppendorf, каталожный номер: 022600028)
    11. Линии клеток молочной железы MCF10A (ATCC, каталожный номер: CRL-10317)
    12. Линии клеток рака почки Caki-1 (ATCC, каталожный номер: HTB-46)
    13. Белковая лестница (Bio-Rad Laboratories, каталожный номер: 1610375)
    14. Мембрана для переноса белка PVDF (Merck, каталожный номер: IPVH08100)
    15. Антитело к фибронектину (Santa Cruz Biotechnology, каталожный номер: sc-59826)
    16. Антитело к актину (Abcam, каталожный номер: ab8227)
    17. Антитело GAPDH (Abcam, каталожный номер: ab9484)
    18. Меченый биотином фибронектин (CYTOSKELETON, каталожный номер: FNR03)
    19. Конъюгированный стрептавидин IRDye ® (LI-COR, каталожный номер: 926-32230)
    20. Вторичное антитело IRDye 800CW (LI-COR, каталожный номер: 925-32210)
    21. DMEM/F-12 HEPES (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 11330057)
    22. Инсулин (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 12585014)
    23. EGF (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: PHG0313)
    24. Гидрокортизон (Corning, каталожный номер: 354203)
    25. Лошадиная сыворотка (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 16050122)
    26. Пенициллин-Стрептомицин (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 15140122)
    27. Холерный токсин (Sigma-Aldrich, каталожный номер: C8052-2MG)
    28. Сухое обезжиренное молоко (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: LP0031B)
    29. BSA (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP9703100)
    30. McCoy’s 5A (ATCC, каталожный номер: 30-2007)
    31. FBS (Corning, каталожный номер: 35-011-CV)
    32. 0.05% Трипсин-ЭДТА (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 25300062)
    33. SDS (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP166-100)
    34. Дезоксихолат натрия (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP349-100)
    35. Трис База (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP152-1)
    36. Трис-HCl (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP153-1)
    37. Глицин (Fisher Scientific, Fisher Chemical TM , каталожный номер: G48-212)
    38. Tween 20 (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP337-500)
    39. Гранулы гидроксида натрия (Fisher Scientific, Fisher Chemical TM , каталожный номер: S318-1)
    40. Этанол, абсолютный (проба 200) (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP2818500)
    41. N-этилмалеимид (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 23030)
    42. Йодоуксусная кислота (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 35603)
    43. DTT (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP172-25)
    44. Бромфеноловый синий (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP115-25)
    45. Нитроцеллюлоза (GE Healthcare, каталожный номер: 10600012)
    46. NaCl (Fisher Scientific, Fisher BioReagents TM , каталожный номер: BP358-1)
    47. KCl (Fisher Scientific, Fisher Chemical TM , каталожный номер: P217-3)
    48. Na 2 HPO 4 (MP Biomedicals, каталожный номер: 021
    49. .1 )
    50. KH 2 PO 4 (MP Biomedicals, каталожный номер: 02195453.1)
    51. 100% метанол (Fisher Scientific, Fisher Chemical TM , каталожный номер: A935-4)
    52. Ледяная уксусная кислота (Fisher Scientific, каталожный номер: A38-212)
    53. Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (ACROS ORGANICS, каталожный номер: 215740050)
    54. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Fisher Scientific, каталожный номер: 5312-500)
    55. Питательная среда для клеток MCF10A (см. рецепты)
    56. Среда для выращивания клеток Caki-1 (см. Рецепты)
    57. 10x PBS (см. Рецепты)
    58. 1x ПБС (см. Рецепты)
    59. 10x TBS (см. Рецепты)
    60. 1x ТБС (см. Рецепты)
    61. 1x ТБС 0.2% твин (см. рецепты)
    62. 1x Рабочий буфер SDS (см. Рецепты)
    63. 1x буфер переноса (см. рецепты)
    64. 2 М ДТТ (см. Рецепты)
    65. 5x Загрузка красителя (см. Рецепты)
    66. Блокирующий буфер (см. Рецепты)
    67. Буфер для первичных антител (см. Рецепты)
    68. Вторичный буфер антител (см. Рецепты)
    69. Кислотная стирка (см. Рецепты)
    70. 1 М Трис-HCl pH 8,0 (см. Рецепты)
    71. 1 М Трис-HCl рН 8.8 (см. Рецепты)
    72. 100 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (см. Рецепты)
    73. 100 мМ йодоуксусной кислоты (см. Рецепты)
    74. 100 мМ N-этилмалеимида (NEM) (см. Рецепты)
    75. 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) pH 8,0 (см. Рецепты)
    76. Буфер для лизиса дезоксихолата (см. Рецепты)
    77. Буфер для лизиса SDS (см. рецепты)

    Оборудование

    1. Магнитная мешалка (Corning, каталожный номер: 440936)
    2. Роторное колесо (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 88881001)
    3. Нагревательный блок (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 88870001)
    4. Орбитальный шейкер (Corning, каталожный номер: 6780-FP)
    5. Микроцентрифуга (Eppendorf, модель: 5424 R, каталожный номер: 5404000138)
    6. Центрифуга (Thermo Fisher Scientific, модель: Sorvall TM Legend T plus, каталожный номер: 75004367)
    7. Инкубатор (PHC, Panasonic, модель: MCO-170AICUVL-PA)
    8. Пипетки (5 мл; 10 мл, Fisher Scientific, FisherBrand TM , каталожные номера: 13-676-10C; 13-676-10F)
    9. Вытяжной шкаф для культур тканей (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер: 1333)
    10. Автоклав
    11. Система визуализации Odyssey Fc (LI-COR, номер модели: 2800)
    12. Световой микроскоп (Zeiss, модель: ID03)
    13. Ведерко со льдом
    14. Морозильная камера -20 °C (Fisher Scientific, каталожный номер: 13-986-148)
    15. Аппарат SDS PAGE и передаточный резервуар (Bio-Rad Laboratories, каталожный номер: 1658029fc)
    16. Лоток для переноса (12 ½» x 17 ½»)

    Программное обеспечение

    1. ЛИ-КОР Лайт (https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/download.html)
    2. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html)
    3. Microsoft Excel

    Процедура

    1. Дезоксихолатное фракционирование ФН в клетках MCF10A и Caki-1
      1. Линии клеток молочной железы MCF10A или раковые клетки почки Caki-1 следует поддерживать для достижения слияния не более 80-90% в колбе для тканевых культур T75 в инкубаторе с буферным раствором 5% CO 2 .См. Рисунок 1 для протокола быстрого запуска.
      2. После того, как клетки приблизительно на 80% сливаются в колбе, аспирируйте среду для культивирования клеток, промойте клетки один раз в 15 мл 1x PBS и аспирируйте перед добавлением 2-3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Поместите колбу в инкубатор с буферным раствором 5% CO 2 на 5–7 мин.
      3. Как только клетки будут успешно удалены из колбы, что можно проверить с помощью светового микроскопа, добавьте в колбу 3 мл питательной среды, чтобы нейтрализовать действие трипсина.
      4. Перенести 6 мл клеточной суспензии в коническую пробирку на 15 мл и центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
      5. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в питательной среде.
      6. Для покрытия в 6-луночных блюдах пластины клеток при слиянии, которое достигнет 80% в день эксперимента. Для клеток Caki-1 число посевов составляет 100 000 клеток/лунка, а для клеток MCF10A — 70 000 клеток/лунка. Клеток в одной лунке шестилуночного планшета достаточно для визуализации растворимых и нерастворимых в детергенте фракций FN для каждого экспериментального условия.
        Примечание. Плотность клеток 80 % обеспечивает достаточное количество растворимого и нерастворимого белка FN для количественного определения. Если плотность клеток является переменной в ваших экспериментальных условиях, плотность 80% является идеальной, поскольку клетки не слишком сливаются, чтобы запускать клеточные пути, которые могут мешать вашим экспериментальным показаниям.
      7. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO 2 .
      8. На следующий день проверьте, достигнута ли оптимальная плотность клеток.Если да, клетки могут быть обработаны для дезоксихолатного фракционирования FN.
        Примечание. Поскольку вся процедура фракционирования выполняется на льду, на данном этапе важно, чтобы у вас был холодный 1x PBS, холодный буфер для лизиса дезоксихолата (свежие добавленные ингибиторы) и холодный буфер для лизиса SDS (свежие добавленные ингибиторы). Обратитесь к разделу «Рецепты».
      9. Аспирируйте среду из лунок и поместите планшеты на лед в ведерко со льдом. Добавьте 10 мл 1x холодного PBS, чтобы удалить любые следы ростовой среды в клетках и полностью аспирируйте.Промойте снова 1x PBS, если вы видите следы носителя в лунке. На этом этапе важно убедиться, что весь PBS аспирирован, чтобы последующее добавление лизирующего буфера не было разбавлено.
      10. В каждую лунку добавьте 300 мкл холодного (4 ° C) буфера для лизиса дезоксихолата, содержащего ингибиторы, и немедленно соскребите клетки с помощью клеточного подъемника.
      11. Перенесите все клетки в буфере для лизиса в пробирку Эппендорфа и лизируйте с помощью иглы шприца 23 G не менее 20 раз.
      12. Поместите пробирки на роторное колесо в холодную комнату и дайте им вращаться в течение 30 мин. Скорость ротора не имеет решающего значения для лизиса. На этом этапе время лизиса может быть увеличено до 1 ч, что не повлияет на результаты (необязательно).
      13. Перенесите пробирки Эппендорфа в микроцентрифугу и центрифугу при 21 130 x g в течение 30 мин при 4 °C. Если микроцентрифуга имеет максимальную скорость 15871 x g , вы можете увеличить время центрифугирования до 45 мин.
      14. Проверьте, не заметите ли вы шарик размером с булавочную головку.Осадки обычно очень трудно увидеть, и иногда требуется второй цикл центрифугирования.
        Примечание. Также рекомендуется поместить пробирки Эппендорфа в микроцентрифугу и отметить на крышке пробирки место, где будет оседать осадок. Это облегчает понимание того, где искать гранулы.
      15. Перенесите супернатант в новую пробирку Эппендорф и пометьте ее как «растворимый ФН». Эта белковая фракция содержит растворимый в детергенте FN. К растворимой фракции FN добавьте 5-кратный краситель для загрузки SDS и храните в морозильной камере при -20 ° C, пока не будете готовы разрешить белки на геле.
      16. К осадку добавляют 20 мкл холодного буфера для лизиса SDS, содержащего ингибиторы, и смешивают осадок с буфером с помощью наконечника пипетки.
      17. Нагрейте осадок до 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин, чтобы осадок полностью смешался с буфером для лизиса SDS. Эта белковая фракция содержит дезоксихолат «нерастворимый ФН».
        Примечание. Нагревание осадка в течение 1 мин с буфером для лизиса SDS является необходимым шагом для полного ресуспендирования осадка.
      18. Добавьте 5x загрузочный краситель SDS, перемешайте и храните в морозильной камере -20 ° C.
      19. Перед загрузкой образцов «растворимого FN» и «нерастворимого FN» в гель SDS-PAGE образцы нагревают до 95 ° C в течение 5 минут и центрифугируют при 21 130 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.


        Рисунок 1. Блок-схема экстракции и разделения двух фракций FN


    2. Анализ биотинилирования для измерения рециклированного ФН в клетках MCF10A
      1. Клетки MCF10A высевают в тех же условиях и инкубируют в инкубаторе с 5% CO 2 , забуференным, как описано в процедуре A.
      2. Восстановите один флакон лиофилизированного FN-биотина с 10 мкл стерильной дистиллированной воды и оставьте пробирку на несколько минут при комнатной температуре, прежде чем постучать по пробирке несколько раз, чтобы перемешать. Концентрация запаса теперь будет 2 мг/мл.
      3. Добавьте 20 мкл исходного раствора к 2 мл бессывороточной среды, чтобы получить рабочую концентрацию среды FN-биотин 20 мкг/мл. Для приготовления 2 мл бессывороточной среды, содержащей рабочую концентрацию 20 мкг/мл FN-биотина, вам потребуется в общей сложности два флакона лиофилизированного FN-биотина.В наших руках снижение рабочей концентрации до 10 мкг/мл оказалось недостаточным для определения поглощения ФН клетками MCF10A с помощью иммуноблоттинга.
      4. Перед началом анализа биотинилирования клетки голодают в сыворотке в течение 2 часов. Голодание по сыворотке осуществляют путем аспирации питательной среды из клеток, промывания клеток два раза по 2 мл 1x PBS и добавления к клеткам бессывороточной среды.
      5. После 2 ч инкубации аспирируйте бессывороточную среду из клеток, промойте клетки в 6-луночных планшетах дважды по 2 мл 1x PBS, полностью аспирируйте PBS и добавьте к клеткам 500 мкл среды FN-биотин.
      6. Инкубируйте в течение 30 мин в инкубаторе 37 ° C.
      7. После инкубации аспирируйте среду FN-биотин, промойте 2 мл 1x PBS, аспирируйте и добавьте 1 мл кислотной промывки (см. Рецепты) в течение 30 сек. Этап кислотной промывки имеет решающее значение для удаления FN-биотина, связанного с клеточной поверхностью. Важно не превышать кислотную промывку более чем на 1 мин, поскольку она начинает влиять на морфологию клеток.
      8. Удалите кислотную промывку и промойте лунку четыре раза по 2 мл 1x PBS.
      9. Аспирируйте PBS и добавьте питательную среду к клеткам без FN-биотина и с тестируемыми соединениями или без них в зависимости от вашего экспериментального вопроса.Поскольку нам было интересно выяснить, увеличивают ли TGFβ1 и TGFβ2 фибриллогенез FN посредством рециркуляции, у нас были контрольные условия только с питательной средой, питательной средой, содержащей 10 нг/мл TGFβ1, и питательной средой, содержащей 10 нг/мл TGFβ2 (Varadaraj et al. ). , 2017).
      10. Чтобы определить, рециркулируется ли FN с образованием фибрилл, выполните фракционирование дезоксихолата, как описано в процедуре A, шаги 8-17, используя 300 мкл буфера для лизиса дезоксихолата на лунку.
    3. Разложение белка FN на 5% геле и иммуноблоттинг
      1. Запустите растворимые лизаты и гранулы на 5% геле SDS-PAGE.
      2. Загружают 1/10 th от общего объема растворимой фракции и всего объема гранулированной фракции. Если вы загружаете 1/10 th , сохраняйте громкость постоянной для всех экспериментальных условий.
      3. Дайте гелю работать до тех пор, пока в геле не останутся только две верхние лестницы белковой лестницы -250 кДа и 150 кДа. Прогон геля обычно занимает 3-4 часа при 80 В.
      4. После завершения цикла перенесите гель с помощью мембран из нитроцеллюлозы или ПВДФ при 25 В на ночь (12–16 ч) в холодную комнату.В качестве альтернативы передаточный резервуар можно поместить в ведерко со льдом во время процедуры переноса.
      5. После завершения переноса поместите мембрану в коробку для иммуноблоттинга и добавьте 5 мл блокирующего буфера (достаточный объем, чтобы покрыть мембрану) на 1 ч при комнатной температуре и поместите на орбитальный шейкер со скоростью 55 об/мин.
      6. После блокировки удалите блокирующий раствор и промойте мембрану 2-3 раза 1x TBS при осторожном перемешивании. Убедитесь, что все следы молока покинули мембрану.Промывайте до тех пор, пока смывы TBS не станут прозрачными.
      7. Добавьте антитело FN в разбавлении 1: 1000 в первичном буфере антител и дайте мембране инкубироваться в течение ночи на орбитальном шейкере со скоростью 55 об / мин при 4 ° C.
      8. После первичной инкубации антител промойте три раза, поместив мембрану на орбитальный шейкер со скоростью 55 об/мин в течение 5 мин в 10 мл 1x TBS 0,2% Tween.
      9. Добавьте вторичное антитело IR Dye 800CW в разведении 1 мкл в 15 мл буфера вторичного антитела на 1 ч на орбитальном шейкере со скоростью 55 об/мин.Важно защитить мембрану от света. Если коробки для иммуноблотов прозрачные, накройте коробку алюминиевой фольгой на протяжении всей инкубации и последующих этапов промывки.
      10. Чтобы визуализировать FN-биотин, выполните шаги C1-C6, после чего добавьте вторичное антитело, конъюгированное со стрептавидином IR Dye, в разведении 1 мкл в 15 мл буфера вторичного антитела в течение 1 ч на орбитальном шейкере, установленном на скорости 55 об / мин. Важно защитить мембрану от света. Если коробки для иммуноблотов прозрачные, накройте коробку алюминиевой фольгой на протяжении всей инкубации и последующих этапов промывки.
      11. После инкубации антител промойте три раза, поместив мембрану на орбитальный шейкер со скоростью 55 об/мин в течение 5 мин в 10 мл 1x TBS 0,2% Tween.
      12. Удалите 1x TBS 0,2% Tween и замените 10 мл 1x TBS перед визуализацией на сканере LI-COR.
      13. Изображение сканирования мембраны появится, как показано на рисунке 2A.
      14. Чтобы исследовать контрольный белок загрузки, запустите 1/10 th растворимых фракций FN на 10% геле и выполните иммуноблоттинг для GAPDH (рис. 2B) или актина.Первичные антитела к актину и GAPDH используются в разведении 1 мкл в 5 мл (1 мкг/5 мл) и могут быть использованы повторно несколько раз, если разведенное антитело хранится при 4 °C.
        Примечание. Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, также можно использовать и обрабатывать с помощью метода обнаружения ECL. В этом случае вам понадобятся вторичные антитела к стрептавидину, конъюгированные с HRP.


        Рисунок 2. Фракционирование фибронектина и анализ методом иммуноблоттинга . Для визуализации и количественного определения растворимого и гранулированного FN загрузите 1/10 th растворимых фракций и всех гранул из клеток Caki-1 на 5% гель SDS-PAGE, как показано на (A).Полоса выше лестницы с молекулярной массой 250 кДа представляет собой FN. UN, 1, 2 и 3 относятся к «необработанному» и трем различным состояниям лечения (B). Чтобы нормализовать белковую загрузку, загрузите 1/10 th растворимого FN на 10% гель SDS-PAGE и выполните иммуноблоттинг для GAPDH. Интенсивность пикселей белковых полос определяют количественно с помощью программного обеспечения LI-COR Lite путем рисования прямоугольника (синего прямоугольника) вокруг полосы. Нижнее значение обозначает интенсивность полосы с поправкой на фон, а верхнее значение обозначает фон.

    Анализ данных

    Как правило, экстракты дезоксихолата и анализы биотинилирования тестируются независимо не менее трех раз для получения статистически значимых результатов.Для количественного определения FN, который находится в фибриллах (фракция гранул), по сравнению с фракцией нефибрилл (растворимых FN), необходимы иммуноблоты разрешенных FN и GAPDH. Следуйте приведенным ниже пошаговым пунктам, чтобы выполнить анализ данных образцов.

    1. Используя программное обеспечение LI-COR Lite, определите количество всех белковых полос по отдельности и экспортируйте в таблицу Excel.
    2. Если экспериментальный вопрос состоит в том, чтобы проверить, увеличивается ли фибрилла FN при лечении, рассчитайте интенсивность пикселей растворимого FN до соответствующих уровней GAPDH или актина.
    3. После нормализации растворимых уровней FN рассчитайте отношение интенсивности пикселей гранулы FN к нормализованным уровням растворимого FN. На фигуре 2A растворимый FN в UN (необработанном) и условиях лечения 1, 2 и 3 нормализован к GAPDH в UN, 1, 2 и 3 соответственно.
    4. Рассчитайте интенсивность пикселей для гранул FN в UN, 1, 2 и 3.
    5. Наконец, рассчитайте отношения для гранулы UN FN по сравнению с нормализованным растворимым FN для UN, для гранулы FN образца 1 и нормализованным растворимым FN для образца 1 и т.д.
    6. Чтобы представить проанализированные данные в виде цифры в публикации, преобразуйте отношения в кратную разницу/относительную разницу, создайте гистограмму кратной разницы между необработанными и обработанными образцами, при этом образец неравномерного образования равен «1», рассчитайте стандартную стандартную ошибку и выполните соответствующую статистику. (См. рис. 4E в Varadaraj et al. , 2017).

    Если данные ясно демонстрируют, что FN пеллет увеличивается при обработке X, вполне вероятно, что FN как растворимых, так и пеллетных увеличивается, и в этом случае вы можете ошибочно сделать вывод, что увеличивается только FN пеллет.Чтобы проверить, так ли это, необходимо провести тот же эксперимент, но извлечь общий белок вместо фракций дезоксихолата. Если общие уровни ФН остаются одинаковыми между обработками, то можно сделать вывод, что в зависимости от обработки меняются только фракции фибрилл. В качестве альтернативы, если общий белок ФН увеличивается при лечении, то увеличение ФН пеллет может быть связано с увеличением общего белка, а не с конкретной разницей во фракции ФН пеллет между обработками.Наше исследование (см. Рисунок 1C в Varadaraj et al. , 2017) показало, что TGFβ1 и TGFβ2 увеличивают фракцию фибрилл FN, мы измерили общие уровни FN в параллельных экспериментах с экспериментами по фракционированию, чтобы подтвердить, что фракция фибрилл FN увеличивалась при лечении.

    Рецепты

    1. Питательная среда для клеток MCF10A
      1. К 500 мл среды DMEM/F12:
        Добавьте 25 мл лошадиной сыворотки, 1,25 мл инсулина из исходного раствора инсулина с концентрацией 4 мг/мл, 350 мкл холерного токсина из исходного раствора с концентрацией 150 мкг/мл, 215 мкл EGF из исходного раствора с концентрацией 50 мкг. /мл стока и 500 мкл гидрокортизона из 500 мкг/мл стока
      2. Чтобы приготовить исходный раствор холерного токсина:
        Растворите 2 мг холерного токсина в 13.3 мл DMEM/F12 (без добавок) и хранить в виде аликвот по 350 мкл в морозильной камере при температуре -20 °C. Мы использовали аликвоты холерного токсина, которые хранились не более 6 месяцев.
      3. Для приготовления исходного раствора EGF:
        Растворите 1 мг лиофилизированного EGF в 20 мл стерильного раствора dH 2 O и храните аликвоты по 215 мкл в морозильной камере при -20 °C.
      4. Для приготовления исходного раствора гидрокортизона:
        Растворите 50 мг гидрокортизона в 100 мл этанола пробы 200 и храните аликвоты по 10 мл в морозильной камере при температуре -20 °C.
    2. Среда для выращивания клеток Caki-1
      К 500 мл среды McCoy’s 5A добавить 50 мл FBS и 5 мл пенициллин-стрептомицина (необязательно)

    Примечание: *Эти буферы можно хранить при комнатной температуре.

    1. 10x PBS (1 л) *
      Взвесить 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4 , 2,4 г KH 2 PO 4 и добавить 500 мл стерильного dH 2 pH с помощью HCl до pH от 7,2 до 7,4
      Доведите конечный объем до 1 л, используя стерильный dH 2 O
    2. 1x PBS (1 л) *
      Развести 100 мл 10x PBS с 900 мл стерильного dH 2 O
      10x TBS (1 л) *
      1. Взвесьте 87,66 г NaCl, 12,11 г трис-основания и добавьте 500 мл стерильного раствора dH 2 O
      2. Отрегулируйте pH с помощью HCl до pH 8.0 и доведите окончательный объем до 1 л, используя стерильный dH 2 O
    3. 1x TBS (1 л) *
      Развести 1 часть 10x TBS с 9 частями стерильного dH 2 O
    4. 1x TBS 0,2% Tween (1 л) *
      Добавьте 2 мл Tween 20 в 1x TBS
    5. 1 буфер SDS (10 л) *
      1. Добавьте 303 г Tris Base, 1440 г глицина и 100 г SDS.
      2. Доведите общий объем до 10 л, используя стерильный dH 2 O
    6. 1 буфер для переноса (1 л)
      Добавить 1.86 г глицина, 3,02 г трис-основания, 150 мл 100% метанола и довести до общего объема 1 л с помощью dH 2 O
      Примечание. Буфер для переноса можно хранить при 4 °C.
    7. 2 M DTT
      Взвесить 3,08 г DTT (FW 154.25) в 10 мл стерильного dH 2 O
      Аликвоты и хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
    8. 5x Загрузка красителя
      1. Чтобы сделать общий объем 100 мл загрузочного красителя:
        1. Добавьте в химический стакан 50 мл глицерина, 10 г SDS, 33 мл 1 М Трис pH 6.8 и 17 мл воды
        2. Позвольте раствору смешаться, поместив его на магнитную мешалку, установленную на 37 ° C, для полного растворения SDS.
        3. Возьмите небольшое количество порошка бромфенолового синего с помощью наконечника пипетки и смешайте с раствором.
      2. К 90 мл этого раствора добавляют 10 мл 2 М ДТТ.
      3. Хранить в виде аликвот по 2 мл в морозильной камере при температуре -20 °C.
    9. Блокирующий буфер
      Весит 0.25 г сухого обезжиренного молока и растворить в 1x TBS
      Приготовить 10 мл свежего молока для каждого использования
    10. Буфер для первичных антител
      Взвесить 0,05 г BSA и растворить в 1x TBS
      Приготовить 10 мл свежих для каждого использования
    11. Буфер для вторичных антител
      Взвесить 0,05 г BSA и растворить в 1x TBS 0,2% Tween
      Приготовить 10 мл свежих для каждого использования
    12. Кислотная промывка
      Взвесить 14,6 г NaCl и добавить 2,5 мл ледяной уксусной кислоты
      Разбавить стерильным dH 2 O до 500 мл и хранить при комнатной температуре
    13. 1 М Трис-HCl рН 8.0 (1 л) *
      1. Взвесьте 157,6 г трис-HCl соли и растворите в 900 мл стерильного раствора dH 2 O.
      2. После того, как соль растворится, доведите pH с помощью NaOH до pH 8,0 и добавьте воды до общего объема 1 л.
    14. 1 М трис-HCl pH 8,8 (1 л) *
      1. Взвесьте 157,6 г трис-HCl соли и растворите в 900 мл стерильного раствора dH 2 O.
      2. После того, как соль растворится, отрегулируйте pH с помощью NaOH до pH 8,8 и добавьте воды до общего объема 1 л.
    15. 100 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF)
      Масса 0.174 г в 10 мл этанола для получения 100 мМ маточного раствора (FW 174.2)
      Аликвота и хранение в морозильной камере при температуре -20 °C
    16. 100 мМ йодоуксусной кислоты
      Взвесить 0,185 г в 10 мл стерильной dH 2 O для получения 100 мМ маточного раствора (FW 185.95)
      Аликвотировать и хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
    17. 100 мМ N-этилмалеимида (NEM)
      Взвесить 0,125 г в 10 мл этанола, чтобы получить 100 мМ исходный раствор (FW 125.13)
      Аликвоты и хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
    18. 0.5 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) pH 8,0 (FW 292.24) (0,5 л) *
      1. Взвесьте 73,06 г и добавьте 400 мл стерильного раствора dH 2 O
      2. Дайте соли раствориться и доведите рН до 8,0.
      3. Добавить воду до конечного объема 500 мл.
    19. Буфер для лизиса дезоксихолата (0,1 л)
      2% дезоксихолат натрия
      0,02 М трис-HCl pH 8,8
      2 мМ ФМСФ
      2 мМ ЭДТА
      2 мМ йодоуксусная кислота
      2 мМ N-этилмалемид
      1. Для приготовления 100 мл буфера:
        Добавьте 2 г соли дезоксихолата натрия, 2 мл 1 М трис-HCl, pH 8.8 и остающийся стерильным dH 2 O до общего объема 100 мл
        Примечание: этот буфер можно хранить в холодильнике не более 3 месяцев.
      2. Чтобы приготовить 10 мл этого буфера с ингибиторами:
        Добавьте 20 мкл исходного раствора 100 мМ PMSF, 40 мкл исходного раствора 0,5 М ЭДТА, 20 мкл йодоуксусной кислоты из исходного раствора 100 мМ и 20 мкл NEM из исходного раствора 100 мМ
        Примечание. следует добавлять перед использованием в конечных концентрациях 2 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0, 2 мМ йодоуксусной кислоты и 2 мМ NEM.
    20. Буфер для лизиса SDS (0,1 л) *
      1. Для приготовления 100 мл буфера:
        Добавьте 1 г SDS и 2,5 мл 1 М трис-HCl pH 8,0 и воду до 100 мл.
      2. Для 10 мл буфера для лизиса SDS:
        Добавьте 20 мкл 100 мМ исходного раствора PMSF, 40 мкл 0,5 М исходного раствора ЭДТА, 20 мкл йодоуксусной кислоты из 100 мМ исходного раствора и 20 мкл NEM из 100 мМ исходного раствора
        Примечание. добавляют перед использованием в конечных концентрациях 2 мМ PMSF, 2 мМ EDTA, pH 8.0,2 мМ йодоуксусной кислоты и 2 мМ NEM.

    Благодарности

    Исследование, о котором сообщается в этой публикации, частично финансировалось Национальным институтом здоровья меньшинств и различий в состоянии здоровья при Национальном институте здравоохранения (номер премии U54MD012388) и Национальным институтом рака при Национальном институте здравоохранения (номер награды за Партнерство коренных американцев по профилактике рака U54CA143924). (UACC) и U54CA143925 (NAU) для AV и Национальных институтов здравоохранения предоставляют P20 GM109091 для K.М. Мы также хотели бы отметить работу Джин Шварцбауэр (Принстонский университет) и Дональдсона, Дж. Г. (Национальный институт здравоохранения), которые помогли разработать протоколы для наших исследований.

    Конкурирующие интересы

    Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов или конкурирующих интересов.

    использованная литература

    1. Арьонен, А., Аланко Дж., Вельтел С. и Иваска Дж. (2012). Различная рециркуляция активных и неактивных интегринов β1. Traffic 13(4): 610-625.
    2. Касуэлл, П.Т., Чан, М., Линдсей, А.Дж., МакКэффри, М.В., Боеттигер, Д. и Норман, Дж.К. (2008). Rab-связывающий белок координирует рециркуляцию интегрина α5β1 и EGFR1, чтобы способствовать миграции клеток в трехмерном микроокружении. J Cell Biol 183(1): 143-155.
    3. Гао Б., Кертис Т. М., Блюменсток Ф. А., Миннеар Ф.Л. и Саба, Т.М. (2000). Повышенная рециркуляция интегринов α5β1 эндотелиальными клетками легких в ответ на фактор некроза опухоли. J Cell Sci 113 Pt 2: 247-257.
    4. Хоффман, М.А., Ох, М., Ян, Х., Клко, Дж.М., Иван, М. и Кэлин, В.Г., младший (2001). Мутанты белка фон Хиппеля-Линдау, связанные с заболеванием VHL типа 2C, сохраняют способность подавлять HIF. Hum Mol Genet 10(10): 1019-1027.
    5. Мао, Ю. и Шварцбауэр, Дж. Э. (2005). Фибронектиновый фибриллогенез, клеточно-опосредованный процесс сборки матрикса. Matrix Biol 24(6): 389-399.
    6. Мимура Ю., Ин Х., Джиннин М., Асано Ю., Ямане К. и Тамаки К. (2004). Эпидермальный фактор роста индуцирует экспрессию фибронектина в дермальных фибробластах человека через сигнальный путь протеинкиназы С-дельта. J Invest Dermatol 122(6): 1390-1398.
    7. Ох, М., Яух, Р.Л., Лонерган, К.М., Уэйли, Дж.М., Стеммер-Рахамимов, А.О., Луис, Д.Н., Гэвин, Б.Дж., Клей, Н., Кэлин, В.Г., младший и Илиопулос, О. (1998) .Белок-супрессор опухоли фон Хиппеля-Линдау необходим для правильной сборки внеклеточного матрикса фибронектина. Мол Ячейка 1(7): 959-968.
    8. Панков Р., Цукьерман Э., Кац Б.З., Мацумото К., Лин Д.К., Лин С., Хан С. и Ямада К.М. (2000). Динамика интегрина и сборка матрикса: тензин-зависимая транслокация интегринов α5β1 способствует раннему фибриллогенезу фибронектина. J Cell Biol 148(5): 1075-1090.
    9. Паскуалини, Р., Bourdoulous, S., Koivunen, E., Woods, V.L., Jr. и Ruoslahti, E. (1996). Полимерная форма фибронектина обладает антиметастатическим действием против многих типов опухолей. Nat Med 2(11): 1197-1203.
    10. Робертс М., Барри С., Вудс А., ван дер Слуйс П. и Норман Дж. (2001). PDGF-регулируемая rab4-зависимая рециркуляция интегрина αvβ3 из ранних эндосом необходима для адгезии и распространения клеток. Curr Biol 11(18): 1392-1402.
    11. Стикл, Н.H., Chung, J., Klco, J.M., Hill, R.P., Kaelin, W.G., Jr. и Ohh, M. (2004). Модификация pVHL с помощью NEDD8 необходима для сборки матрикса фибронектина и подавления развития опухоли. Mol Cell Biol 24(8): 3251-3261.
    12. Тан, Ч. Х., Ян, Р. С., Чен, Ю. Ф. и Фу, В. М. (2007). Основной фактор роста фибробластов стимулирует экспрессию фибронектина через фосфолипазу Cγ, протеинкиназу Cα, c-Src, NF-κB и путь p300 в остеобластах. J Cell Physiol 211(1): 45-55.
    13. Уитто, Дж., Олсен, Д.Р. и Фацио, М.Дж. (1989). Внеклеточный матрикс кожи: 50 лет прогресса. J Invest Dermatol 92(4 Suppl): 61S-77S.
    14. Варадарадж, А., Дженкинс, Л.М., Сингх, П., Чанда, А., Снайдер, Дж., Ли, Нью-Йорк, Амсалем-Зафран, А.Р., Эрлих, М., Хенис, Ю.И. и Митрейе, К. (2017) . TGF-β запускает быстрый фибриллогенез посредством нового TbetaRII-зависимого механизма доставки фибронектина. Mol Biol Cell 28(9): 1195-1207.
    15. Уайт, Д. П., Касвелл, П. Т. и Норман, Дж. К. (2007). Пути рециркуляции αvβ3 и α5β1 интегрина диктуют передачу сигналов Rho киназы ниже по течению, чтобы регулировать постоянную миграцию клеток. J Cell Biol 177(3): 515-525.
    16. Ян, Дж. Т. и Хайнс, Р. О. (1996). Функции рецептора фибронектина в эмбриональных клетках с дефицитом интегрина альфа 5 бета 1 могут быть заменены интегринами альфа V. Mol Biol Cell 7(11): 1737-1748.
    17. Йи, М. и Руослахти, Э.(2001). Фрагмент фибронектина ингибирует рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. Proc Natl Acad Sci USA 98(2): 620-624.
    18. Ёкои Х., Мукояма М., Сугавара А., Мори К., Нагаэ Т., Макино Х., Суганами Т., Яхата К., Фуджинага Ю., Танака И. и Накао, К. (2002). Роль фактора роста соединительной ткани в экспрессии фибронектина и тубулоинтерстициальном фиброзе. Am J Physiol Renal Physiol 282(5): F933-942.
    Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь для просмотра полного текста

    Посмотреть полный текст

    Скачать PDF

    вопросы и ответы

    Авторские права:  © 2018 Авторы; эксклюзивный лицензиат ООО «Био-протокол».

    Как цитировать:  Варадарадж, А., Магдалено, К. и Митрейе, К. (2018). Дезоксихолатное фракционирование фибронектина (ФН) и анализ биотинилирования для измерения рециклированных фибрилл ФН в эпителиальных клетках. Биопротокол 8(16): e2972. DOI: 10.21769/BioProtoc.2972.

    Смесь фибронектина, образующая новую полимерную матрицу — Penn State

    @article{4111cd4808f5451fb1f017644bc1fb64,

    title = «Выделение полученного из плазмы фибриногена γγ{\textquoteright}: смесь фибронектина, образующая новую полимерную матрицу04»,

    abstract = «Фронектин плазмы человека (FN) повышает прочность полимера фибрина и обычно присутствует в количестве <5% в фибриногенных (FI) хирургических тканевых герметиках.Мы описываем процесс очистки для получения смеси γγ{\textquoterright} фибриногена (γγ{\textquoterright}FI) и FN примерно с теми же уровнями массовой концентрации, что и в плазме. Преципитация сульфатом аммония и DEAE-хроматография криопреципитата плазмы, обработанного растворителем-детергентом, селективно концентрировали γγ{\textquoterright}FI и FN, эффективно удаляя компонент γγFI из FI. Взаимодействие между γγ {\ textquoteright} FI и FN наблюдали с помощью эксклюзионной хроматографии высокого давления (HPSEC) и динамического рассеяния света (DLS).Прочный фибриновый матрикс был сформирован при обработке смесью рекомбинантного тромбина (rFIIa) и рекомбинантного фактора XIII (rFXIII). Фибрин γγ{\textquoteright}FI и FN имел асимптотическую прочность модуля упругости при сдвиге, наблюдаемую с помощью тромбоэластографии (ТЭГ), 16 кдин/см2 по сравнению с 9 кдин/см2, полученную для γγFI и FN. Конфокальная микроскопия показала, что фибриновая матрица γγ{\textquoterright}FI:FN имеет новую структуру: волокна γγ{\textquoterright}FI периодически обертываются агрегатами FN. Эти исследования обеспечивают метод получения прочной фибриновой матрицы, полученной из плазмы, имеющей всего 9 мг / мл общего белка γγ FI, FN при полимеризации при высоких уровнях активности rFIIa и rFXIII.",

    автор = «Исмаил, {Айман Э.А.} и Фабиан, {Фрэнк М.}, и Оу Ван, и Югуо Лей, и Карлсон, {Марк А.}, и Берджесс, {Уилсон Х.}, и Веландер, {Уильям Х. }»,

    note = «Информация о финансировании: эта работа была частично поддержана Исследовательским центром телемедицины и передовых технологий армии США для MAC [номер гранта W81XWH-11-1-0836]. Мы благодарны за вклад в анализ rFXIII, сделанный Николасом Вандерслайсом. Авторские права издателя: {\textcopyright} 2018 Elsevier Ltd»,

    год = «2018»,

    месяц = ​​декабрь,

    doi = «10.1016/j.procbio.2018.09.013»,

    language = «English (US)»,

    volume = «75»,

    pages = «257—265»,

    journal = «Process Biochemistry»,

    isn = «1359-5113»,

    издатель = «Elsevier BV»,

    }

    Frontiers Болезнь Паркинсона: биомаркеры, лечение и факторы риска

    Введение

    Болезнь Паркинсона — второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей гибелью дофаминергических нейронов в компактной части ЧС.При БП существует длительный латентный период между первым повреждением клеток в ядрах нервной системы, подверженных риску, и появлением клинических симптомов. Симптомы и признаки БП обычно не развиваются до тех пор, пока не потеряно 70–80% дофаминергических нейронов (El-Agnaf et al., 2006). Таким образом, выявление пациентов в период между предполагаемым началом потери дофаминергических клеток и появлением клинического паркинсонизма может иметь большое значение для разработки эффективных стратегий нейропротекторного лечения (Berendse et al., 2001). Окрашивание LBs, патологического признака БП, для выявления пораженных нейронов по всей нервной системе выявило шесть невропатологических стадий этого заболевания на основе локализации вовлеченных областей мозга (Braak et al., 2003). Исследование образцов головного мозга сотен пациентов с БП показало, что патологический процесс был относительно однородным. Патология на первой стадии начинается в нижних отделах продолговатого мозга, в частности, в дорсальном двигательном ядре блуждающего нерва и передних обонятельных структурах.На 2-й стадии поражение дорсального двигательного ядра ухудшается, в нижних ядрах шва развиваются включения, а в голубом пятне можно наблюдать нейриты Леви. На третьей стадии поражается SN. На четвертой стадии поражения появляются в коре, особенно в височной мезокортексе. На пятой стадии патология появляется в прилежащих височных полях неокортекса, а на шестой стадии отчетливо видно вовлечение коры. Важно отметить, что когнитивный статус коррелирует с нейропатологической стадией (Braak et al., 2003). Также важно найти надежные молекулярные биомаркеры, которые могут отличать болезнь Паркинсона от других состояний, отслеживать ее прогрессирование или указывать на положительный ответ на терапевтическое вмешательство (Siderowf et al., 2018). Предполагается, что агрегаты α-синуклеина (α-Syn) вредны для дофаминергических нейронов в ЧС, и их образование может запускать передачу токсического α-сина от пораженных клеток к другим соседним клеткам, что приводит к каскаду образования LB и, впоследствии гибель клеток (Angot and Brundin, 2009; Steiner et al., 2018). Это способствует дальнейшей дофаминергической потере клеток, вызванной распространением патогенных форм α-син на соседние клетки (Luk et al., 2012). Передача α-сина между клетками может быть нормальным путем. Однако в условиях стресса агрегация α-сина может инициироваться в принимающих клетках, где предварительно агрегированный α-син действует как «затравка», вызывая большую агрегацию растворимого α-сина «прионоподобным» образом. (Бернис и др., 2015). Кроме того, поскольку агрегаты α-син обычно очищаются протеасомной системой или лизосомами, любой дефект в механизмах клиренса может вызвать распространение патологии БП, поскольку непереваренный токсичный α-син передается другим клеткам.В соответствии с этой концепцией лизосомальное ингибирование увеличивает количество нерастворимого α-сина, что приводит к повышенному высвобождению экзосом, содержащих токсичный α-син (Luk et al., 2012). В здоровых нейронах нежелательные белки выводятся экзосомным путем, что объясняет, почему α-син может высвобождаться из нейронов в нормальных условиях, в то время как любая клеточная или экологическая проблема, которая приводит к более высокой секреции α-сина, может быть вредной для нейронов и может быть передается в другие соседние ячейки. Существует гипотеза, что накопление α-син у больных БП начинается в энтеральной нервной системе, то есть в нервах верхних отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).α-Syn, продуцируемый в желудочно-кишечном тракте, распространяется через блуждающий нерв в мозг, что свидетельствует о значительной роли оси кишечник-мозг в развитии БП (Liddle, 2018). Таким образом, мониторинг возникновения БП, диагностика ранней стадии этого заболевания, возможность отличить его от других паркинсонических синдромов, мониторинг его ответа на лечение и прогрессирования требуют выявления надежных биомаркеров. После многих лет болезни болезнь Паркинсона может в конечном итоге развиться в болезнь Паркинсона. Методы диагностики и различия между PD, PDD и DLB описаны в недавнем всестороннем обзоре (McKeith et al., 2017)

    Нейрохимические биомаркеры

    Орексин

    Орексин, также известный как гипокретин, представляет собой нейропептидный гормон, экспрессируемый небольшим количеством нейронов дорсолатерального гипоталамуса. Орексин секретируется латеральными и задними нейронами гипоталамуса. Гормон регулирует многие физиологические функции, такие как цикл сна-бодрствования (Hagan et al., 1999), сердечно-сосудистые реакции, частоту сердечных сокращений и артериальную гипертензию (Imperatore et al., 2017). Пациенты с БП обычно страдают нарколепсией из-за потери гипокретиновых нейронов в гипоталамусе.Концентрация орексина А у больных БП ниже, чем у здоровых людей, а уровень орексина связан с тяжестью заболевания. Чем тяжелее заболевание, тем выше потеря гипокретиновых нейронов и ниже уровень орексина в спинномозговой жидкости (Fronczek et al., 2007). На поздних стадиях БП снижение уровня орексина может быть причиной дневной сонливости (Wienecke et al., 2012). При нарколепсии у пациентов с БП повышенный уровень глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в спинномозговой жидкости, по-видимому, является причиной снижения уровня орексина (Takahashi et al., 2015), указывая на GFAP как на еще один потенциальный биомаркер. GFAP представляет собой белок промежуточных филаментов цитоскелета, который экспрессируется в основном в астроцитах. Гипофосфорилирование и сверхэкспрессия GFAP часто встречаются у пациентов с БП, что позволяет предположить, что эти изменения в астроцитах связаны с патогенезом БП (Clairembault et al., 2014). Астроциты могут быть вовлечены в прогрессирование БП за счет продукции провоспалительных цитокинов, которые повреждают дофаминергические нейроны (Rappold and Tieu, 2010).Следовательно, БП можно идентифицировать по повышенному уровню GFAP в качестве астроглиального маркера.

    8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин

    Активные формы кислорода (АФК) (такие как O 2 -, H 2 O 2 и⋅OH) могут повреждать биологические молекулы в основном посредством необратимых реакций, вызывающих дегенеративные процессы, связанные со старением. Одним из повреждений ДНК, вызванных АФК, является окисленная форма 8-гидроксигуанина (8-OHG), известная как 8-OHdG, которую можно использовать в качестве биомаркера повреждения ДНК (Shigenaga et al., 1989). Точно так же у пациентов с БП было измерено повышение уровня 8-OHdG в сыворотке по сравнению со здоровыми людьми. Уровни 8-OHdG в спинномозговой жидкости также выше у пациентов с БП, чем в нормальных случаях, но разница не так значительна, как уровни в сыворотке. Следовательно, 8-OHdG может быть разработан в качестве потенциального биомаркера БП (Kikuchi et al., 2002). На крысиной модели было показано, что стадия БП напрямую связана с уровнем 8-OHdG в моче, что позволяет предположить, что его можно использовать в качестве биомаркера тяжести болезни Паркинсона (Kikuchi et al., 2011). Однако следует помнить, что 8-OHdG является маркером окислительного повреждения ДНК, но не прогрессирования БП, поэтому его специфичность ограничена (Simon et al., 2015).

    Периферические протеасомы и активность каспаз

    Протеасомы представляют собой крупные белковые комплексы, ответственные за деградацию и элиминацию нежелательных и неправильно уложенных белков, и поэтому они важны для выживания клеток. Поврежденные белки, которые помечены молекулами убиквитина с помощью убиквитинлигазы, запускают АТФ-зависимую протеолитическую активность протеасомы (Lodish et al., 2004). При БП накопление белков в нейронах приводит к образованию патологических внутриклеточных включений, называемых LB. Дисфункция протеасом может быть вовлечена в формирование белковых агрегатов и ассоциирована с LBs (Bentea et al., 2017). При БП мутации, нарушающие активность протеасом, могут приводить к накоплению агрегированного α-сина (Shadrina et al., 2010; Ciechanover, Kwon, 2015). В некоторых случаях болезни Паркинсона дефицит митохондрий вызывает продукцию большего количества АФК и более высокое окисление α-синов, что приводит к увеличению АТФ-независимой протеасомной активности и более высокой олигомеризации α-синов.Истощение уровня АТФ в этом случае ингибирует протеасому 26S, но комплекс 20S остается активным и разрушает окисленный α-син (Martins-Branco et al., 2012). При прогрессирующей БП тяжесть и продолжительность БП коррелируют со сниженной активностью протеасомы 20S и повышенной активностью каспазы 3. Активация каспазы и, таким образом, инициация апоптоза является основной причиной снижения активности протеасомы 20S. Следовательно, эти компоненты протеасомы и каспазы также могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры БП (Blandini et al., 2006).

    Дофамин, активность дофаминовых рецепторов и транспортеров дофамина

    Катехоламиновый нейротрансмиттер дофамин секретируется ЧС, гипоталамусом и некоторыми другими областями мозга. TH синтезирует предшественник дофамина ( L -DOPA), который превращается в дофамин с помощью L -декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC). В головном мозге дофамин используется в качестве предшественника норадреналина (норэпинефрина) и адреналина (эпинефрина). Потеря дофаминергических нейронов в среднем мозге и ЧН головного мозга при БП приводит к снижению уровня дофамина (Obeso et al., 2008). Транспортер дофамина (DAT) контролирует уровень дофамина, облегчая его обратный захват обратно в цитозоль. Однако свободный дофамин токсичен для нейронов, так как при его окислении образуются ядовитые реактивные хиноны. Следовательно, везикулярный переносчик моноаминов 2 (VMAT2) хранит избыток дофамина в везикулах. Таким образом, любое изменение уровня дофамина или ДАТ может быть индикатором БП. Более того, дофамин активирует пять типов рецепторов (D1R-D5R), а тяжесть болезни Паркинсона связана со снижением экспрессии рецептора дофамина 3-го типа (D3R), что приводит к более тяжелым симптомам из-за снижения сигналов дофамина (Nagai et al., 1996). Следовательно, D3R также можно рассматривать как потенциальный биомаркер БП (Caronti et al., 2001).

    Недавние исследования указывают на 3-метокси-4-гидроксифенилгликоль (MHPG) как на ценный биомаркер для различения нескольких форм нейродегенеративных заболеваний. Этот биогенный амин и метаболит норадреналина проходят ГЭБ, и анализ его уровня в сыворотке и спинномозговой жидкости может быть полезен для определения когнитивной стадии при БП, отличия БП от контроля без БП, DLB по сравнению с AD и т. д. (Vermeiren and De Deyn, 2017). ван дер Зее и др., 2018). Этот метод перспективен, так как голубое пятно поражается α-син на более ранней стадии, чем ЧС.

    В другой недавней статье доклиническая фаза болезни Паркинсона идентифицируется путем анализа метаболитов дофамина в спинномозговой жидкости. Низкие концентрации 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и ДОФА в ЦСЖ позволяют выявить доклиническую БП у здоровых людей из группы риска (Goldstein et al., 2018).

    Катехоламиновые нейроны немногочисленны в нервной системе, и их уязвимость при БП и родственных заболеваниях (Goldstein et al., 2018) не объясняется. Концепция аутотоксичности предполагает внутреннюю цитотоксичность катехоламинов в клетках, в которых они продуцируются. Согласно недавней теории, БП может развиваться, когда 3,4-дигидроксифенилацетальдегид (ДОФАЛ) олигомеризуется и агрегирует α-син, что обеспечивает связь между синуклеинопатией и потерей катехоламиновых нейронов при ДТЛ (Goldstein et al., 2018).

    Согласно «катехолальдегидной гипотезе» патогенеза БП, длительное повышенное накопление ДОФАЛА, катехолальдегидного метаболита дофамина, вызывает или способствует возможной гибели дофаминергических нейронов.LBs, невропатологический признак PD, содержат преципитированные α-syn. Основания для тенденции α-син осаждаться в цитоплазме катехоламинергических нейронов также загадочны. Поскольку DOPAL сильно олигомеризует и агрегирует α-син, катехолальдегидная гипотеза обеспечивает связь между синуклеинопатией и потерей катехоламиновых нейронов при заболеваниях с тельцами Леви. Разработанная здесь концепция состоит в том, что DOPAL и α-syn являются узлами в сложной связи взаимодействующих гомеостатических систем.

    α-синуклеин

    α-синуклеин, который обнаруживается в агрегированной и фибриллярной форме, привлек значительное внимание как потенциальный молекулярный биомаркер БП.(Эмамзаде, 2016). Человеческий α-син преимущественно экспрессируется в головном мозге в неокортексе, гиппокампе, ЧС, таламусе и мозжечке и обнаруживается в ЛБ (Сургучев, 2015). Он кодируется геном SNCA, состоящим из шести экзонов размером от 42 до 1110 п.н. (McLean et al., 2000; Yu et al., 2007). Как отмечено выше, преобладающей формой α-syn является полноразмерный белок, но были описаны и другие более короткие изоформы. Важно отметить, что укорочение С-конца α-син индуцирует агрегацию, что позволяет предположить, что модификации С-конца могут быть вовлечены в патологию α-сина (Venda et al., 2010). Сообщалось об изменениях уровней α-син в ЦСЖ и плазме пациентов с БП по сравнению с контрольными лицами (Hong et al., 2010). Недавние данные свидетельствуют о том, что α-syn может секретироваться во внеклеточное пространство головного мозга и распространять патологию БП, размножаясь прионоподобным образом (Masuda-Suzukake et al., 2013). Эта внеклеточная форма белка также может быть обнаружена в жидкостях организма человека, включая кровь и спинномозговую жидкость (Mollenhauer et al., 2011). Постепенное распространение патологии α-синов приводит к высокой концентрации внеклеточных α-синов, потенциально способных повреждать здоровые нейроны.Более того, недавние исследования биомаркеров показали изменения уровня α-сина в плазме крови у пациентов с БП (Li et al., 2007; Foulds et al., 2011), что позволяет предположить, что α-син может проникать через ГЭБ. Позднее был прослежен двунаправленный путь радиоактивно меченого α-сина из крови в ЦНС и наоборот (Sui et al., 2014). Следовательно, α-син можно рассматривать как потенциальный биомаркер БП.

    Аполипопротеин А1 (АпоА1)

    ApoA1 представляет собой аполипопротеин 28 AA с молекулярной массой ∼28 кДа, который является основным компонентом частиц ЛПВП (Brewer et al., 1983). Этот аполипопротеин синтезируется в основном печенью и тонкой кишкой и отвечает за сбор лишнего холестерина из клеток. АпоА1 в сотрудничестве с апоЕ участвует в транспорте липидов в головном мозге (Emamzadeh, 2017). ApoA1 вместе с другим аполипопротеином, apoE, отвечает за транспортировку липидов в головной мозг. Сообщается о более низких уровнях одной изоформы апоА1 и тетранектина в спинномозговой жидкости пациентов с БП, что позволяет предположить, что апоА1 является потенциальным биомаркером БП (Wang et al., 2010; Свонсон и др., 2015). АпоА1 не может секретироваться нейронами, но как основной компонент ЛПВП он необходим для транспорта холестерина в мозг. Следовательно, он, возможно, проходит через ГЭБ и способствует защитной роли ЛПВП. При БП более низкий уровень апоА1 означает менее эффективный ЛПВП и сниженный гомеостаз и функцию холестерина в головном мозге (Vitali et al., 2014).

    Биомаркеры PD на основе РНК

    Недавнее исследование микроРНК (миРНК) при БП указывает на их растущую роль в качестве потенциальных биомаркеров БП, особенно из-за их присутствия в спинномозговой жидкости и периферической циркуляции как в свободном виде, так и в экзосомах.микроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК длиной 21–24 нуклеотида, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию генов. Благодаря своей способности пересекать ГЭБ микроРНК обладают высоким потенциалом в качестве удобных биомаркеров БП. В недавнем исследовании Dos Santos et al. (2018) проанализировали профиль экспрессии микроРНК с использованием секвенирования следующего поколения (NGS) в спинномозговой жидкости пациентов с ранней стадией БП и контрольной группы. Авторы определили панель биомаркеров на основе миРНК для ранней диагностики БП, включающую пять лучших переменных ранжирования (Let-7f-5p, миР-125a-5p, миР-151a-3p, миР-27a-3p и миР-3p). 423-5с).Анализ показал высокую прогностическую ценность с диагностической чувствительностью 90%. Включение α-syn в анализ дополнительно повышает надежность панели на основе микроРНК. Несколько других групп подтвердили, что микроРНК могут быть использованы в качестве новых биомаркеров БП, что предполагает прорыв в новых диагностических и терапевтических подходах к этому заболеванию (Arshad et al., 2017; Vitali et al., 2018). Несколько других биомаркеров находятся на стадии изучения в ряде медицинских центров, информацию о которых можно найти на сайте: https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=Паркинсон$+$Болезнь&term=биомаркер&cntry=&state=&city=&dist=.

    Определение профиля метаболита

    Метаболическое профилирование тканей и/или биологических жидкостей человека отражает сложное взаимодействие генов, белков и окружающей среды человека. Протонная (1H) и фосфорная (31P) магнитно-резонансная спектроскопия (MRS) представляют собой неинвазивные методы визуализации, которые использовались для изучения метаболитов, участвующих в энергетическом обмене, включая АТФ, лактат, креатин и другие низкомолекулярные метаболиты (Havelund et al. ., 2017). Значительные изменения в метаболитах были описаны у пациентов с БП и на животных моделях, включая повышение уровня лактата в стриатуме (Henchcliffe et al., 2008) и снижение отношения N -ацетиласпартат/креатин при прогрессирующей БП (Seraji-Bozorgzad et al. , 2015). Изменения метаболизма аланина, аминокислот с разветвленной цепью и жирных кислот указывают на митохондриальную дисфункцию при БП (Havelund et al., 2017).

    Биомаркеры нейровизуализации

    Современные технологии позволяют выявлять аномалии головного мозга у пациентов с БП с помощью методов визуализации, таких как транскраниальная эхография в B-режиме (TCS), визуализация с взвешиванием по восприимчивости (SWI), визуализация с диффузионно-взвешенным изображением (DWI) (Chung et al., 2009), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ).

    Транскраниальная сонография в B-режиме (TCS)

    Транскраниальная сонография в В-режиме позволяет контролировать скорость кровотока в сосудах головного мозга путем измерения частоты ультразвуковых волн и их эхо-сигналов. Этот недорогой и надежный метод показывает более высокую эхогенность ЧС при БП по сравнению с нормальной группой, что, возможно, происходит из-за повышенного уровня железа и глиоза в ЧС у пациентов с БП (Skoloudík et al., 2014). Повышенный уровень железа при БП может быть связан как с чередованием, так и с нарушением функции ГЭБ. При БП увеличение количества железопереносящих рецепторов, включающих как трансферриновые рецепторы ГЭБ, так и железосвязывающие рецепторы нейронов, может приводить к накоплению железа в ЧС (Hare et al., 2013).

    Магнитно-резонансная томография (МРТ)

    Диффузионно-взвешенная визуализация — это форма МРТ, которая измеряет скорость диффузии воды через ткань для определения структурных деталей этой ткани.Более высокая измеренная диффузионная способность означает большую подвижность молекул воды, что может быть связано с гибелью клеток и уменьшением объема области. Эта методика позволяет дифференцировать БП от множественной системной атрофии (МСА) на ранней стадии, при этом клинические симптомы этих заболеваний сходны. В частности, при использовании DWI сообщалось о более высокой диффузионной способности воды в средних ножках мозжечка у пациентов с МСА по сравнению с пациентами с БП (Chung et al., 2009). DWI также может дифференцировать пациентов с прогрессирующим надъядерным параличом (ПНП) ​​от пациентов с БП путем выявления аномалий в базальных ганглиях (Seppi et al., 2003). Более традиционные методы МРТ, такие как Т1-взвешенная МРТ с высоким разрешением 3 Тесла, также могут обнаруживать уменьшенный объем хвостатого ядра и скорлупы у пациентов с БП по сравнению с контрольной группой (Saeed et al., 2017).

    Однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ)

    И ПЭТ, и ОФЭКТ могут выявить раннее начало болезни Паркинсона и потерю дофаминергических нейронов с использованием радиофармпрепаратов и компьютерных технологий для создания 3D-изображений. Большинство радиоактивных индикаторов представляют собой неинвазивные радиофармацевтические препараты с коротким сроком службы, которые обычно распадаются вскоре после завершения визуализации.Кроме того, 3D-изображения ПЭТ и ОФЭКТ позволяют выявить функцию органа, тогда как МРТ может отслеживать только анатомию и структуру (Histed et al., 2012).

    Радиофармпрепараты для сканирования ОФЭКТ имеют более длительный срок службы по сравнению с радиофармпрепаратами для ПЭТ. В основном это 123 йод ( 123 I) и 99m технеций ( 99m Tc), испускающие гамма-лучи. Визуализация DAT-SPECT позволяет отслеживать дегенерацию пресинаптических окончаний в дофаминергических нейронах путем визуализации количества DAT.Этот метод является хорошим способом диагностики снижения DAT в головном мозге, и, что важно, он не позволяет отличить болезнь Паркинсона от других синдромов Паркинсона. Гамма-излучающие лиганды DAT, такие как 123 I-йометопан ( 123 I-β-CIT), 123 I-иофлупан ( 123 I-FP-CIT), 123 I-алтропан 123 I-IPT) являются наиболее распространенными индикаторами ОФЭКТ с плотностью DAT. Эти лиганды являются производными ингибиторов обратного захвата тропана и дофамина, нацеленных на DAT (Wang et al., 2012; Брукс, 2016).

    Однофотонная эмиссионная компьютерная томография также использует радиолиганды дофаминовых D2-рецепторов, которые являются антагонистами дофамина. Они включают 123 I-иодобензамид ( 123 I-IBZM) (Reiche et al., 1995), 123 I-IBF (Sasaki et al., 2003) и 123 I-эпидеприд (Pirker et al., 2003). др., 1997). 123 I-2′-йодспиперон (2′-ISP) также используется в некоторых исследованиях для мониторинга дофаминовых рецепторов D2. Хотя этот радиофармпрепарат позволяет отличить болезнь Паркинсона от других форм паркинсонизма благодаря характеру его поглощения базальными ганглиями, он дает высокий фон изображения и нуждается в модификации для улучшения его эффективности (Yonekura et al., 1995).

    Количество везикулярного переносчика ацетилхолина (ВАХТ) можно контролировать с помощью радиофармпрепаратов ОФЭКТ в качестве подхода к ранней диагностике БП. Ацетилхолин (АХ) является нейротрансмиттером, который находится в равновесии с дофамином у здоровых людей. Гибель дофаминергических нейронов и снижение уровня дофамина при БП связаны с повышением уровня АХ. 123 I-йодобензовезамикол ( 123 I-IBVM) связывается с VAChT и выявляет плотность везикул, содержащих ацетилхолин.С помощью этого радиофармпрепарата ОФЭКТ было установлено снижение ВХТ в теменных и затылочных долях у пациентов с БП без деменции и снижение ВХТ во всех долях коры головного мозга у пациентов с БП с деменцией (Niethhammer et al., 2012).

    123 I-метайодобензилгуанидин ( 123 I-MIBG) — еще один радиофармпрепарат, который позволяет различать БП и МСА (Goldstein, 2001). Отношение 123 I-MIBG от сердца к средостению нарушено у пациентов с идиопатической БП, но не у пациентов с МСА.ПЭТ / КТ-сканирование этих пациентов с БП также показало снижение поглощения FP-CIT полосатым телом (Oh et al., 2015). MIBG-сцинтиграфия позволяет отличить не только БП от МСА, но и БП от ДТЛ (Goldstein, 2001, 2013).

    Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ)

    Радиофармпрепараты ПЭТ-сканирования испускают электронные античастицы (позитроны), которые положительно заряжены и имеют ту же массу, что и электрон. Наличие пресинаптической ДАТ в дофаминергических нейронах полосатого тела и ЧС можно оценить с помощью 18 F и/или 11 С радиомеченых аналогов дофамина.Эти радиолиганды DAT включают 18 F-допамин ( 18 F-дофа) (Ibrahim et al., 2016), 18 F-FE-PE2I (Fazio et al., 2015), 18 F-β -CFT (Rinne et al., 1999), 18 F-LBT999 (Arlicot et al., 2017) и 11 C-метилфенидат. Количественное определение VMAT2 также возможно с использованием радиоактивно меченного дигидротетрабеназина (DTBZ) 11 C или 18 F (Tong et al., 2008; Lin et al., 2013). Из-за потери дофаминергических клеток и последующей потери VMAT2 сигнал ПЭТ радиоактивно меченого DTBZ ниже у пациентов с БП, чем в контрольной группе.Радиолиганды DAT и VMAT2 могут обнаруживать ранние признаки дофаминергического повреждения, хотя болезнь Паркинсона нельзя отличить от атипичного паркинсонизма с дофаминергической дисфункцией. 11 C-MP4A — еще один радиофармпрепарат для ПЭТ, который контролирует уровень активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Гидролиз АХЭ дезактивирует АХ и обрывает сигнал. Нарушение холинергической системы и снижение корковой АХЭ оценивали с помощью 11 C-MP4A-ПЭТ. Активность АХЭ снижается больше при БП, чем при БП, что указывает на то, что холинергическая дисфункция коррелирует с деменцией при БП (Bohnen et al., 2006).

    Лечение болезни Паркинсона

    Разработка нейропротекторных препаратов для лечения БП является важной неудовлетворенной медицинской потребностью, поскольку это заболевание постепенно ухудшает качество жизни пациентов и функциональные возможности в повседневной жизни. Поэтому определение новых терапевтических мишеней имеет большое значение. Хотя в настоящее время доступны различные лекарства и методы лечения для контроля симптомов БП, лекарства от БП не существует. Разработка методов лечения БП, основанная на симптомах и потребностях пациентов, варьируется от различных лекарств до реабилитации или даже хирургического вмешательства.БП включает различные клинические проявления, наблюдаемые в нескольких исследованиях, изучающих существование подтипов БП. Кластерный анализ позволяет идентифицировать различные подтипы БП в соответствии с релевантностью как моторных, так и немоторных симптомов и выбирать терапевтический подход в соответствии с проявлением кластерных симптомов (Lauretani et al., 2014).

    Лекарства

    Наиболее распространенная терапия БП включает в себя различные имеющиеся в продаже лекарства, которые устраняют недостаток дофамина в ЧН.Эти лекарства могут временно облегчить симптомы БП различными способами, повышая уровень дофамина, имитируя роль дофамина или ингибируя окислительный метаболизм дофамина, что приводит к образованию активных форм кислорода (АФК) (Goldenberg, 2008). Формирование белковых агрегатов, которые приводят к гибели нейронов, является еще одной важной мишенью для лечения БП. Среди различных препаратов для лечения БП леводопа ( L -допа, L -3,4-дигидроксифенилаланин) является эффективным препаратом.Леводопа является непосредственным метаболическим предшественником дофамина, который вырабатывается ТГ из L -тирозина. В дофаминергических нейронах дофа-декарбоксилаза превращает леводопу в дофамин. Леводопа, принимаемая перорально, может подвергаться декарбоксилированию в периферических участках до того, как она достигнет ЦНС. Поэтому леводопа доступна в комбинации с карбидопой или бенсеразидом, которые являются периферическими ингибиторами дофа-декарбоксилазы, но не проходят через ГЭБ. Неизмененная леводопа в присутствии периферических ингибиторов декарбоксилазы может проникать в ЦНС и используется как предшественник дофамина (Goldenberg, 2008).

    Леводопа

    , более эффективно трансформируется в дофамин после накопления везикул серотонинергическими нейронами, а не дофаминергическими нейронами нигростриарной системы. Поскольку серотонинергическое распределение в головном мозге сильно отличается от дофаминергического, это вызывает хорошо известные побочные эффекты терапии L -DOPA и снижает ее эффективность как лекарственного средства (De Deurwaerdère et al., 2017).

    Синемет был первой торговой маркой комбинации карбидопа/леводопа на фармацевтическом рынке (Скрябин, 1999).Rytary и duopa — два недавно одобренных препарата для лечения болезни Паркинсона Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). Xadago (сафинамид) недавно одобрен для лечения пациентов с болезнью Паркинсона, которым не помогает леводопа/карбидопа. Rytary производится компанией Impax Laboratories в виде капсул для приема внутрь, содержащих карбидопу-леводопу вместе с энтакапоном для продления его действия. Доупа производства компании AbbVie используется для лечения двигательных флуктуаций при запущенной болезни Паркинсона. Дупа представляет собой энтеральный гель, состоящий из леводопы-карбидопы, который перекачивается в кишечник пациента (Olanow et al., 2014).

    Группа агонистов дофамина представляет собой агенты, которые связываются с дофаминергическими постсинаптическими рецепторами и вызывают тот же сигнал, что и сам дофамин. К этой группе относятся перголид, прамипексола дигидрохлорид, ропинирол гидрохлорид, ротиготин и апоморфина гидрохлорид (Jankovic and Aguilar, 2008).

    Ингибиторы MAOB – селегилин и разагилин также доступны в качестве препаратов для лечения ПД. Изоформы моноаминоксидазы, в том числе МАОА и МАОБ, находящиеся на наружной мембране митохондрий, участвуют в окислительном дезаминировании биогенных аминов, таких как нейротрансмиттеры и амины ксенобиотиков, т.е.g., 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) (Bach et al., 1988). МАО оказывают существенное влияние на течение БП, так как участвуют в метаболизме дофамина. Окислительный метаболизм дофамина в дофаминергических клетках ЧС под действием МАО приводит к образованию АФК, окислительному повреждению и гибели клеток (Reiter, 1995). Кроме того, MAOB катализирует превращение MPTP в 1-метил-4-фенилпиридин (MPP+), ответственный за паркинсонизм у лиц, употребляющих наркотики внутривенно (Langston, 1996).Селегилин и разагилин могут защищать нейроны от окислительного повреждения, вызванного метаболитами дофамина, снижающими активность MAOB. Более того, некоторые вещества, такие как энтакапон и толкапон, которые ингибируют катехол- или -метилтрансферазу (КОМТ), доступны в качестве альтернативных препаратов для лечения БП. Эти два препарата блокируют превращение леводопы в метилированную леводопа. Следовательно, ингибирование активности COMT этими препаратами может продлить существование функциональной леводопы, предотвращая ее деградацию (Goldenberg, 2008).

    Кроме того, некоторые другие химические вещества могут рассматриваться как потенциальные лекарства от болезни Паркинсона. Рапамицин может быть полезен при лечении болезни Паркинсона в качестве повышающего регулятора аутофагии. Рапамицин вызывает аутофагию в клетках путем ингибирования активности специфической киназы, называемой mTOR. Аутофагия является потенциальной мишенью для лечения БП, поскольку она инициирует клиренс белковых агрегатов и ингибирует апоптоз (Hochfeld et al., 2013). Антагонисты аденозиновых рецепторов A2A, такие как кофеин, также снижают риск БП. Трансгенные мыши с мутантными генами α-syn и делетированными генами рецептора аденозина A2A защищены от БП.Таким образом, антагонисты рецепторов А2А являются потенциальными кандидатами для профилактики и лечения БП (Kachroo and Schwarzschild, 2012).

    Формирование белковых агрегатов, приводящее к гибели нейронов, является многообещающей мишенью для лечения БП. В январе 2015 года компания Neuropore Therapies объявила о начале клинических испытаний I фазы нового препарата NPT200-11 (UCB-1332), который ингибирует олигомеризацию α-сина (Oertel, 2017). Другим потенциальным лекарством, модулирующим агрегацию α-син, блокирующим или снижающим превращение мономеров в олигомеры или позже в фибриллы, является ANLE138b (Levin et al., 2014). Несколько многообещающих соединений находятся в стадии разработки и/или проходят доклинические испытания, которые могут усиливать аутофагию α-син. Недавний скрининг соединений, защищающих клетки от α-син-индуцированной нейродегенерации, выявил неселективный ингибитор фосфодиэстеразы (ФДЭ) дипиридамол. Важно отметить, что ингибирование PDE1 также защищает дофаминергические нейроны от α-син-индуцированной дегенерации у мышей SN. Ингибиторы ФДЭ в настоящее время проходят доклинические испытания (Höllerhage et al., 2017). Еще одно антиагрегационное соединение – природный продукт скваламин вытесняет α-син с поверхности липидных везикул, тем самым блокируя первые этапы процесса его агрегации.Кроме того, скваламин подавляет токсичность олигомеров α-син, ингибируя их взаимодействие с липидными мембранами (Perni et al., 2017).

    Хирургия

    Терапия глубокой стимуляции мозга редко используется при определенных типах заболеваний головного мозга, включая болезнь Паркинсона, дистонию, обсессивно-компульсивное расстройство и резистентную к лечению депрессию (Herrington et al., 2016). Когда симптомы болезни Паркинсона очень серьезны и лекарства не могут их смягчить, хирургическое вмешательство и DBS можно рассматривать как окончательные варианты лечения.Он включает в себя отправку электрических импульсов в определенные части мозга (обычно SN или бледный шар, которые сообщаются с SN) с помощью нейростимулятора, который представляет собой мозговой имплантат, известный как «мозговой кардиостимулятор». Целевой областью DBS обычно является субталамический ядро (STN). Стимуляция дорсолатеральной границы STN одновременно с операцией может повысить ее эффективность (Herzog et al., 2004). Позже было обнаружено, что стимуляция неопределенной каудальной зоны (cZI) может быть более эффективной с меньшим количеством осложнений после операции (Plaha et al., 2006). Стимуляция нейронов также может привести к нейрогенезу и нейропластичности и, таким образом, может на длительное время улучшить двигательные проблемы, такие как дискинезия и тремор, и все другие симптомы, чувствительные к леводопе. Однако есть две проблемы с DBS, а именно период ожидания от 3 до 6 месяцев, необходимый для достижения оптимальных результатов, и возможность инфекции головного мозга (Bronstein et al., 2011).

    Генная терапия

    Развитие генной терапии болезни Паркинсона значительно продвинулось за последнее десятилетие.Прогрессирующая БП не дает хорошего ответа на терапию леводопой. Большая потеря дофаминергических нейронов сопровождается снижением уровня декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC), которая превращает L -DOPA в дофамин. После успешных доклинических исследований аденоассоциированные вирусные векторы, несущие человеческий ген AADC, недавно были доставлены в нейроны скорлупы и субталамическое ядро ​​пациентов с БП. В этом методе достаточное количество дофамина можно контролировать, принимая адекватную дозу леводопы.Перорально принимаемая леводопа может превращаться в дофамин с помощью AADC и смягчать симптомы болезни Паркинсона (Muramatsu et al., 2010). Безопасность и эффективность метода подтверждены в течение 4 лет ежегодным ПЭТ-исследованием пациентов, получавших определенные дозы AAV2-hAADC (Mittermeyer et al., 2012). Другой мишенью для генной терапии при БП является декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD), которая способствует выработке ГАМК в ГАМКергических нейронах субталамического ядра. ГАМК как тормозной нейротрансмиттер регулирует мышечный тонус и улучшает моторные функции (Watanabe et al., 2002). Недостаток дофамина при БП вызывает активацию субталамического ядра и ненужные мышечные реакции, которые ГАМК благодаря своему ингибирующему эффекту может значительно улучшить. Этот метод можно сравнить с DBS, который, посылая электрические разряды в субталамическое ядро, снижает его гиперактивность и улучшает двигательные нарушения (Coune et al., 2012). Испытание этого метода на людях было проведено путем двусторонней инъекции AAV2-GAD в субталамическое ядро ​​пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона. Этот подход показал безопасность и эффективность, хотя он требует дополнительных исследований, чтобы его можно было рассматривать в качестве лечения (LeWitt et al., 2011). Терапевтический эффект нейротрофического фактора, полученного из линии глиальных клеток (GDNF), на функцию нейронов в нечеловеческих моделях БП побудил ученых вводить его непосредственно в скорлупу пациентов с БП. Эта операция помогла пациентам улучшить движения, уменьшить дискинезию и увеличить накопление дофамина в скорлупе (Gill et al., 2003). Таким образом, GDNF является возможным вариантом генной терапии. Ген нейтурина является еще одним кандидатом на генную терапию БП. Нейртурин является нейротрофическим фактором, важным для выживания и дифференцировки дофаминергических нейронов (Lin et al., 1993). Испытание этого фактора на людях было проведено путем билатеральной инъекции вектора AAV2-нейртурина (CERE-120) в биомаркеры скорлупы пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона (Bartus et al., 2013). Введенный нейтурин не может распространяться в ЧС и играть свою терапевтическую роль из-за обширных дефектов аксонального транспорта у пациентов с БП. Другим следствием этого метода может быть накопление α-син, что приводит к подавлению экспрессии нейтурина (Bartus et al., 2014).

    Негенетические факторы риска болезни Паркинсона

    Только 10–15% случаев БП являются семейными БП с ранним началом, в то время как остальные случаи являются идиопатическими, что указывает на важную роль негенетических факторов и факторов окружающей среды в патогенезе БП.Воздействие токсинов окружающей среды может вызвать гибель дофаминергических клеток. Накопление тяжелых металлов в ЧС повышает риск развития БП. Воздействие тяжелых металлов может усиливать окислительный стресс в дофаминергических клетках, что приводит к БП. МАО в присутствии кислорода может опосредовать окисление дофамина in vitro в 3,4-дигидроксифенилацетальдегид (ДОПАЛ). DOPAL инициирует олигомеризацию α-syn в нефибриллярные, устойчивые к SDS агрегаты (Burke, 2003). Однако другое исследование показало, что ингибирования МАО для остановки производства ДОФАЛА недостаточно для снижения олигомеризации α-сина (Burke, 2003).Самоокисление дофамина в дорминхинон (DAQ) также может усиливать как образование, так и секрецию нефибриллярных олигомеров α-синов, тем самым способствуя передаче патогенных α-синов соседним нейронам и глии (Lee et al., 2011). Пигмент нейромеланин в высокой степени экспрессируется в дофаминергических нейронах, предотвращая окислительный стресс, связанный с накоплением цитозольного дофамина. С другой стороны, умирающие нейроны в мозге при БП выделяют нейромеланин, который активирует нейроглию и запускает нейровоспаление (Zucca et al., 2014). Более того, липидированный нейромеланин может взаимодействовать с α-сином и запускать его агрегацию в нерастворимый комплекс у пациентов с БП (Double and Halliday, 2006).

    Генетический полиморфизм цитохрома P450 2D6 (CYP2D6) – фермента, участвующего в метаболизме токсинов окружающей среды, также связан с развитием БП. Например, у метаболизаторов с дефицитом CYP2D6 риск развития БП в два раза выше, если они также подвергаются воздействию пестицидов. Следовательно, для метаболизма пестицидов (например, пестицидов) требуется достаточный уровень активности CYP2D6.g., органофосфаты, атразин), которые связаны с патогенезом БП (Elbaz and Tranchant, 2007).

    Активные формы кислорода и, следовательно, окислительный стресс также известны как патологический фактор БП. Фермент НАДФН-оксидаза-2 (NOX2) представляет собой мембраносвязанную оксидазу, присутствующую в основном в фагоцитах, генерирующую АФК в фагосомах для уничтожения бактерий. Производные от NOX2 АФК также повреждают дофаминергические нейроны. Дофаминергические нейроны у мышей с нокаутом NOX2 начинают дегенерировать быстрее, чем аналогичные клетки в контроле дикого типа после введения MPTP (Brieger et al., 2012).

    В 1956 году два невролога, Посканцер и Шваб, выдвинули гипотезу о том, что болезнь Паркинсона связана с гриппозной инфекцией (Estupinan et al., 2013). Они исследовали группу больных БП и выявили, что возраст начала заболевания смещен в сторону возрастной группы, родившихся до или во время пандемии гриппа в 1918 г. и в основном переболевших вирусом гриппа. Однако другие исследования показали, что гриппозная инфекция может вызывать симптомы, подобные БП, но не может повышать риск развития БП (Estupinan et al., 2013). Другая гипотеза предполагает, что Toxoplasma gondii, внутриклеточный паразит, вызывающий токсоплазмоз, может увеличивать риск БП. Паразит в головном мозге инфицировал те участки, которые поражаются при БП, включая базальные ганглии (Miman et al., 2010), хотя в других исследованиях аналогичный результат не получен (Mahami Oskouei et al., 2016).

    Генетические формы и генетические факторы риска PD

    Хотя большинство случаев БП являются идиопатическими формами заболевания, около 15% пациентов с БП распознаются как имеющие члена семьи первой степени родства с этим заболеванием.Недавно благодаря передовой молекулярной генетике были обнаружены генетические факторы и генные локусы, участвующие в аутосомно-доминантных и аутосомно-рецессивных формах БП (Samii et al., 2004; Karimi-Moghadam et al., 2018) (таблицы 1, 2). Мутации в нескольких генах, включая α-syn, LRRK2, PINK1, Parkin, DJ-1, VPS35 и GBA1, связаны с болезнью Паркинсона (Zeng et al., 2018). В дополнение к мутациям в этих генетических локусах полиморфизмы и тринуклеотидные повторы распознаются как гены БП или факторы предрасположенности к БП (таблица 3).

    ТАБЛИЦА 1. Аутосомно-рецессивные и сцепленные с Х-хромосомой гены, вовлеченные в болезнь Паркинсона.

    ТАБЛИЦА 2. Аутосомно-доминантные гены, вовлеченные в болезнь Паркинсона.

    ТАБЛИЦА 3. Факторы предрасположенности к болезни Паркинсона.

    Эпигенетические факторы риска БП

    Эпигенетика относится к изменениям хроматина, включая метилирование ДНК и посттрансляционные модификации гистонов, которые могут изменять экспрессию генов без изменения последовательности ДНК.Эти модификации могут передаваться по наследству, но факторы окружающей среды, включая пищевые, химические и физические факторы, также могут влиять на эпигенетику (Surguchov et al., 2017). При спорадической форме БП участие факторов окружающей среды в инициации и прогрессировании заболевания наталкивает на мысль о том, что эпигенетика играет важную роль в БП (Feng et al., 2015). Одним из примеров эпигенетического механизма при БП является модификация гена α-син (SNCA). SNCA имеет два островка CpG, первый из которых расположен в экзоне 1 (CpG-1), а второй (CpG-2) — в интроне 1.Факторы транскрипции (TF) GATA и ZSCAN21 связываются с островком CpG-2 интрона 1 и модулируют транскрипцию α-syn. Метилирование CpG-2 предотвращает связывание TF с SNCA и впоследствии ингибирует сверхэкспрессию α-syn. Интересно, что было описано связывание факторов транскрипции с α-син (Iwata et al., 2001) и другим членом семейства синуклеинов, γ-синуклеином (Сургучева, Сургучев, 2008), что позволяет предположить, что члены семейства синуклеинов участвуют в различных процессах. сложные механизмы регуляции экспрессии генов.Поэтому их роль при БП не ограничивается образованием токсических агрегатов, а может дополняться участием в регуляторных процессах.

    Мацумото и др. (2010) обнаружили, что CpG в SNCA были гиперметилированы в контроле, но не метилированы у пациентов с БП, предполагая, что метилирование является эпигенетическим фактором риска БП, связанным с патогенезом α-син. При БП деметилированные SNCA кодируют большое количество α-син, которые могут инициировать агрегацию и способствовать нейродегенерации.Кроме того, уровни ядерной ДНК (цитозин-5′) метилтрансферазы 1 (DNMT1) в посмертном мозге БП ниже, чем в контрольном мозге. Эта метилаза эпигенетически подавляет экспрессию генов за счет метилирования ДНК, и ее сниженный уровень при БП может быть связан с гипометилированием SNCA.

    Эпигенетические модификации в других генах также участвуют в развитии БП, включая гены фактора некроза опухоли α (TNF-α), PARK16, трансмембранного гликопротеина NMB (GPNMB) и синтаксин-1B (STX1B).Гипометилирование промотора TNF-α, гиперметилирование динуклеотида CpG в синфилине-1, STX1B и гиперметилирование множественных сайтов CpG проксимальнее GPNMB описаны в PD (Yang et al., 2017). Более того, эпигенетические изменения в митохондриальной ДНК (мтДНК) также могут вызывать БП. В нескольких исследованиях показано гипометилирование и гипергидроксиметилирование петли смещения мтДНК (D-петля) в ЧС мозга при БП (Iacobazzi et al., 2013; Chuang et al., 2017).

    Заключение

    Патология БП сложна и включает сочетание генетики, эпигенетики и факторов окружающей среды.Текущие медицинские, патологические и экспериментальные данные подтверждают гипотезу Браака (Braak et al., 2003) о пространственно-временном распространении патологии БП, включающей распространение α-синов из желудочно-кишечного тракта и обонятельной системы посредством транссинаптического межклеточного переноса через вегетативную нервную систему. к ЦНС. Многие немоторные симптомы, в том числе нарушения сна, обонятельная недостаточность, гипосмия (снижение обоняния и способности различать запахи), запоры и другие могут играть важную роль в качестве успешной будущей диагностики для выявления патологии и механизмов БП на начальных стадиях заболевания. (Райхманн и др., 2016). Важными факторами, способствующими БП, являются дисфункции митохондрий и эндоплазматического ретикулума, нарушение аутофагии и эндоцитоза, нарушение регуляции иммунитета. Несмотря на интенсивное изучение механизма БП, болезнь остается неизлечимой. Будущие задачи для врачей и исследователей, работающих в области БП и подобных расстройств, будут направлены на идентификацию биомаркеров для ранней диагностики этих заболеваний на доклинической стадии. Новые биомаркеры должны отслеживать прогрессирование заболевания и определять ключевые метаболические изменения для выявления потенциальных целей для вмешательства.Будущие задачи также должны быть направлены на разработку и применение профилактических мер для остановки или уменьшения прогрессирования заболевания на досимптомных стадиях и поиск новых противопаркинсонических препаратов со специфическим нейропротекторным действием на дофаминергическую систему. В дополнение к консервативному подходу, основанному на выявлении новых белковых биомаркеров в крови, плазме и спинномозговой жидкости, растет надежда, что анализ микроРНК может внести значительный вклад в раннюю диагностику этого заболевания. Развитие индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и техники редактирования генома открывает новые надежды на лечение ряда заболеваний человека, особенно генетических нарушений.Для БП, которая является преимущественно спорадическим заболеванием и сочетает несколько относительно редких генетических причин, эти методы дали возможность разработать новые модели и изучить фенотипы как в генетических, так и в спорадических случаях, чтобы собрать воедино патогенные пути, включающие их генные продукты.

    Вклад авторов

    FE разработал содержание статьи и написал оригинальную рукопись. AS пересмотрела и отредактировала рукопись, провела поиск дополнительной литературы по теме и обсудила написание с FE.

    Финансирование

    Эта работа была поддержана грантом EC Framework 7 Marie Curie Fellowship Network Training Grant (NEURASYNC) для FE и грантами VA Merit Review 1I01BX000361 и грантом QB42308 Фонда глаукомы для AS.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    FE благодарит профессора Дэвида Олсопа за его помощь и поддержку.

    Сокращения

    8-OHdG, 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин; ГЭБ, гематоэнцефалический барьер; ЦСЖ, спинномозговая жидкость; DBS, глубокая стимуляция мозга; DLB, деменция с тельцами Леви; GBA, кислая β-глюкоцереброзидаза; ЛПВП, липопротеины высокой плотности; LBs, тельца Леви; ЛПНП, липопротеины низкой плотности; L -допа, леводопа; LRRK2, киназа 2 с богатыми лейцином повторами; МАОА, моноаминоксидаза А; MAOB, моноаминоксидаза B; МАРК, митоген-активируемые протеинкиназы; MAPT, тау-белок, ассоциированный с микротрубочками; MPTP, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин; БП, болезнь Паркинсона; PDD, деменция при болезни Паркинсона; ПЭА, β-фенилэтиламин; PINK1, предполагаемая киназа 1, индуцированная PTEN; СН, черная субстанция; ТВР, белок, связывающий ТАТА-бокс; TH, тирозингидроксилаза; ЛПОНП, липопротеины очень низкой плотности.

    Ссылки

    Ангот, Э., и Брундин, П. (2009). Анализ потенциальных молекулярных механизмов, лежащих в основе переноса альфа-синуклеина от клетки к клетке при болезни Паркинсона. Относительный паркинсонизм. Беспорядок. 15(Прил. 3), С143–С147. doi: 10.1016/S1353-8020(09)70802-8

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Аппель-Кресуэлл, С., Раджпут, А. Х., Сосси, В., Томпсон, К., Сильва, В., Маккензи, Дж., и соавт. (2014). Клинические, позитронно-эмиссионные и патологические исследования DNAJC13 p.N855S паркинсонизм. Мов. Беспорядок. 29, 1684–1687. doi: 10.1002/mds.26019

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Arlicot, N., Vercouillie, J., Malherbe, C., Bidault, R., Gissot, V., Maia, S., et al. (2017). ПЭТ-визуализация переносчика дофамина с помощью 18F-LBT999: первое исследование на людях. J. Nucl. Мед. 58:1276. doi: 10.1111/j.1527-3458.2007.00033.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Аршад, А.Р., Сулейман, С.А., Сапери, А.А., Джамал, Р., Мохамед Ибрагим, Н., и Абдул Мурад, Н.А. (2017). МикроРНК и гены-мишени как биомаркеры для диагностики раннего начала болезни Паркинсона. Перед. Мол. Неврологи. 10:352. doi: 10.3389/fnmol.2017.00352

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бах, А.В., Лан, Н.К., Джонсон, Д.Л., Абелл, К.В., Бембенек, М.Е., Кван, С.-В., и др. (1988). Клонирование кДНК моноаминоксидазы А и В печени человека: молекулярная основа различий в ферментативных свойствах. Проц. Нац. акад. науч. США 85, 4934–4938. doi: 10.1073/pnas.85.13.4934

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Bartus, R.T., Baumann, T.L., Siffert, J., Herzog, C.D., Alterman, R., Boulis, N., et al. (2013). Безопасность/возможность нацеливания на черную субстанцию ​​с помощью AAV2-нейтурина у пациентов с болезнью Паркинсона. Неврология 80, 1698–1701. дои: 10.1212/WNL.0b013e3182904faa

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бартус, Р.Т., Вайнберг, М.С., и Самульски, Р.Дж. (2014). Генная терапия болезни Паркинсона: успех по замыслу встречает неудачу по эффективности. Мол. тер. 22, 487–497. doi: 10.1038/mt.2013.281

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Berendse, H.W., Booij, J., Francot, C.M., Bergmans, P.L., Hijman, R., and Stoof, J.C. (2001). Субклиническая дофаминергическая дисфункция у родственников больных бессимптомной болезнью Паркинсона со сниженным обонянием. Энн.Нейрол. 50, 34–41. doi: 10.1002/ana.1049

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Бернис, М. Э., Бабила, Дж. Т., Брейд, С., Вюстен, К. А., Вуллнер, У., и Тамгюней, Г. (2015). Прионоподобное размножение альфа-синуклеина человеческого мозга у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий альфа-синуклеин дикого типа. Акта Нейропатол. коммун. 3:75. doi: 10.1186/s40478-015-0254-7

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бландини, Ф., Sinforiani, E., Pacchetti, C., Samuele, A., Bazzini, E., и Zangaglia, R. (2006). Периферическая активность протеасом и каспаз при болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера. Неврология 66, 529–534. doi: 10.1212/01.wnl.0000198511.09968.b3

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бонен, Н.И., Альбин, Р.Л., Кеппе, Р.А., Вернетт, К.А., Килбурн, М.Р., Миношима, С., и соавт. (2006). Позитронно-эмиссионная томография моноаминергического везикулярного связывания при старении и болезни Паркинсона. Дж. Цереб. Кровоток Метаб. 26, 1198–1212. doi: 10.1038/sj.jcbfm.9600276

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Браак, Х., Дель Тредичи, К., Руб, У., де Вос, Р. А., Янсен Стер, Э. Н., и Браак, Э. (2003). Стадирование патологии головного мозга, связанной со спорадической болезнью Паркинсона. Нейробиол. Старение 24, 197–211. doi: 10.1016/s0197-4580(02)00065-9

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Брюэр, Х. Б. мл., Фейруэлл, Т., Kay, L., Meng, M., Ronan, R., Law, S., et al. (1983). ProapoA-I плазмы человека: выделение и амино-концевая последовательность. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 113, 626–632. дои: 10.1016/0006-291X(83)
    -2

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бронштейн, Дж. М., Тальяти, М., Альтерман, Р. Л., Лозано, А. М., Фолькманн, Дж., Стефани, А., и соавт. (2011). Глубокая стимуляция мозга при болезни Паркинсона: консенсус экспертов и обзор ключевых вопросов. Арх.Нейрол. 68:165. doi: 10.1001/archneurol.2010.260

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бюрвенич С., Кармин А., Галтер Д., Шахаби Х. Н., Джонелс Б., Холмберг Б. и соавт. (2005). Редкая усеченная мутация в ADh2C (G78Stop) показывает значительную связь с болезнью Паркинсона в большой международной выборке. Арх. Нейрол. 62, 74–78. doi: 10.1001/archneur.62.1.74

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бюрвенич, С., Сидов О., Кармин А., Чжан З., Анврет ​​М. и Олсон Л. (2000). Аллели алкогольдегидрогеназы при болезни Паркинсона. Мов. Беспорядок. 15, 813–818. doi: 10.1002/1531-8257(200009)15:5<813::AID-MDS1008>3.0.CO;2-Y

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Берк, У. Дж. (2003). 3,4-дигидроксифенилацетальдегид: потенциальная мишень нейропротекторной терапии при болезни Паркинсона. Курс. Лекарство нацелено на ЦНС Нейрол. Беспорядок. 2, 143–148. дои: 10.2174/1568007033482913

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Каронти, Б., Antonini, G., Calderaro, C., Ruggieri, S., Palladini, G., Pontieri, F.E., et al. (2001). Иммунореактивность транспортера дофамина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона. Нейронный. Трансм. 108, 803–807. дои: 10.1007/s007020170030

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шарль П., Камузат А., Бенаммар Н., Селлал Ф., Дести А., Боннет А.-М. и др. (2007). Являются ли прерванные экспансии повторов SCA2 CAG ответственными за паркинсонизм? Неврология 69, 1970–1975.

    Академия Google

    Chartier-Harlin, M.-C., Dachsel, J.C., Vilarino-Guell, C., Lincoln, S.J., Lepretre, F., Hulihan, M., et al. (2011). Мутации инициатора трансляции EIF4G1 при семейной болезни Паркинсона. утра. Дж. Хам. Жене. 89, 398–406. doi: 10.1016/j.ajhg.2011.08.009

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чуанг, Ю. Х., Пол, К. С., Бронштейн, Дж. М., Борделон, Ю., Хорват, С., и Ритц, Б. (2017). Болезнь Паркинсона связана с уровнем метилирования ДНК в крови и слюне человека. Геном Мед. 9:76. doi: 10.1186/s13073-017-0466-5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чанг, Э. Дж., Ким, Э. Г., Бэ, Дж. С., Ын, С. К., Ли, К. С., и О, М. (2009). Полезность диффузионно-взвешенной МРТ для дифференциации болезни Паркинсона и паркинсоновского варианта множественной системной атрофии. Дж. Мов. Беспорядок. 2, 64–68. doi: 10.14802/jmd.09017

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чехановер, А.и Квон, Ю. Т. (2015). Деградация неправильно свернутых белков при нейродегенеративных заболеваниях: терапевтические цели и стратегии. Экспл. Мол. Мед. 47:e147. doi: 10.1038/emm.2014.117

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Clairembault, T., Kamphuis, W., Leclair-Visonneau, L., Rolli-Derkinderen, M., Coron, E., Neunlist, M., et al. (2014). Энтеральная экспрессия GFAP и фосфорилирование при болезни Паркинсона. J. Нейрохим. 130, 805–815.doi: 10.1111/jnc.12742

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дас Г., Мишра А.К., Дас С.К., Рэй К. и Рэй Дж. (2009). Тау-белок, ассоциированный с микротрубочками (MAPT), влияет на риск болезни Паркинсона среди индийцев. Неврологи. лат. 460, 16–20. doi: 10.1016/j.neulet.2009.05.031

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Де Дёрваердер, П., Ди Джованни, Г., и Миллан, М. Дж. (2017). Расширение репертуара действия L-ДОФА: всесторонний обзор его функциональной нейрохимии. Прог. Нейробиол. 151, 57–100. doi: 10.1016/j.pneurobio.2016.07.002

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дос Сантос, М. С. Т., Баррето-Санз, М. А., Коррейя, Б. Р. С., Белл, Р., Уидналл, К., Перес, Л. Т., и соавт. (2018). Сигнатуры на основе миРНК в спинномозговой жидкости как потенциальные диагностические инструменты для ранней стадии болезни Паркинсона. Онкотаргет 9, 17455–17465. doi: 10.18632/oncotarget.24736

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дабл, К.Л. и Холлидей Г.М. (2006). Новое лицо нейромеланина. J. Neural Transm. Доп. 70, 119–123. дои: 10.1007/978-3-211-45295-0_19

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Эль-Агнаф, О.М.А., Салем, С.А., Палеологу, К.Е., Карран, М.Д., Гибсон, М.Дж., Корт, Дж.А., и соавт. (2006). Обнаружение олигомерных форм белка (-синуклеина) в плазме крови человека в качестве потенциального биомаркера болезни Паркинсона. FASEB J. 20, 419–425. doi: 10.1096/fj.03-1449com

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Эступинан, Д., Нату, С., и Окунь, М.С. (2013). Кончина теории гриппа Посканцера и Шваба о патогенезе болезни Паркинсона. Паркинсон дис. 2013:167843. дои: 10.1155/2013/167843

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Fazio, P., Svenningsson, P., Forsberg, A., Jönsson, E.G., Amini, N., Nakao, R., et al. (2015). Количественный анализ связывания 18 F-(E)-N-(3-йодопроп-2-енил)-2β-карбофторэтокси-3β-(4’-метилфенил)нортропана с переносчиком дофамина при болезни Паркинсона. J. Nucl. Мед. 56, 714–720. doi: 10.2967/jnumed.114.152421

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Foulds, P.G., Mitchell, J.D., Parker, A., Turner, R., Green, G., Diggle, P., et al. (2011). Фосфорилированный α-синуклеин может быть обнаружен в плазме крови и потенциально является полезным биомаркером болезни Паркинсона. FASEB J. 25, 4127–4137. doi: 10.1096/fj.10-179192

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Фрончек, Р., Overeem, S., Lee, S.Y., Hegeman, I.M., van Pelt, J., van Duinen, S.G., et al. (2007). Потеря гипокретина (орексина) при болезни Паркинсона. Мозг 130, 1577–1585. doi: 10.1093/мозг/awm090

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гилл, С.С., Патель, Н.К., Хоттон, Г.Р., О’Салливан, К., Маккартер, Р., Баннадж, М., и соавт. (2003). Прямая инфузия в головной мозг нейротрофического фактора, полученного из линии глиальных клеток, при болезни Паркинсона. Нац. Мед. 9, 589–595.дои: 10.1038/nm850

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гольденберг, М. М. (2008). Медикаментозное лечение болезни Паркинсона. PT 33, 590–606.

    Академия Google

    Гольдштейн, Д. С. (2001). Симпатическая нейровизуализация сердца для отличия множественной системной атрофии от болезни Паркинсона. клин. Автон. Рез. 11, 341–342. дои: 10.1007/BF022

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Гольдштейн, Д.С., Холмс, К., Лопес, Г.Дж., Ву, Т., и Шараби, Ю. (2018). Биомаркеры спинномозговой жидкости центрального дефицита дофамина предсказывают болезнь Паркинсона. Относительный паркинсонизм. Беспорядок. 50, 108–112. doi: 10.1016/j.parkreldis.2018.02.023

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гребер, М.Б., и Мюллер, У. (1992). Синдром Х-сцепленной дистонии-паркинсонизма: клинический и молекулярно-генетический анализ. Патология головного мозга. 2, 287–295. дои: 10.1111/j.1750-3639.1992.tb00706.x

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Гвинн-Харди, К., Синглтон, А., О’Суиллабхейн, П., Босс, М., Николл, Д., Адам, А., и др. (2001). Спиноцеребеллярная атаксия 3 типа, фенотипически напоминающая болезнь Паркинсона в негроидной семье. Арх. Нейрол. 58, 296–299. doi: 10.1001/archneur.58.2.296

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хаган, Дж. Дж., Лесли, Р. А., Патель, С., Эванс, М. Л., Ваттам, Т.А., Холмс С. и др. (1999). Орексин А активирует возбуждение клеток голубого пятна и увеличивает возбуждение у крыс. Проц. Нац. акад. науч. США 96, 10911–10916. doi: 10.1073/pnas.96.19.10911

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хэйр, Д., Эйтон, С., Буш, А., и Лей, П. (2013). Хрупкое равновесие: метаболизм железа и заболевания головного мозга. Перед. Стареющие нейроски. 18:34. doi: 10.3389/fnagi.2013.00034

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Хавелунд, Дж.F., Heegaard, NHH, Færgeman, NJK, and Gramsbergen, JB (2017). Исследование биомаркеров при болезни Паркинсона с использованием профилирования метаболитов. Метаболиты 7:E42. doi: 10.3390/metabo7030042

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Henchcliffe, C., Shungu, D.C., Mao, X., Huang, C., Nirenberg, M.J., and Jenkins, B.G. (2008). Многоядерная магнитно-резонансная спектроскопия для оценки in vivo митохондриальной дисфункции при болезни Паркинсона. Энн. Н. Я. акад. науч. 1147, 206–220. doi: 10.1196/annals.1427.037

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Херцог Дж., Фитцек У., Хамель В., Морсновски А., Штайгервальд Ф. и Шрадер Б. (2004). Наиболее эффективный участок стимуляции при субталамической глубокой стимуляции мозга при болезни Паркинсона. Мов. Беспорядок. 19, 1050–1054. doi: 10.1002/mds.20056

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хистед, С.Н., Линденберг М.Л., Мена Э., Туркбей Б., Чойке П.Л. и Курдзил К.А. (2012). Обзор функциональной/анатомической визуализации в онкологии. Нукл. Мед. коммун. 33, 349–361. дои: 10.1097/MNM.0b013e32834ec8a5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Hochfeld, W.E., Lee, S., and Rubinsztein, D.C. (2013). Терапевтическая индукция аутофагии для модуляции прогрессирования нейродегенеративного заболевания. Акта Фармакол. Грех. 34, 600–604. дои: 10.1038/ап.2012.189

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Höllerhage, M., Moebius, C., Melms, J., Chiu, W.H., Goebel, J.N., Chakroun, T., et al. (2017). Защитная эффективность ингибирования фосфодиэстеразы-1 против токсичности альфа-синуклеина, выявленная скринингом соединений в клетках LUHMES. науч. Респ. 7:11469. doi: 10.1038/s41598-017-11664-5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хонг З., Ши М., Чанг К.А., Куинн Дж. Ф., Пескинд Э. Р., Галаско Д. и соавт. (2010). DJ-1 и альфа-синуклеин в спинномозговой жидкости человека как биомаркеры болезни Паркинсона. Мозг 133, 713–726. doi: 10.1093/мозг/awq008

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Якобацци, В., Кастенья, А., Инфантино, В., и Андрия, Г. (2013). Метилирование митохондриальной ДНК как биомаркер нового поколения и диагностический инструмент. Мол. Жене. Метаб. 110, 25–34. дои: 10.1016/j.ymgme.2013.07.012

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ибрагим, Н., Кусмирек, Дж., Струк, А.Ф., Флоберг, Дж.М., Перлман, С.Б., Галлахер, С., и соавт. (2016). Чувствительность и специфичность ПЭТ с Ф-ДОФА в клинике двигательных расстройств. утра. Дж. Нукл. Мед. Мол. Визуализация 6, 102–109.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Имамура К., Хишикава Н., Савада М., Нагацу Т., Ёсида М. и Хасидзуме Ю. (2003).Распределение основного комплекса гистосовместимости класса II-позитивной микроглии и цитокинового профиля мозга с болезнью Паркинсона. Акта Нейропатол. 106, 518–526. doi: 10.1007/s00401-003-0766-2

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ивата А., Миура С., Канадзава И., Савада М. и Нукина Н. (2001). альфа-синуклеин образует комплекс с фактором транскрипции Elk-1. J. Нейрохим. 77, 239–252. doi: 10.1046/j.1471-4159.2001.t01-1-00232.х

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Янкович, Дж., и Агилар, Г. (2008). Современные подходы к лечению болезни Паркинсона. Нейропсихиатр. Дис. Обращаться. 4, 743–757. DOI: 10.2147/NDT.S2006

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Качроо, А., и Шварцшильд, Массачусетс (2012). Нарушение гена рецептора аденозина A2A защищает в модели α-синуклеина болезни Паркинсона. Энн. Нейрол. 71, 278–282.doi: 10.1002/ana.22630

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Karamohamed, S., DeStefano, A.L., Wilk, J.B., Shoemaker, C.M., Golbe, L.I., Mark, M.H., et al. (2003). Гаплотип в локусе PARK3 влияет на возраст начала болезни Паркинсона: исследование GenePD. Неврология 61, 1557–1561. дои: 10.1212/01.WNL.0000095966.99430.F4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Карими-Могадам, А., Чарсуэй, С., Белл, Б., и Джабаламели, М. Р. (2018). Болезнь Паркинсона от менделевских форм до генетической предрасположенности: новое молекулярное понимание процесса нейродегенерации. Сотовый. Мол. Нейробиол. 38, 1153–1178. doi: 10.1007/s10571-018-0587-4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кикути А., Такэда А., Онодера Х., Кимпара Т., Хисанага К., Сато Н. и др. (2002). Системное увеличение окислительного повреждения нуклеиновых кислот при болезни Паркинсона и множественной системной атрофии. Нейробиол. Дис. 9, 244–248. doi: 10.1006/nbdi.2002.0466

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кикути Ю., Ясухара Т., Агари Т., Кондо А., Курамото С., Камеда М. и др. (2011). Повышение уровня 8-OHdG в моче у крыс с частичным поражением модели болезни Паркинсона коррелирует с поведенческими симптомами и нигростриарным дофаминергическим истощением. Дж. Сотовый. Физиол. 226, 1390–1398. doi: 10.1002/jcp.22467

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Китада, Т., Асакава С., Хаттори Н., Мацумине Х., Ямамура Ю., Миношима С. и др. (1988). Мутации в гене паркина вызывают аутосомно-рецессивный ювенильный паркинсонизм. Природа 392, 605–608. дои: 10.1038/33416

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Короглу, К., Байсал, Л., Четинкая, М., Карасой, Х., и Толун, А. (2013). DNAJC6 отвечает за ювенильный паркинсонизм с фенотипической изменчивостью. Относительный паркинсонизм. Беспорядок. 19, 320–324.doi: 10.1016/j.parkreldis.2012.11.006

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кребс, К.Е., Кархейран, С., Пауэлл, Дж.К., Цао, М., Макаров, В., Дарвиш, Х., и соавт. (2013). Домен Sac1 SYNJ1 идентифицирован как мутировавший в семье с ранним прогрессирующим паркинсонизмом с генерализованными припадками. Гул. Мутат. 34, 12:00–12:07. doi: 10.1002/humu.22372

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лэнгстон, Дж.В. (1996). Этиология болезни Паркинсона с акцентом на историю MPTP. Неврология 47, 153–160. doi: 10.1212/WNL.47.6_Suppl_3.153S

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Лотье, К., Голдворм, С., Дурр, А., Джованноне, Б., Циарас, В. Г., и Пеццоли, Г. (2008). Мутации в гене GIGYF2 (TNRC15) в локусе PARK11 при семейной болезни Паркинсона. утра. Дж. Хам. Жене. 82, 822–833. doi: 10.1016/j.ajhg.2008.01.015

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лауретани, Ф., Saginario, A., Ceda, G.P., Galuppo, L., Ruffini, L., Nardelli, A., et al. (2014). Лечение моторных и немоторных симптомов при болезни Паркинсона по кластерной симптоматике. Курс. Наркотики 15, 943–947.

    Академия Google

    Le, W., Xu, P., Jankovic, J., Jiang, H., Appel, S.H., Smith, R.G., et al. (2003). Мутации в NR4A2 связаны с семейной болезнью Паркинсона. Нац. Жене. 33, 85–89. дои: 10.1038/ng1066

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ли, Х., Бэк С.М., Хо Д., Сук Дж., Чо Э. и Ли С. (2011). Дофамин способствует образованию и секреции нефибриллярных олигомеров альфа-синуклеина. Экспл. Мол. Мед. 43, 216–222. doi: 10.3858/emm.2011.43.4.026

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лерой Э., Бойер Р., Аубургер Г., Леубе Б., Ульм Г., Мезей Э. и др. (1998). Путь убиквитина при болезни Паркинсона. Природа 395, 451–452. дои: 10.1038/26652

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Левин, Дж., Schmidt, F., Boehm, C., Prix, C., Bötzel, K., Ryazanov, S., et al. (2014). Олигомерный модулятор anle138b ингибирует прогрессирование заболевания у мышей с болезнью Паркинсона даже при начале лечения после начала заболевания. Акта Нейропатол. 127, 779–780. doi: 10.1007/s00401-014-1265-3

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    LeWitt, P.A., Rezai, A.R., Leehey, M.A., Ojemann, S.G., Flaherty, A.W., Escandar, E.N., et al. (2011). Генная терапия AAV2-GAD для прогрессирующей болезни Паркинсона: двойное слепое рандомизированное исследование, контролируемое ложной хирургией. Ланцет Нейрол. 10, 309–319. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70039-4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Li, D.H., Wang, J., Mao, C.J., Hu, W.D., Xiao, L., Yang, Y.P., et al. (2011). Ассоциация полиморфизмов PARK 16 с болезнью Паркинсона в ханьской популяции Сучжоу. Чжунхуа И Сюэ За Чжи 91, 296–300. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70039-4

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Ли, К. Х., Мок, С.S., Laughton, K.M., McLean, C.A., Cappai, R., Masters, C.L., et al. (2007). Альфа-синуклеин плазмы снижен у пациентов с болезнью Паркинсона. Экспл. Нейрол. 204, 583–588. doi: 10.1016/j.expneurol.2006.12.006

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лин, С.-Х., Чен, М.-Л., Чен, Г.С., Тай, С.-Х., и Ву, Р.-М. (2011). Новый вариант Pro143Ala в HTRA2 способствует развитию болезни Паркинсона, индуцируя гиперфосфорилирование белка HTRA2 в митохондриях. Гул. Жене. 130, 817–827. doi: 10.1007/s00439-011-1041-6

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Lin, K.J., Weng, Y.H., Hsieh, C.J., Lin, W.Y., Wey, S.P., Kung, M.P., et al. (2013). Визуализация мозга везикулярного переносчика моноаминов типа 2 у здоровых стареющих субъектов с помощью ПЭТ с 18F-FP-(+)-DTBZ. PLoS One 8:e75952. doi: 10.1371/journal.pone.0075952

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Лин, Л.Ф., Доэрти, Д.Х., Лайл, Дж.Д., Бектеш, С., и Коллинз, Ф. (1993). GDNF: нейротрофический фактор глиальной клеточной линии для дофаминергических нейронов среднего мозга. Наука 260, 1130–1132. doi: 10.1126/science.8493557

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Лодиш, Х., Берк, А., Мацудайра, П., Кайзер, К.А., Кригер, М., Скотт, М.П., ​​и соавт. (2004). в Молекулярно-клеточная биология , 5-е изд., изд. Дж. Дарнелл (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: WH Freeman and CO), 66–72.

    Лук, К.К., Кем В., Кэрролл Дж., Чжан Б., О’Брайен П., Трояновски Дж. К. и соавт. (2012). Патологическая передача α-синуклеина инициирует паркинсоноподобную нейродегенерацию у нетрансгенных мышей. Наука 16, 949–953. doi: 10.1126/science.1227157

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Махами Оскуей М., Хамиди Ф., Талеби М., Фархуди М., Тахерагдам А. А. и Каземи Т. (2016). Корреляция между инфекцией Toxoplasma gondii и болезнью Паркинсона: исследование случай-контроль. Дж. Паразит. Дис. 40, 872–876. doi: 10.1007/s12639-014-0595-3

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Мартинс-Бранко, Д., Эстевес, А. Р., Сантос, Д., Ардуино, Д. М., Свердлоу, Р. Х., и Оливейра, Ч. Р. (2012). Убиквитиновая протеасомная система при болезни Паркинсона: хранитель или свидетель? Экспл. Нейрол. 238, 89–99. doi: 10.1016/j.expneurol.2012.08.008

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Масуда-Сузукаке, М., Нонака Т., Хосокава М., Ойкава Т., Араи Т., Акияма Х. и соавт. (2013). Прионоподобное распространение патологического α-синуклеина в головном мозге. Мозг 136, 1128–1138. дои: 10.1093/мозг/awt037

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Мацумото Л., Такума Х., Тамаока А., Курисаки Х., Дате Х., Цудзи С. и др. (2010). Деметилирование CpG усиливает экспрессию альфа-синуклеина и влияет на патогенез болезни Паркинсона. PLoS One 5:e15522.doi: 10.1371/journal.pone.0015522

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    McKeith, I.G., Boeve, B.F., Dickson, D.W., Halliday, G., Taylor, J.P., Weintraub, D., et al. (2017). Диагностика и лечение деменции с тельцами Леви: четвертый согласованный отчет консорциума DLB. Неврология 89, 88–100. doi: 10.1212/WNL.0000000000004058

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Маклин П.Дж., Кавамата Х., Рибич, С., и Хайман, Б.Т. (2000). Мембранная ассоциация и белковая конформация α-синуклеина в интактных нейронах. Влияние мутаций, связанных с болезнью Паркинсона. Дж. Биол. хим. 275, 8812–8816. doi: 10.1074/jbc.275.12.8812

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Миман, О., Кузбеджи, О.Ю., Актепе, О.К., и Четинкая, З. (2010). Возможная связь между Toxoplasma gondii и болезнью Паркинсона. Неврологи. лат. 475, 129–131.doi: 10.1016/j.neulet.2010.03.057

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Mittermeyer, G., Christine, C.W., Rosenbluth, K.H., Baker, S.L., Starr, P., Larson, P., et al. (2012). Долгосрочная оценка исследования фазы 1 генной терапии AADC для болезни Паркинсона. Гул. Джин Тер. 23, 377–381. doi: 10.1089/hum.2011.220

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Молленхауэр Б., Локасио Дж. Дж., Шульц-Шеффер В., Сиксель-Деринг, Ф., Тренквальдер, К., и Шлоссмахер, М. Г. (2011). Концентрации α-синуклеина и тау в спинномозговой жидкости пациентов с паркинсонизмом: когортное исследование. Ланцет Нейрол. 10, 230–240. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70014-X

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Мурамацу С., Фуджимото К., Като С., Мизуками Х., Асари С., Икегучи К. и др. (2010). Фаза I исследования генной терапии декарбоксилазой ароматических L-аминокислот при болезни Паркинсона. Мол. тер. 18, 1731–1735. doi: 10.1038/mt.2010.135

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Нагаи Ю., Уэно С., Саеки Ю., Сога Ф., Хирано М. и Янагихара Т. (1996). Снижение экспрессии мРНК дофаминового рецептора D3 в лимфоцитах пациентов с болезнью Паркинсона. Неврология 46, 791–795. doi: 10.1212/WNL.46.3.791

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Обесо, Х. А., Родригес-Орос, М.C., Benitez-Temino, B., Blesa, F.J., Guridi, J., Marin, C., et al. (2008). Функциональная организация базальных ганглиев: терапевтические последствия болезни Паркинсона. Мов. Беспорядок. 23, 548–559. doi: 10.1002/mds.22062

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    О, Дж. К., Чой, Э. К., Сонг, И. У., Ким, Дж. С., и Чанг, Ю. А. (2015). Сравнение планарной визуализации I-123 MIBG и ОФЭКТ для выявления сниженного поглощения сердцем при болезни Паркинсона. J. Neural Transm. (Вена) 122, 1421–1427. doi: 10.1007/s00702-015-1409-1

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Olanow, C.W., Kieburtz, K., Odin, P., Espay, A.J., Standaert, D.G., Fernandez, H.H., et al. (2014). Непрерывная интраеюнальная инфузия кишечного геля леводопы-карбидопы у пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона: рандомизированное, контролируемое, двойное слепое исследование с двойным фиктивным методом. Ланцет Нейрол. 13, 141–149. дои: 10.1016/С1474-4422(13)70293-С

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Paisan-Ruiz, C., Bhatia, K.P., Li, A., Hernandez, D., Davis, M., Wood, N.W., et al. (2009). Характеристика PLA2G6 как очага дистонии-паркинсонизма. Энн. Нейрол. 65, 19–23. doi: 10.1002/ana.21415

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Перни, М., Гальваньон, К., Мальцев, А., Мейсл, Г., Мюллер, М.Б., Чалла, П.К., и соавт. (2017). Натуральный продукт ингибирует инициацию агрегации α-синуклеина и подавляет его токсичность. Проц. Натл. акад. науч. США 114, E1009–E1017. doi: 10.1073/pnas.1610586114

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Пиркер, В., Асенбаум, С., Венгер, С., Корнхубер, Дж., Ангелбергер, П., Деке, Л., и соавт. (1997). Йод-123-эпидеприд-ОФЭКТ: исследования болезни Паркинсона, множественной системной атрофии и болезни Гентингтона. J. Nucl. Мед. 38, 1711–1717.

    Реферат PubMed | Академия Google

    Плаха П., Бен-Шломо Ю., Патель, Н.К., и Гилл, С.С. (2006). Стимуляция каудальной зоны incerta превосходит стимуляцию субталамического ядра в улучшении контралатерального паркинсонизма. Мозг 129, 1732–1747. doi: 10.1093/brain/awl127

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Пулкес Т., Чубтум Л., Читфук С., Таккинстиан А., Понгпакди С., Кулкантракорн К. и др. (2014). Мутации глюкоцереброзидазы у тайских пациентов с болезнью Паркинсона. Относительный паркинсонизм.Беспорядок. 20, 986–991. doi: 10.1016/j.parkreldis.2014.06.007

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Рамирес, А., Хаймбах, А., и Грундеманн, Дж. (2006). Наследственный паркинсонизм с деменцией вызывается мутациями в АТФ13А2, кодирующем лизосомальную АТФазу Р-типа 5 типа. Нац. Жене. 38, 1184–1191. дои: 10.1038/ng1884

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Райхе В., Грундманн М. и Хубер Г.(1995). ОФЭКТ дофаминовых (D2) рецепторов с 123I-иодобензамидом (IBZM) в диагностике синдрома Паркинсона. Радиология 35, 838–843.

    Академия Google

    Райхманн, Х., Брандт, М. Д., и Клингельхофер, Л. (2016). Немоторные особенности болезни Паркинсона: достижения патофизиологии и лечения. Курс. мнение Нейрол. 29, 467–473. doi: 10.1097/WCO.0000000000000348

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Райтер, Р.Дж. (1995). Окислительные процессы и механизмы антиоксидантной защиты в стареющем мозге. FASEB J. 9, 526–533. doi: 10.1096/fasebj.9.7.7737461

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Ринне Дж., Руоттинен Х., Бергман Дж., Хаапаранта М., Соннинен П. и Солин О. (1999). Полезность лиганда транспортера дофамина ПЭТ [18F]β-CFT в оценке инвалидности при болезни Паркинсона. Дж. Нейрол. Нейрохирург. Психиатрия 67, 737–741. doi: 10.1136/jnnp.67.6.737

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Саид, У., Компаньоне, Дж., Авив, Р.И., Страфелла, А.П., Блэк, С.Е., Ланг, А.Е., и соавт. (2017). Биомаркеры визуализации при болезни Паркинсона и синдромах Паркинсона: современные и новые концепции. Перевод. Нейродегенер. 6:8. doi: 10.1186/s40035-017-0076-6

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Самии, А., Натт, Дж. Г., и Рэнсом, Б. Р. (2004). Болезнь Паркинсона. Ланцет 363, 1783–1793. doi: 10.1016/S0140-6736(04)16305-8

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Сасаки Т., Амано Т., Хашимото Дж., Ито Ю., Мурамацу К., Кубо А. и др. (2003). [Визуализация ОФЭКТ с использованием [123I] бета-CIT и [123I] IBF при экстрапирамидных заболеваниях]. Нет То Синкей 55, 57–64.

    Академия Google

    Сатакэ В., Накабаяши Ю., Мизута И., Хирота Ю., Ито К. и Кубо М. (2009). Полногеномное ассоциативное исследование выявляет общие варианты в четырех локусах как генетические факторы риска болезни Паркинсона. Нац. Жене. 41, 1303–1307. doi: 10.1038/ng.485

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Скрябин А. (1999). «Открытие и разработка основных лекарственных средств, используемых в настоящее время», в The Pharmaceutical Innovation: Revolutionizing Human Health , ed. А. Скрябин (Филадельфия: Chemical Heritage Press), 222–223.

    Академия Google

    Сеппи, К., Шоке, М.Ф., Эстерхаммер, Р., Кремзер, К., Бреннейс, К., Мюллер, Дж., и другие. (2003). Диффузионно-взвешенная визуализация отличает прогрессирующий надъядерный паралич от БП, но не от паркинсонического варианта множественной системной атрофии. Неврология 60, 922–927. дои: 10.1212/01.WNL.0000049911..9D

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сераджи-Бозоргзад, Н., Бао, Ф., Джордж, Э., Крстевска, С., Горден, В., Хоростецки, Дж., и соавт. (2015). Продольное исследование черной субстанции при болезни Паркинсона: исследование высокопольной спектроскопии 1 H-MR. Мов. Беспорядок. 30, 14:00–14:04. doi: 10.1002/mds.26323

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шадрина М.И., Сломинский П.А. и Лимборска С.А. (2010). Глава 6. Молекулярные механизмы патогенеза болезни Паркинсона. Междунар. Рев. ячейка Мол. биол. 281, 229–266. дои: 10.1016/S1937-6448(10)81006-8

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Ши, С.-х., Тан, Б.-с., Ван, Л., Лв, З.-ю., Ван, Дж., Луо, Л.-з., и др. (2011). Мутация гена PLA2G6 при аутосомно-рецессивном паркинсонизме с ранним началом в когорте китайцев. Неврология 77, 75–81. дои: 10.1212/WNL.0b013e318221acd3

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шигенага, М., Гимено, С.Дж., и Эймс, Б.Н. (1989). Мочевой 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин как биомаркер окислительного повреждения ДНК in vivo. Проц. Натл. акад. науч. США 86, 9697–9701. doi: 10.1073/pnas.86.24.9697

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Сидеровф, А., Орсланд, Д., Молленхауэр, Б., Голдман, Дж. Г., и Равина, Б. (2018). Биомаркеры когнитивных нарушений при расстройствах с тельцами Леви: статус и актуальность для клинических испытаний. Мов. Беспорядок. 33, 528–536. doi: 10.1002/mds.27355

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Саймон, Д.К., Симуни, Т., Элм, Дж., Кларк-Матотт, Дж., Гребнер, А.К., и Бейкер, Л. (2015). Периферические биомаркеры прогрессирования болезни Паркинсона и эффекты пиоглитазона. Дж.Паркинсон Дис. 4, 731–736. doi: 10.3233/JPD-150666

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Синглтон, А.Б., Фаррер, М., Джонсон, Дж., Синглтон, А., Хейг, С., Качергус, Дж., и др. (2003). Трипликация локуса а-синуклеина вызывает болезнь Паркинсона. Наука 302:841. doi: 10.1126/science.10

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сколоудик Д., Елинкова М., Блахута Й., Чермак П., Соукуп Т., Бартова П. и др. (2014). Транскраниальная сонография черной субстанции: анализ цифрового изображения. АДЖНР Ам. Дж. Нейрорадиол. 35, 2273–2278. doi: 10.3174/ajnr.A4049

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Штайнер, Дж. А., Куанса, Э., и Брундин, П. (2018). Концепция альфа-синуклеина как прионоподобного белка: десять лет спустя. Рез. клеточной ткани. 373, 161–173. doi: 10.1007/s00441-018-2814-1

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Штраус, К.М., Мартинс Л.М., Плун-Фавро Х., Маркс Ф.П., Каутцманн С., Берг Д. и др. (2005). Мутации потери функции в гене, кодирующем Omi/HtrA2, при болезни Паркинсона. Гул. Мол. Жене. 14, 2099–2111. doi: 10.1093/hmg/ddi215

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Sui, Y.T., Bullock, K.M., Erickson, M.A., Zhang, J., and Banks, W.A. (2014). Альфа-синуклеин транспортируется в головной мозг и из него через гематоэнцефалический барьер. Пептиды 62, 197–202.doi: 10.1016/j.peptides.2014.09.018

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сургучева И. и Сургучев А. (2008). Гамма-синуклеин: специфичная для клеточного типа промоторная активность и связывание с факторами транскрипции. Дж. Мол. Неврологи. 35, 267–271. doi: 10.1007/s12031-008-9074-6

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сургучев А., Сургучева И., Шарма М., Шарма Р. и Сингх В. (2017). Порообразующие белки как медиаторы нового эпигенетического механизма эпилепсии. Перед. Нейрол. 8:3. doi: 10.3389/fneur.2017.00003

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Swanson, C.R., Berlyand, Y., Xie, S.X., Alcalay, R.N., Chahine, L.M., and Chen-Plotkin, A.S. (2015). Плазменный аполипопротеин А1 связан с возрастом в начале болезни и моторной тяжестью у пациентов с ранней болезнью Паркинсона. Мов. Беспорядок. 30, 1648–1656. doi: 10.1002/mds.26290

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Такахаши Ю., Канбаяши Т., Хошикава М., Иманиши А., Сагава Ю., Цуцуи К. и др. (2015). Взаимосвязь орексиновой (гипокретиновой) системы и активации астроцитов при болезни Паркинсона с гиперсонливостью. Сон Биол. Ритмы 13, 252–260. doi: 10.1111/sbr.12112

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Тан, Э.-К., Лин, С.-Х., Тай, С.-Х., Тан, Л.С., Чен, М.-Л., и Ли, Р. (2009). Несинонимичные варианты GIGYF2 при болезни Паркинсона в двух азиатских популяциях. Гул.Жене. 126, 425–430. doi: 10.1007/s00439-009-0678-x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Телль-Марти, Г., Пуч-Бутилле, Дж. А., Потрони, М., Баденас, К., Мила, М., и Малвехи, Дж. (2015). Вариант риска меланомы MC1R p.R160W связан с болезнью Паркинсона. Энн. Нейрол. 77, 889–894. doi: 10.1002/ana.24373

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тонг, Дж., Уилсон, А. А., Буало, И., Хоул, С., и Киш, С.Дж. (2008). Препараты, модулирующие дофамин, влияют на связывание (+)-[11C]DTBZ в полосатом теле у крыс: связывание VMAT2 чувствительно к изменениям концентрации везикулярного дофамина. Синапс 62, 873–876. doi: 10.1002/син.20573

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Валенте Э.М., Абу-Слейман П.М., Капуто В., Мукит М.М., Харви К., Гисперт С. и др. (2004). Наследственная болезнь Паркинсона с ранним началом, вызванная мутациями PINK1. Наука 304, 1158–1160. doi: 10.1126/science.1096284

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    ван дер Зее, С., Вермейрен, Ю., Франсен, Э., Ван Дам, Д., Аэртс, Т., Герритсен, М.Дж., и соавт. (2018). Моноаминергические маркеры когнитивного спектра болезни телец Леви. Дж. Паркинсон Дис. 8, 71–84. doi: 10.3233/JPD-171228

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    ван Дуйн, К. М., Деккер, М.C., Bonifati, V., Galjaard, R.J., Houwing-Duistermaat, J.J., Snijders, P.J., et al. (2001). Park7, новый локус аутосомно-рецессивного паркинсонизма с ранним началом, на хромосоме 1p36. утра. Дж. Хам. Жене. 69, 629–634. дои: 10.1086/322996

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Venda, L.L., Cragg, S.J., Buchman, V.L., and Wade-Martins, R. (2010). α-синуклеин и дофамин на перекрестке болезни Паркинсона. Trends Neurosci. 33, 559–568.doi: 10.1016/j.tins.2010.09.004

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Вермейрен, Ю., и Де Дейн, П. П. (2017). Ориентация на норадреналиновую систему при болезни Паркинсона и связанных с ней расстройствах: история голубого пятна. Нейрохим. Междунар. 102, 22–32. doi: 10.1016/j.neuint.2016.11.009

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Вилариньо-Гуэль, К., Раджпут, А., Милнервуд, А.Дж., Шах, Б., Шу-Ту, К., Trinh, J., et al. (2014). Мутации DNAJC13 при болезни Паркинсона. Гул. Мол. Жене. 23, 1794–1801. doi: 10.1093/hmg/ddt570

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Вилариньо-Гуэль, К., Уайдер, К., Росс, О.А., Даксель, Дж.К., Качергус, Дж.М., и Линкольн, С.Дж. (2011). Мутации VPS35 при болезни Паркинсона. утра. Дж. Хам. Жене. 89, 162–167. doi: 10.1016/j.ajhg.2011.06.001

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Виталий М.C.T., Barreto-Sanz, M.A., Correia, B.R.S., Bell, R., Widnall, C., Perez, L.T., et al. (2018). Сигнатуры на основе миРНК в спинномозговой жидкости как потенциальные диагностические инструменты для ранней стадии болезни Паркинсона. Онкотаргет 9, 17455–17465. doi: 10.18632/oncotarget.24736

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ван, Э. С., Сунь, Ю., Го, Дж. Г., Гао, X., Ху, Дж. В., Чжоу, Л., и др. (2010). Тетранектин и аполипопротеин А-I в спинномозговой жидкости как потенциальные биомаркеры болезни Паркинсона. Акта Нейрол. Сканд. 122, 350–359. doi: 10.1111/j.1600-0404.2009.01318.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ватанабе М., Маэмура К., Канбара К., Тамаяма Т. и Хаясаки Х. (2002). ГАМК и ГАМК-рецепторы в центральной нервной системе и других органах. Междунар. Преподобный Цитол. 213, 1–47. doi: 10.1016/S0074-7696(02)13011-7

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Винеке М., Верт Э., Порязова Р., Baumann-Vogel, H., Bassetti, C.L., Weller, M., et al. (2012). Прогрессирующий дефицит дофамина и гипокретина при болезни Паркинсона: влияет ли это на сон и бодрствование? Дж. Сон Res. 21, 710–717. doi: 10.1111/j.1365-2869.2012.01027.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Wu, Y.R., Lin, H.Y., Chen, C.M., Gwinn-Hardy, K., Ro, L.S., Wang, Y.C., et al. (2004). Генетическое тестирование спиноцеребеллярной атаксии на Тайване: экспансии тринуклеотидных повторов в SCA8 и SCA17 связаны с типичной болезнью Паркинсона. клин. Жене. 65, 209–214. doi: 10.1111/j.0009-9163.2004.00213.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сюй Л., Ма Б., Нусинов Р. и Томпсон Д. (2017). Семейные мутации могут переключать конформационные предпочтения в фибриллах α-синуклеина. ACS Хим. Неврологи. 8, 837–849. doi: 10.1021/acschemneuro.6b00406

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ян, З., Ван, X., Ян, Дж., Сунь, М., Ван, Ю.и Ван, X. (2017). Аберрантное метилирование CpG опосредует аномальную транскрипцию МАО-А. Нейротокс. Рез. 31, 334–347. doi: 10.1007/s12640-016-9686-5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Yonekura, Y., Saji, H., Iwasaki, Y., Tsuchida, T., Fukuyama, H., Shimatsu, A., et al. (1995). Начальный клинический опыт визуализации дофаминовых рецепторов D2 с помощью 2’-йодспиперона и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. Энн. Нукл. Мед. 9, 131–136. дои: 10.1007/BF03165039

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Yu, S., Li, X., Liu, G., Han, J., Zhang, C., Li, Y., et al. (2007). Обширная ядерная локализация α-синуклеина в нормальных нейронах головного мозга крыс, обнаруженная с помощью нового моноклонального антитела. Неврология 145, 539–555. doi: 10.1016/j.neuroscience.2006.12.028

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Цзэн, С. С., Гэн, В. С., Цзя, Дж.Дж., Чен Л. и Чжан П.П. (2018). Клеточные и молекулярные основы нейродегенерации при болезни Паркинсона. Перед. Стареющие нейроски. 10:109. doi: 10.3389/fnagi.2018.00109

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Зимприх А., Бискуп С., Лейтнер П., Лихтнер П., Фаррер М., Линкольн С. и др. (2004). Мутации в LRRK2 вызывают аутосомно-доминантный паркинсонизм с плеоморфной патологией. Нейрон 44, 601–607. doi: 10.1016/j.neuron.2004.11.005

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Зукка, Ф.А., Бассо Э., Купайоли Ф.А., Феррари Э., Зульцер Д.